蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布
董巨莹 曹云新 张晓光 王文学 药立波 苏成芝
摘 要 目的： 探讨3-(α-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(SPDP)修饰的蓖麻毒素抗肝癌活性及其机制. 方法： 用流式细胞仪分析蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布变化. 结果： 修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布比未修饰的蓖麻毒素明显增多. 结论： SPDP修饰后的蓖麻毒素对肝癌细胞的亲和力增加， 提示蓖麻毒素用SPDP修饰可能是改进其抗癌作用的一个有价值的途径.
关键词:蓖麻蛋白 化学修饰 癌，肝细胞 药代动力学 分布
0 引言
蓖麻毒素(ricin)是从植物蓖麻籽中提取的一种有毒糖蛋白，属蛋白合成抑制剂. 抑制真核细胞内蛋白质合成而导致细胞死亡. 自1970年Lin等[1]发现蓖麻毒素具有抗癌作用以来，蓖麻毒素已广泛应用于抗癌免疫毒素研究，但对应用于临床仍存在不少问题. 例如将蓖麻毒素的A链制得免疫毒素虽然消除了蓖麻毒素B链的非特异结合性,但其杀伤癌细胞活性显著降低,又由于A链上甘露糖寡糖的存在,能与体内单核巨噬细胞表面的甘露糖受体以及lgG Fc受体结合,从而被吞噬与清除使其浓度迅速降低,达不到真正的抗癌目的. 而目前将单克隆抗体或基因工程抗体在人体的应用仍待进一步研究. 我们采用化学修饰方法, 将蓖麻毒素用3-(α-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯 (SPDP)进行修饰; 以往的实验结果已证实: SPDP通过其分子中α-吡啶二硫基与蓖麻毒素分子上的氨基结合可使SPDP修饰的蓖麻毒素(ricin-PDP)抗荷人肝癌裸鼠活性增高[2],我们检测了SPDP修饰的蓖麻毒素和蓖麻毒素两者在肝癌细胞和正常肝细胞上的分布差别, 进一步探讨抗癌活性增高的机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 蓖麻毒素及其修饰物为本校毒理学教研室采用改进的Lappi法[3]从蓖麻籽(西安产)中提取. 经SDS-PAGE鉴定为单带，相对分子质量为65 000 ku. 小鼠LD50为52 ng.kg-1. 提取后的蓖麻毒素用异型双功能剂SPDP进行修饰，经测定后修饰率平均为每分子蓖麻毒素结合5.5个SPDP分子. 人肝癌细胞系BEL-7402和正常人肝细胞系QZG均来自中国科学院上海细胞所细胞库. 培养基为含有100 mL/L的胎牛血清的RPMI-1640，在CO2孵箱中生长至指数增长期时，分别加入蓖麻毒素和ricin-PDP，使之终浓度为50 pmol/L. 作用6 h后，移去药液，加入1.25 g/L 胰酶， 2 g/L EDTA消化液处理细胞3 min～5 min, 离心洗涤，计数待用.
1.2 方法 免疫荧光染色： 收集1×106个/L对数生长期的细胞，经蓖麻毒素及其修饰物处理后(阴性对照不经两者处理)， 3组细胞再用0.01 mol.L-1 PBS洗涤细胞2次，用20 mL/L 正常兔血清40℃封闭30 min, 加超量的蓖麻毒素抗B链单抗(50 mg.L-1)(American Type Culture Collection) 40℃反应40 min, 0.01 mol.L-1 PBS离心洗涤，再加入标有异硫氰酸荧光素(FITC)的兔抗鼠第二抗体(购于华美公司)，然后用100 mL/L甲醛液固定，调节终体积为500 μL，待流式细胞仪检测. Elite ESP型流式细胞仪(flow cytometer, FCM)(美国Coulter公司)分析细胞表面蓖麻毒素的含量. 激发波长为488 nm, 发射波长为525 nm. 仪器用10 μm直径的荧光球校正，HalfCV值<2% . 采用对数单参数1 024道直方图收集数据，每份样品检测4 000个左右的细胞. 观察肝细胞及肝癌细胞表面蓖麻毒素及其修饰物阴性和阳性细胞的分布率.
, 百拇医药
所测数据以X±s表示，χ2检验其差异.
