兔感觉神经植入失神经皮瓣后再生末梢支配面积的动态变化研究
杨帆 陈绍宗 李跃军
摘 要 目的： 研究神经植入术后再生末梢支配面积的变化规律. 方法： 兔耳大神经植入颈肩部失神经皮瓣模型，利用神经单纤维放电引导、神经原性血浆外渗和抗NF抗体免疫组化技术，对3 cm直径失神经皮瓣在植入1.5 cm长耳大神经后不同时间对皮瓣获得神经再支配的面积进行测量. 结果： 术后1 mo再生末梢支配皮瓣面积的16%，3 mo 52%， 5 mo 74%，8 mo 95%. 三种实验方法结果相符. 结论： 神经植入术后再生末稍支配面积逐步扩大，3 cm直径皮瓣植入1.5 cm长外径为1 mm的神经，术后8 mo可获得充分的神经再支配.
关键词：神经移植 失神经皮瓣 神经再生 神经原性血浆外渗
0 引言
近年来，人们对以感觉神经植入失神经皮瓣重建失神经皮肤感觉功能的方法已进行了较深入的研究[1～3]. 但是，植入的神经能支配多大面积的皮肤，尚缺少实验依据. 本实验采用神经原性血浆外渗技术与电生理及免疫组化相结合的方法，观察神经植入失神经皮瓣后随时间延长感觉神经支配范围的变化规律.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 动物 2.0 kg～2.5 kg新西兰兔30只，雌雄不拘. 设1, 3, 5及8 mo 4个神经植入组、未植神经组和正常皮肤对照组，每组5只. 25 g/L戊巴比妥钠(30 mL/kg)耳缘静脉麻醉下，全层切除左耳背中央3 cm直径圆形皮肤，其中，植入神经的动物游离出耳大神经，在远侧创缘将其切断. 去除创面内所有皮下组织及耳软骨膜. 在颈肩部形成3.5 cm×4.5 cm带蒂皮瓣，转移到耳部创面. 作皮瓣中央肉膜切口，由此向皮瓣近端形成真皮与肉膜间隧道，引入保留的耳大神经1.5 cm，神经末端用9/0线固定于皮瓣中央. 未植神经组将耳背创面内耳大神经切除，不作神经植入. 2 wk后皮瓣断蒂. 正常皮肤对照组不进行手术，为正常兔耳.
1.2 神经电生理检查(神经单纤维放电引导法) 动物观察到期后，用α-氯醛糖和氨基甲酸乙酯混合麻药耳缘静脉麻醉(5 mL/kg). 在皮瓣近端耳背皮肤形成皮兜，解剖出耳大神经干，浸以37℃液体石蜡. 放大镜下夹取神经单纤维，悬挂于引导电极上并施加不同刺激，记录放电波形、放电数和感受野.
, 百拇医药
神经纤维类型的判断标准： 用触毛计触压皮肤引起快适应性短阵单相波放电，而对温热刺激无反应者，为触觉纤维；持续触压刺激产生持续慢适应放电者，为压觉纤维；0.4 g以上机械刺激和高于55℃热刺激引起持续双相波放电者，为痛觉纤维；室温条件下(20～25℃)有自发双相波放电，对冷(15℃)或热(20～45℃)刺激有放电增加者，为冷或温觉纤维.
1.3 神经原性血浆外渗实验 将刺激电极置于耳大神经干，颈总动脉内注入50 g/L依凡氏蓝(1 mL/kg), 10 min后开始方波刺激(电压40 V， 波宽1 ms， 频率10 Hz)，持续20 min. 用图像分析仪计算染色区面积.
1.4 免疫组织化学实验 上述实验完成后，切取皮瓣全层标本，40 g/L多聚甲醛固定，对皮瓣内边缘区和中心区标本作50 μm冰冻切片，编号收集于0.01 mol/L PBS中，用抗神经丝单克隆抗体按ABC法染色.
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 神经电生理检查 正常耳背皮肤放电纤维数平均为48.1根. 神经植入各组放电纤维数随时间延伸而增加，与时间呈正相关(r=0.9946)，1 mo组低于正常，为22.8根；3 mo组60.8根；5 mo与7 mo组则分别为101.7根和141.2根；而未植神经组术后8 mo放电纤维数平均仅为14.1根.