2 结果
2.1 蓖麻毒素及其修饰物在正常肝细胞膜上的分布 当给细胞培养液中分别加入蓖麻毒素和ricin-PDP，使其终浓度为50 pmol.L-1时，在荧光显微镜下观察，大部分肝细胞显示黄绿色荧光呈阳性反应，对照为阴性结果，表现为无荧光. 流式细胞仪检测分析结果表明(Fig 1， Tab 1)： ricin-PDP在正常肝细胞上的分布率为(21.4±3.0)%， 与未修饰的蓖麻毒素在肝细胞上的分布率为(24.4±3.6)%相比，两者基本相同，阳性分布率经χ2检验无明显差别.
2.2 蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布 与正常肝细胞相同，在细胞培养液中加入50 pmol/L的蓖麻毒素和ricin-PDP，荧光显微镜下可观察到大部分肝癌细胞呈黄绿色荧光，而阴性对照则无荧光.流式细胞仪检测结果可见，ricin-PDP在肝癌细胞上的分布率为39.7%，未修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布率为25.3%，经χ2检验，两者相比P<0.05 (Fig 1, Tab 1).
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图1 流式细胞仪检测蓖麻毒素及其修饰物在BEL-7402细胞上的分布
Fig 1 Distribution of control, ricin-PDP and ricin on the BEL-7402 cells analyzed by flow cytometry
50 pmol/L ricin and ricin-PDP (α-pyridyldithio propionate) were added in cell culture flask, then coincubated for 6 h. Ricin and ricin-PDP were not added in control groups.
表1 蓖麻毒素及其SPDP修饰物在QZG细胞和BEL-7402细胞上的分布率
Tab 1 Distribution rates of ricin and ricin-PDP on the QZG cell and the BEL-7402 cell
, 百拇医药
(n=5, X±s)
Group
Rate of fluorescein stained cell/%
QZG cell
BEL-7402 cell
Control
1.9±0.3
1.8±0.2
Ricin(50 pmol.L-1)
24.4±3.6
25.3±1.8a
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Ricin-PDP (50 pmol.L-1)
21.4±3.0b
39.7±1.2ab
aP<0.05 vs ricin group, bP<0.05 vs ricin BEL-7402 cell by χ2 test.
3 讨论
蓖麻毒素由大小相近的两个亚单位A链与B链所组成，通过其B链上的半乳糖结合位点与细胞表面含半乳糖残基的受体结合，然后使A链转移至细胞液中，与核糖体作用，抑制蛋白质合成. 蓖麻毒素与细胞表面的结合是使细胞中毒的一个必要步骤，因几乎所有真核细胞表面均普遍存在末端为半乳糖残基的受体，故蓖麻毒素具强非特异性杀伤作用. 我们用SPDP修饰蓖麻毒素，目的是想部分或完全封闭蓖麻毒素上的半乳糖结合位点，因为SPDP的引入，可与细胞表面含巯基的蛋白或多肽发生巯基-二硫基交换反应，进行可逆性结合[4]. 据报道，肿瘤组织的细胞表面含巯基的量增高，有可能与SPDP修饰的蓖麻毒素进行可逆性共价结合[5]. 由实验结果可看出，ricin-PDP与未修饰的蓖麻毒素相比在正常肝细胞上的分布率没有显著性差异，而在肝癌细胞上的分布率较未修饰的蓖麻毒素的分布率明显增高，提示 ricin与正常肝细胞结合是通过膜表面的含半乳糖残基的受体，而ricin-PDP与肝癌细胞膜的结合可能有两方面的因素，一方面可通过与膜上的含半乳糖残基的受体结合，另一方面也可通过SPDP与肝癌细胞膜上的含巯基蛋白结合，因此蓖麻毒素经SPDP修饰后能够增加它对肝癌组织的亲和活性,进一步的证明有待继续研究. 基金项目：国家自然科学基金资助项目 No. 39500122
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作者简介：董巨莹， 女， 1965-12-07生， 四川省广元市人， 汉族. 1988年华西医科大学毕业, 博士， 讲师, 发表论文15篇. 电话:(029)3374516
作者单位：第四军医大学基础部生物化学和分子生物学教研室,陕西 西安 710033
参考文献
1 Lin JY. Abrin and ricin: New anti-tumour substances. Nature,1970;227(1):292
2 董巨莹. 蓖麻毒素及其修饰物毒性大小比较研究.卫生毒理学杂志, 1994;8(5):131-132
3 王文学, 郭正仁. 简便经济的蓖麻毒素提取法. 第四军医大学学报, 1985,6(2):153-155
4 王文学. 异型双功能剂SPDP及其在医学研究中的应用. 第四军医大学学报,1989;9 (5)：360-362
5 Mehrishi JN, Grassetti DR. Sulphydryl groups on the surface of intact ehrlich ascites tumour cells, human blood platelets and lymphocytes. Nature, 1969;224(1):563-567, http://www.100md.com
摘 要 目的： 探讨3-(α-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(SPDP)修饰的蓖麻毒素抗肝癌活性及其机制. 方法： 用流式细胞仪分析蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布变化. 结果： 修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布比未修饰的蓖麻毒素明显增多. 结论： SPDP修饰后的蓖麻毒素对肝癌细胞的亲和力增加， 提示蓖麻毒素用SPDP修饰可能是改进其抗癌作用的一个有价值的途径.