传导触、痛、压、温冷觉的纤维在各组中均有再生，与未植入神经的皮瓣和耳背正常皮肤相比，植入神经的皮瓣触、痛觉纤维数均显著多于后两者，且随时间延长而越发明显，温冷觉纤维数量也多于未植入神经组(Tab 1). 但各类感觉纤维的比率与正常皮肤大致相仿(Tab 2).
表1 各类感觉刺激诱发的放电纤维数
Tab 1 Number of discharge fiber evoked by sensory stimulus
, 百拇医药
(n=5, X±s)
Type
1 mo
3 mo
5 mo
8 mo
Normal skin
Non-implantation
Palpation
18.1±4.2b
51.1±14.77c
, 百拇医药 87.7±16.66b
122.7±19.96b
42.7±4.26
12.4±3.66
Pain
4.1±2.11c
6.1± 2.09ad
10.9± 1.39bd
11.6± 3.62bd
2.2±1.47
, 百拇医药
0.8±1.00
Pressure
0.4±0.48a
2.8± 1.88c
1.8± 1.13
2.5± 1.79
2.2±1.31
0.6±0.66
Temprature
0.2±0.42
0.8± 0.77
, 百拇医药
1.3± 0.91c
4.4± 2.37ad
1.0±0.74
0.3±0.42
1 mo～8 mo to nerve implantation group.
aP<0.05, bP<0.01 vs normal skin group (t-test); cP<0.05, dP<0.01 vs non-implantation group (t-test).表2 各类感觉刺激诱发的放电纤维百分比
Tab 2 Percentage of discharge fiber
, http://www.100md.com
(n=5, X±s)
Type
1 mo
3 mo
5 mo
8 mo
Normal skin
Palpation
79.39±3.22b
84.05±2.37a
86.23±1.44
, 百拇医药 86.90±1.35
88.77±1.96
Pain
17.98±3.17b
10.03±2.01b
10.72±1.68b
8.22±1.29b
4.57±1.39
Pressure
1.75±1.33a
, http://www.100md.com 4.60±1.81
1.77±0.59a
1.77±0.72a
4.57±1.39
Temprature
0.88±0.84a
1.32±0.79
1.28±0.52
3.11±1.31
2.09±0.63
1 mo～8 mo to nerve implantation group.
, 百拇医药
aP<0.05, bP<0.01 vs normal skin group (t-test).
2.2 神经原性血浆外渗实验 未植神经组皮瓣无染色. 植入神经的皮瓣染色区最初出现在神经植入区,染色范围随时间延长而扩大，与电生理实验相符(Tab 3).
表3 皮瓣染色区面积和占皮瓣总面积的百分数
Tab 3 Flap dyed area and percentage of flap dyed in total area
(X±s, mm2)
Time
Flap dyed area
, http://www.100md.com
Flap dyed area
in total area
1 mo
103.48± 5.17
16.83±0.84
3 mo
312.30± 4.89
50.72±0.79
5 mo
459.02± 8.35
74.55±1.35
, http://www.100md.com 8 mo
585.48±10.59
95.02±1.72
Non-implantation
0
P<0.01 t-test between groups. 2.3 免疫组化实验 术后1 mo，植入神经的皮瓣真皮层内已有末梢再生. 术后8 mo，皮瓣边缘区均有再生末梢出现，但密度始终以植入区为最高. 而未植神经的皮瓣术后8 mo，仅在邻近耳大神经近断端在皮瓣的瘢痕处看到少许细小末梢，其它区域未见阳性染色纤维. 以上结果印证了电生理和血浆外渗实验结果，显示了充分的一致性.
3 讨论
本实验用神经电生理法检查兔失神经皮瓣植入神经后再生纤维的放电区域，用神经原性血浆外渗技术对显示神经再生的染色区直观测量，用抗FN抗体免疫组化技术对取自神经纤维放电处的标本进行形态学观察印证. 实验证明：(1)电生理和免疫组化结果与以前本室所报告的结果完全一致，显示该检测方法的高度可重复性；(2)三种观测方法结果充分相符；(3)通过计算机图像分析比较，客观地测量了再生纤维的支配面积；(4)不但能检测再生纤维的支配范围，还能检测是何种类型的感觉纤维，并计算出它们的数量、比率、再生过程和发育程度.