关键词:蓖麻蛋白 化学修饰 癌，肝细胞 药代动力学 分布
0 引言
蓖麻毒素(ricin)是从植物蓖麻籽中提取的一种有毒糖蛋白，属蛋白合成抑制剂. 抑制真核细胞内蛋白质合成而导致细胞死亡. 自1970年Lin等[1]发现蓖麻毒素具有抗癌作用以来，蓖麻毒素已广泛应用于抗癌免疫毒素研究，但对应用于临床仍存在不少问题. 例如将蓖麻毒素的A链制得免疫毒素虽然消除了蓖麻毒素B链的非特异结合性,但其杀伤癌细胞活性显著降低,又由于A链上甘露糖寡糖的存在,能与体内单核巨噬细胞表面的甘露糖受体以及lgG Fc受体结合,从而被吞噬与清除使其浓度迅速降低,达不到真正的抗癌目的. 而目前将单克隆抗体或基因工程抗体在人体的应用仍待进一步研究. 我们采用化学修饰方法, 将蓖麻毒素用3-(α-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯 (SPDP)进行修饰; 以往的实验结果已证实: SPDP通过其分子中α-吡啶二硫基与蓖麻毒素分子上的氨基结合可使SPDP修饰的蓖麻毒素(ricin-PDP)抗荷人肝癌裸鼠活性增高[2],我们检测了SPDP修饰的蓖麻毒素和蓖麻毒素两者在肝癌细胞和正常肝细胞上的分布差别, 进一步探讨抗癌活性增高的机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 蓖麻毒素及其修饰物为本校毒理学教研室采用改进的Lappi法[3]从蓖麻籽(西安产)中提取. 经SDS-PAGE鉴定为单带，相对分子质量为65 000 ku. 小鼠LD50为52 ng.kg-1. 提取后的蓖麻毒素用异型双功能剂SPDP进行修饰，经测定后修饰率平均为每分子蓖麻毒素结合5.5个SPDP分子. 人肝癌细胞系BEL-7402和正常人肝细胞系QZG均来自中国科学院上海细胞所细胞库. 培养基为含有100 mL/L的胎牛血清的RPMI-1640，在CO2孵箱中生长至指数增长期时，分别加入蓖麻毒素和ricin-PDP，使之终浓度为50 pmol/L. 作用6 h后，移去药液，加入1.25 g/L 胰酶， 2 g/L EDTA消化液处理细胞3 min～5 min, 离心洗涤，计数待用.
1.2 方法 免疫荧光染色： 收集1×106个/L对数生长期的细胞，经蓖麻毒素及其修饰物处理后(阴性对照不经两者处理)， 3组细胞再用0.01 mol.L-1 PBS洗涤细胞2次，用20 mL/L 正常兔血清40℃封闭30 min, 加超量的蓖麻毒素抗B链单抗(50 mg.L-1)(American Type Culture Collection) 40℃反应40 min, 0.01 mol.L-1 PBS离心洗涤，再加入标有异硫氰酸荧光素(FITC)的兔抗鼠第二抗体(购于华美公司)，然后用100 mL/L甲醛液固定，调节终体积为500 μL，待流式细胞仪检测. Elite ESP型流式细胞仪(flow cytometer, FCM)(美国Coulter公司)分析细胞表面蓖麻毒素的含量. 激发波长为488 nm, 发射波长为525 nm. 仪器用10 μm直径的荧光球校正，HalfCV值<2% . 采用对数单参数1 024道直方图收集数据，每份样品检测4 000个左右的细胞. 观察肝细胞及肝癌细胞表面蓖麻毒素及其修饰物阴性和阳性细胞的分布率.
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所测数据以X±s表示，χ2检验其差异.
2 结果
2.1 蓖麻毒素及其修饰物在正常肝细胞膜上的分布 当给细胞培养液中分别加入蓖麻毒素和ricin-PDP，使其终浓度为50 pmol.L-1时，在荧光显微镜下观察，大部分肝细胞显示黄绿色荧光呈阳性反应，对照为阴性结果，表现为无荧光. 流式细胞仪检测分析结果表明(Fig 1， Tab 1)： ricin-PDP在正常肝细胞上的分布率为(21.4±3.0)%， 与未修饰的蓖麻毒素在肝细胞上的分布率为(24.4±3.6)%相比，两者基本相同，阳性分布率经χ2检验无明显差别.