, 百拇医药
本实验中所用的皮瓣直径3.0 cm，圆形，面积约700 mm2，术后有些收缩. 同时对20条耳大神经的外径进行测量，结果是前后径为0.73 mm，左右径为1.28 mm. 神经植入到皮瓣中央，即植入长度1.5 cm. 在这样的条件下，术后8 mo皮瓣可完全获得神经再支配. 由于最长时间观察组(8 mo)与前一时间组(5 mo)相距3 mo之久，分析达到这样程度再支配的时间可能会更早些，为临床应用提供了实验依据. 根据以往临床和实验研究，植入1条神经虽支配范围有限，但可以通过增加移植的神经数、增加神经长度、移植带分支的神经和将神经迂回曲折植入的方法，以增大神经分布的面积，增加轴突发芽机会，有助于再支配范围的扩大. 此外，也可把神经植入在皮瓣的中央，而边缘靠邻近皮神经长入(侧支神经再支配)，术后给予神经营养药和感觉功能训练的方法，促进感觉恢复，而且随时间延长会进一步扩大再支配的范围和效果，已为临床工作所证实[1].
神经原性血浆外渗法用于研究皮肤中神经纤维的支配范围由Brenan[4](1986)首先报告. 其原理是皮肤中与伤害感受器相连的无髓传入纤维被激活后立即在其全部外周末梢支配范围内引起血管通透性增加，导致血浆外渗. 这些纤维可被对皮肤的高热、强机械刺激及刺激性化学药品或逆向神经电刺激所击活而引起血浆外渗. 而一些活性染料(如Evans Blue, vital new red等)能迅速与血管中血浆蛋白结合，随血浆蛋白外渗，方便快捷地显示血浆外渗的范围. 但这种技术只能确定特定神经的伤害性感受器的分布范围(C类纤维)，其它C类纤维兴奋后并不能发生外渗. Brenan通过研究大鼠坐骨神经挤压或切割伤后隐神经支配的范围，证实了血浆外渗染色区与该神经的支配区相一致，正常神经与损伤后再生的神经均如此. 随后的许多实验也证实了这一点.
, 百拇医药
皮肤的神经支配由交感纤维和感觉纤维所组成. 交感纤维主要是含肾上腺素能神经肽Y (NPY)的纤维和含胆碱能血管活性肠多肽/降钙素相关基因肽(VIP/CGRP)的纤维，而感觉神经只是肽能纤维(Dalsgaard, 1989)[5]. 皮肤中有多种肽能纤维，需用多种特异性抗体来定位检出. 如NF抗体虽能专门标记人皮肤中感觉纤维(李跃军等以及本实验证明，也能标记兔耳大神经中的感觉纤维)，但不能标记所有的感觉纤维. 同理，神经原性血浆外渗法观察到的染色区域，也只是多形觉伤害性感受器的输入纤维分布区域. 由于本实验已证明各类感觉末梢均能再生，它们发生放电的时间并无区别，以及电生理、血浆外渗染色和免疫组化实验结果的充分相符性，有理由认为这些染色区同时代表整个再生纤维的分布区.
作者简介：杨 帆， 男， 1969-01-24生， 吉林省辉南县人， 汉族. 1993年7月第四军医大学军医系毕业， 1995年级第四军医大学硕士生， 导师陈绍宗. 电话：(029)3577138
, http://www.100md.com
作者单位：第四军医大学唐都医院整形科，陕西 西安 710038
参考文献
1 陈绍宗，吴学军，姜树军et al. 神经植入重建皮瓣感觉的实验研究和临床应用. 中华整形烧伤外科杂志, 1991;7(3):164-167
2 李跃军，陈绍宗，李荟元et al. 感觉神经植入失神经皮瓣后再生末梢的动态观察. 中国临床解剖学杂志， 1993;11(2):134-136
3 李学拥，李荟元，陈绍宗. 感觉神经植入失神经皮瓣的神经再支配的电镜观察. 中华医学杂志， 1994;74(10):624-625
4 Brenan A. Collateral reinnervation of skin by C-fibers following nerve injury in the rat. Brain Res， 1986;385:152-155
5 Dalsgaard CJ. Cutaneous innervation in man visualized with protein gene product 9.5 (PGP9.5) antibodies. Histochemistry， 1989; 92:385-389, 百拇医药
摘 要 目的： 研究神经植入术后再生末梢支配面积的变化规律. 方法： 兔耳大神经植入颈肩部失神经皮瓣模型，利用神经单纤维放电引导、神经原性血浆外渗和抗NF抗体免疫组化技术，对3 cm直径失神经皮瓣在植入1.5 cm长耳大神经后不同时间对皮瓣获得神经再支配的面积进行测量. 结果： 术后1 mo再生末梢支配皮瓣面积的16%，3 mo 52%， 5 mo 74%，8 mo 95%. 三种实验方法结果相符. 结论： 神经植入术后再生末稍支配面积逐步扩大，3 cm直径皮瓣植入1.5 cm长外径为1 mm的神经，术后8 mo可获得充分的神经再支配.
关键词：神经移植 失神经皮瓣 神经再生 神经原性血浆外渗
0 引言
近年来，人们对以感觉神经植入失神经皮瓣重建失神经皮肤感觉功能的方法已进行了较深入的研究[1～3]. 但是，植入的神经能支配多大面积的皮肤，尚缺少实验依据. 本实验采用神经原性血浆外渗技术与电生理及免疫组化相结合的方法，观察神经植入失神经皮瓣后随时间延长感觉神经支配范围的变化规律.
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1 材料和方法
1.1 动物 2.0 kg～2.5 kg新西兰兔30只，雌雄不拘. 设1, 3, 5及8 mo 4个神经植入组、未植神经组和正常皮肤对照组，每组5只. 25 g/L戊巴比妥钠(30 mL/kg)耳缘静脉麻醉下，全层切除左耳背中央3 cm直径圆形皮肤，其中，植入神经的动物游离出耳大神经，在远侧创缘将其切断. 去除创面内所有皮下组织及耳软骨膜. 在颈肩部形成3.5 cm×4.5 cm带蒂皮瓣，转移到耳部创面. 作皮瓣中央肉膜切口，由此向皮瓣近端形成真皮与肉膜间隧道，引入保留的耳大神经1.5 cm，神经末端用9/0线固定于皮瓣中央. 未植神经组将耳背创面内耳大神经切除，不作神经植入. 2 wk后皮瓣断蒂. 正常皮肤对照组不进行手术，为正常兔耳.
1.2 神经电生理检查(神经单纤维放电引导法) 动物观察到期后，用α-氯醛糖和氨基甲酸乙酯混合麻药耳缘静脉麻醉(5 mL/kg). 在皮瓣近端耳背皮肤形成皮兜，解剖出耳大神经干，浸以37℃液体石蜡. 放大镜下夹取神经单纤维，悬挂于引导电极上并施加不同刺激，记录放电波形、放电数和感受野.
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神经纤维类型的判断标准： 用触毛计触压皮肤引起快适应性短阵单相波放电，而对温热刺激无反应者，为触觉纤维；持续触压刺激产生持续慢适应放电者，为压觉纤维；0.4 g以上机械刺激和高于55℃热刺激引起持续双相波放电者，为痛觉纤维；室温条件下(20～25℃)有自发双相波放电，对冷(15℃)或热(20～45℃)刺激有放电增加者，为冷或温觉纤维.
1.3 神经原性血浆外渗实验 将刺激电极置于耳大神经干，颈总动脉内注入50 g/L依凡氏蓝(1 mL/kg), 10 min后开始方波刺激(电压40 V， 波宽1 ms， 频率10 Hz)，持续20 min. 用图像分析仪计算染色区面积.
1.4 免疫组织化学实验 上述实验完成后，切取皮瓣全层标本，40 g/L多聚甲醛固定，对皮瓣内边缘区和中心区标本作50 μm冰冻切片，编号收集于0.01 mol/L PBS中，用抗神经丝单克隆抗体按ABC法染色.
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 神经电生理检查 正常耳背皮肤放电纤维数平均为48.1根. 神经植入各组放电纤维数随时间延伸而增加，与时间呈正相关(r=0.9946)，1 mo组低于正常，为22.8根；3 mo组60.8根；5 mo与7 mo组则分别为101.7根和141.2根；而未植神经组术后8 mo放电纤维数平均仅为14.1根.