2.2 蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布 与正常肝细胞相同，在细胞培养液中加入50 pmol/L的蓖麻毒素和ricin-PDP，荧光显微镜下可观察到大部分肝癌细胞呈黄绿色荧光，而阴性对照则无荧光.流式细胞仪检测结果可见，ricin-PDP在肝癌细胞上的分布率为39.7%，未修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布率为25.3%，经χ2检验，两者相比P<0.05 (Fig 1, Tab 1).
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图1 流式细胞仪检测蓖麻毒素及其修饰物在BEL-7402细胞上的分布
Fig 1 Distribution of control, ricin-PDP and ricin on the BEL-7402 cells analyzed by flow cytometry
50 pmol/L ricin and ricin-PDP (α-pyridyldithio propionate) were added in cell culture flask, then coincubated for 6 h. Ricin and ricin-PDP were not added in control groups.
表1 蓖麻毒素及其SPDP修饰物在QZG细胞和BEL-7402细胞上的分布率
Tab 1 Distribution rates of ricin and ricin-PDP on the QZG cell and the BEL-7402 cell
, 百拇医药
(n=5, X±s)
Group
Rate of fluorescein stained cell/%
QZG cell
BEL-7402 cell
Control
1.9±0.3
1.8±0.2
Ricin(50 pmol.L-1)
24.4±3.6
25.3±1.8a
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Ricin-PDP (50 pmol.L-1)
21.4±3.0b
39.7±1.2ab
aP<0.05 vs ricin group, bP<0.05 vs ricin BEL-7402 cell by χ2 test.
3 讨论
蓖麻毒素由大小相近的两个亚单位A链与B链所组成，通过其B链上的半乳糖结合位点与细胞表面含半乳糖残基的受体结合，然后使A链转移至细胞液中，与核糖体作用，抑制蛋白质合成. 蓖麻毒素与细胞表面的结合是使细胞中毒的一个必要步骤，因几乎所有真核细胞表面均普遍存在末端为半乳糖残基的受体，故蓖麻毒素具强非特异性杀伤作用. 我们用SPDP修饰蓖麻毒素，目的是想部分或完全封闭蓖麻毒素上的半乳糖结合位点，因为SPDP的引入，可与细胞表面含巯基的蛋白或多肽发生巯基-二硫基交换反应，进行可逆性结合[4]. 据报道，肿瘤组织的细胞表面含巯基的量增高，有可能与SPDP修饰的蓖麻毒素进行可逆性共价结合[5]. 由实验结果可看出，ricin-PDP与未修饰的蓖麻毒素相比在正常肝细胞上的分布率没有显著性差异，而在肝癌细胞上的分布率较未修饰的蓖麻毒素的分布率明显增高，提示 ricin与正常肝细胞结合是通过膜表面的含半乳糖残基的受体，而ricin-PDP与肝癌细胞膜的结合可能有两方面的因素，一方面可通过与膜上的含半乳糖残基的受体结合，另一方面也可通过SPDP与肝癌细胞膜上的含巯基蛋白结合，因此蓖麻毒素经SPDP修饰后能够增加它对肝癌组织的亲和活性,进一步的证明有待继续研究. 基金项目：国家自然科学基金资助项目 No. 39500122
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作者简介：董巨莹， 女， 1965-12-07生， 四川省广元市人， 汉族. 1988年华西医科大学毕业, 博士， 讲师, 发表论文15篇. 电话:(029)3374516
作者单位：第四军医大学基础部生物化学和分子生物学教研室,陕西 西安 710033
参考文献
1 Lin JY. Abrin and ricin: New anti-tumour substances. Nature,1970;227(1):292
2 董巨莹. 蓖麻毒素及其修饰物毒性大小比较研究.卫生毒理学杂志, 1994;8(5):131-132
3 王文学, 郭正仁. 简便经济的蓖麻毒素提取法. 第四军医大学学报, 1985,6(2):153-155
4 王文学. 异型双功能剂SPDP及其在医学研究中的应用. 第四军医大学学报,1989;9 (5)：360-362
5 Mehrishi JN, Grassetti DR. Sulphydryl groups on the surface of intact ehrlich ascites tumour cells, human blood platelets and lymphocytes. Nature, 1969;224(1):563-567, http://www.100md.com