传导触、痛、压、温冷觉的纤维在各组中均有再生，与未植入神经的皮瓣和耳背正常皮肤相比，植入神经的皮瓣触、痛觉纤维数均显著多于后两者，且随时间延长而越发明显，温冷觉纤维数量也多于未植入神经组(Tab 1). 但各类感觉纤维的比率与正常皮肤大致相仿(Tab 2).
表1 各类感觉刺激诱发的放电纤维数
Tab 1 Number of discharge fiber evoked by sensory stimulus
, 百拇医药
(n=5, X±s)
Type
1 mo
3 mo
5 mo
8 mo
Normal skin
Non-implantation
Palpation
18.1±4.2b
51.1±14.77c
, 百拇医药 87.7±16.66b
122.7±19.96b
42.7±4.26
12.4±3.66
Pain
4.1±2.11c
6.1± 2.09ad
10.9± 1.39bd
11.6± 3.62bd
2.2±1.47
, 百拇医药
0.8±1.00
Pressure
0.4±0.48a
2.8± 1.88c
1.8± 1.13
2.5± 1.79
2.2±1.31
0.6±0.66
Temprature
0.2±0.42
0.8± 0.77
, 百拇医药
1.3± 0.91c
4.4± 2.37ad
1.0±0.74
0.3±0.42
1 mo～8 mo to nerve implantation group.
aP<0.05, bP<0.01 vs normal skin group (t-test); cP<0.05, dP<0.01 vs non-implantation group (t-test).表2 各类感觉刺激诱发的放电纤维百分比
Tab 2 Percentage of discharge fiber
, http://www.100md.com
(n=5, X±s)
Type
1 mo
3 mo
5 mo
8 mo
Normal skin
Palpation
79.39±3.22b
84.05±2.37a
86.23±1.44
, 百拇医药 86.90±1.35
88.77±1.96
Pain
17.98±3.17b
10.03±2.01b
10.72±1.68b
8.22±1.29b
4.57±1.39
Pressure
1.75±1.33a
, http://www.100md.com 4.60±1.81
1.77±0.59a
1.77±0.72a
4.57±1.39
Temprature
0.88±0.84a
1.32±0.79
1.28±0.52
3.11±1.31
2.09±0.63
1 mo～8 mo to nerve implantation group.
, 百拇医药
aP<0.05, bP<0.01 vs normal skin group (t-test).
2.2 神经原性血浆外渗实验 未植神经组皮瓣无染色. 植入神经的皮瓣染色区最初出现在神经植入区,染色范围随时间延长而扩大，与电生理实验相符(Tab 3).
表3 皮瓣染色区面积和占皮瓣总面积的百分数
Tab 3 Flap dyed area and percentage of flap dyed in total area
(X±s, mm2)
Time
Flap dyed area
, http://www.100md.com
Flap dyed area
in total area
1 mo
103.48± 5.17
16.83±0.84
3 mo
312.30± 4.89
50.72±0.79
5 mo
459.02± 8.35
74.55±1.35
, http://www.100md.com 8 mo
585.48±10.59
95.02±1.72
Non-implantation
0
P<0.01 t-test between groups. 2.3 免疫组化实验 术后1 mo，植入神经的皮瓣真皮层内已有末梢再生. 术后8 mo，皮瓣边缘区均有再生末梢出现，但密度始终以植入区为最高. 而未植神经的皮瓣术后8 mo，仅在邻近耳大神经近断端在皮瓣的瘢痕处看到少许细小末梢，其它区域未见阳性染色纤维. 以上结果印证了电生理和血浆外渗实验结果，显示了充分的一致性.
3 讨论
本实验用神经电生理法检查兔失神经皮瓣植入神经后再生纤维的放电区域，用神经原性血浆外渗技术对显示神经再生的染色区直观测量，用抗FN抗体免疫组化技术对取自神经纤维放电处的标本进行形态学观察印证. 实验证明：(1)电生理和免疫组化结果与以前本室所报告的结果完全一致，显示该检测方法的高度可重复性；(2)三种观测方法结果充分相符；(3)通过计算机图像分析比较，客观地测量了再生纤维的支配面积；(4)不但能检测再生纤维的支配范围，还能检测是何种类型的感觉纤维，并计算出它们的数量、比率、再生过程和发育程度.
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本实验中所用的皮瓣直径3.0 cm，圆形，面积约700 mm2，术后有些收缩. 同时对20条耳大神经的外径进行测量，结果是前后径为0.73 mm，左右径为1.28 mm. 神经植入到皮瓣中央，即植入长度1.5 cm. 在这样的条件下，术后8 mo皮瓣可完全获得神经再支配. 由于最长时间观察组(8 mo)与前一时间组(5 mo)相距3 mo之久，分析达到这样程度再支配的时间可能会更早些，为临床应用提供了实验依据. 根据以往临床和实验研究，植入1条神经虽支配范围有限，但可以通过增加移植的神经数、增加神经长度、移植带分支的神经和将神经迂回曲折植入的方法，以增大神经分布的面积，增加轴突发芽机会，有助于再支配范围的扩大. 此外，也可把神经植入在皮瓣的中央，而边缘靠邻近皮神经长入(侧支神经再支配)，术后给予神经营养药和感觉功能训练的方法，促进感觉恢复，而且随时间延长会进一步扩大再支配的范围和效果，已为临床工作所证实[1].
神经原性血浆外渗法用于研究皮肤中神经纤维的支配范围由Brenan[4](1986)首先报告. 其原理是皮肤中与伤害感受器相连的无髓传入纤维被激活后立即在其全部外周末梢支配范围内引起血管通透性增加，导致血浆外渗. 这些纤维可被对皮肤的高热、强机械刺激及刺激性化学药品或逆向神经电刺激所击活而引起血浆外渗. 而一些活性染料(如Evans Blue, vital new red等)能迅速与血管中血浆蛋白结合，随血浆蛋白外渗，方便快捷地显示血浆外渗的范围. 但这种技术只能确定特定神经的伤害性感受器的分布范围(C类纤维)，其它C类纤维兴奋后并不能发生外渗. Brenan通过研究大鼠坐骨神经挤压或切割伤后隐神经支配的范围，证实了血浆外渗染色区与该神经的支配区相一致，正常神经与损伤后再生的神经均如此. 随后的许多实验也证实了这一点.
, 百拇医药
皮肤的神经支配由交感纤维和感觉纤维所组成. 交感纤维主要是含肾上腺素能神经肽Y (NPY)的纤维和含胆碱能血管活性肠多肽/降钙素相关基因肽(VIP/CGRP)的纤维，而感觉神经只是肽能纤维(Dalsgaard, 1989)[5]. 皮肤中有多种肽能纤维，需用多种特异性抗体来定位检出. 如NF抗体虽能专门标记人皮肤中感觉纤维(李跃军等以及本实验证明，也能标记兔耳大神经中的感觉纤维)，但不能标记所有的感觉纤维. 同理，神经原性血浆外渗法观察到的染色区域，也只是多形觉伤害性感受器的输入纤维分布区域. 由于本实验已证明各类感觉末梢均能再生，它们发生放电的时间并无区别，以及电生理、血浆外渗染色和免疫组化实验结果的充分相符性，有理由认为这些染色区同时代表整个再生纤维的分布区.
作者简介：杨 帆， 男， 1969-01-24生， 吉林省辉南县人， 汉族. 1993年7月第四军医大学军医系毕业， 1995年级第四军医大学硕士生， 导师陈绍宗. 电话：(029)3577138
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作者单位：第四军医大学唐都医院整形科，陕西 西安 710038
参考文献
1 陈绍宗，吴学军，姜树军et al. 神经植入重建皮瓣感觉的实验研究和临床应用. 中华整形烧伤外科杂志, 1991;7(3):164-167
2 李跃军，陈绍宗，李荟元et al. 感觉神经植入失神经皮瓣后再生末梢的动态观察. 中国临床解剖学杂志， 1993;11(2):134-136
3 李学拥，李荟元，陈绍宗. 感觉神经植入失神经皮瓣的神经再支配的电镜观察. 中华医学杂志， 1994;74(10):624-625
4 Brenan A. Collateral reinnervation of skin by C-fibers following nerve injury in the rat. Brain Res， 1986;385:152-155
5 Dalsgaard CJ. Cutaneous innervation in man visualized with protein gene product 9.5 (PGP9.5) antibodies. Histochemistry， 1989; 92:385-389, 百拇医药