人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因修饰及其在大肠杆菌中的高效表达
荫俊1 孙叶方* 张郁* 史俊南* 王革
摘 要 目的 对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)cDNA 5′端进行修饰以实现在大肠杆菌中的高效表达。方法 采用PCR方法进行插入和定点突变，转化大肠杆菌实现原核系统表达。通过细胞和生物学方法对表达产物进行鉴定。结果 修饰后基因的氨基酸序列与文献报道完全一致，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的25%；重组蛋白可刺激体外培养的TF-1细胞生长和细胞集落形成；其蛋白比活达到1.5×107/mg。氨基酸N末端序列分析表明，前16位氨基酸序列与天然序列完全一致。结论 对GM-CSFcDNA5′端进行修饰可有效地提高N末端启始区的翻译效率，从而实现在大肠杆菌中的高效表达。获得具有生物学活性的重组蛋白。
关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 基因修饰 表达 大肠杆菌
, http://www.100md.com
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)主要来源于激活的T、B淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，是刺激造血前体细胞分化及增殖的细胞因子。同时在机体免疫调节过程中具有重要作用。hGM-CSF由144个氨基酸组成，其中前17个氨基酸为信号肽。成熟的hGM-CSF基因由127个氨基酸组成，相对分子量约为147000，其生物学活性不受糖基化的影响。目前hGM-CSF基因已分别在真核和原核表达系统中得到表达[1～4]。尽管大肠杆菌表达系统缺乏蛋白质的翻译后加工能力，并可能潜在地影响表达蛋白质的稳定性、抗原性及生物学活性，但大肠杆菌表达系统所具有的低成本、高产量等优点则是其他体系无法比拟的，因此仍是目前最常用的外源基因表达系统。由于hGM-CSF的cDNA5′端起始序列的G和C含量较高，同时还具有大肠杆菌使用频率低的密码子，因此天然hGM-CSF基因序列难以在原核系统中高效表达。为此本实验采用PCR技术，利用设计合成的一对引物，对hGM-CSF基因5′端序列进行插入和定点修饰，以期提高N端起始区的翻译效率，并实现在大肠杆菌中的高效表达。为进一步深入研究其基因结构与生物学活性关系奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
菌株和质粒 大肠杆菌DH5α、JM109和质粒pBluscript KS及pBV220由本室保存，含有hGM-CSF基因的cDNA的质粒由本室构建。
酶及试剂 限制性内切酶、DNA连接酶、DNA纯化试剂盒购自Promega公司，Taq DNA聚合酶购自华美生物技术公司。
引物合成及PCR反应 PCR引物采用固相亚磷酰胺法在ABI381A DNA 合成仪上合成。合成产物经PAGE电泳纯化。PCR反应以含有hGM-CSF全长cDNA的质粒为模板，反应总体积为100μl，含引物各100pmol，dNTP200pmol,10μl10×Taq聚合酶Buffer。反应程序为95℃变性30s，55℃退火50s，75℃延伸50s，在PCR自动反应仪(PE公司)作30个循环。PCR产物经低融点胶电泳纯化回收。
hGM-CSFcDNA克隆和核苷酸序列测定 实验操作依文献[5]进行，PCR产物经回收纯化、Klenow补平、EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后双粘端连接到pBluscriptKS克隆载体上，经转化、酶切筛选鉴定阳性克隆，以PEG纯化的质粒双链DNA为模板，采用荧光染料标记法在ABI373A自动测序仪测定核苷酸序列。
, http://www.100md.com
hGM-CSF基因在大肠杆菌中的表达 将含有hGM-CSF基因的pBluscriptKS质粒酶切，回收小片段，Klenow补平、酶切后定向克隆进pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α，转化后经酶切鉴定，接种LB培养基30℃活化过夜，按1∶20转种于LB培养基，30℃摇床培养至吸光度A6000.5，迅速升温至42℃，继续培养5h，收集菌体直接溶于电泳上样缓冲液，行15%SDS-PAGE电泳。表达菌体溶于50mmol/L的Tris-HCl,经超声破碎，TE反复离心洗涤后，溶于8mol/L的尿素，包涵体经复性后，进行生物学活性测定。部分纯化包涵体经HPLC进一步纯化后，进行N端氨基酸序列测定。
生物学活性测定
骨髓细胞集落形成实验： 取外科整形手术中的正常人骨髓，经RPMI1640洗涤后混悬，加淋巴细胞分离液取单个核细胞层，调整细胞数至2×105/ml，与0.3%软琼脂1∶1混合接种于35mm平皿中，分别加入10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml复性hGM-CSF，另设空白和标准hGM-CSF对照，37℃，体积分数为0.05的CO2培养2周，计数>40个细胞的集落，压片染色后镜检。
, http://www.100md.com
细胞染色掺入法： 表达后的菌体离心洗涤，经超声破碎提取包涵体，溶于8mol/L的尿素，稀释复性后以1640培养液以1～2ng/ml作倍比稀释。TF-1细胞传代3次，RPMI1640培养液洗涤3次，调整细胞数至1×105/ml，接种96孔细胞培养板，rhGM-CSF复性液倍比稀释加入培养孔，37℃，体积分数为0.05的CO2培养36h，MTT法测定A值，以半数最大刺激量计算rhGM-CSF的生物学活性。
蛋白免疫印迹实验 表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，通过电转移至PVDF膜，分别与抗hGM-CSF单抗、酶标二抗和显色系统反应后观察结果。
表达产物的N端氨基酸序列测定 表达产物经HPLC纯化后，用MicroTFA Filter偶联，上样量60μl(500pmol)，于ABI476A氨基酸序列测定仪测定N末端氨基酸序列。
2 结果和讨论
, 百拇医药
hGM-CSFcDNA的克隆及5′端修饰 在天然hGM-CSF成熟基因5′端，编码前几个氨基酸的密码子在大肠杆菌中使用率极低，同时这部分的GC含量很高，转录成mRNA后很容易形成二级结构，影响翻译启始。由于大肠杆菌不能识别哺乳类基因的翻译控制序列，也不能裂解分泌性蛋白前体，因此必须对外源基因进行适当修饰，因而参照文献发表的基因序列，设计合成了一对PCR引物，旨在切除hGM-CSF的cDNA的信号肽序列，在编码成熟蛋白的基因序列前直接引入了EcoRⅠ酶切位点和启始密码子ATG，并在不改变编码氨基酸的前提下将核苷酸中的一些G和C改成A或T，使其成为大肠杆菌使用率高的密码子，以期有效地提高N端起始区的翻译效率(5′-AGGAATTCAATGGCACCTGCCCGTTCTC-CGAGCCCGAGCACTCAGCCGTGGG-3′)。在hGM-CSF成熟基因序列3′端引入了大肠杆菌的强终止密码子TAA和BamHⅠ酶切位点(5′-CGGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC-3′)。经PCR反应后得到了修饰后完整的hGM-CSF成熟区基因序列。
, 百拇医药
修饰后hGM-CSF基因的核苷酸序列分析 将PCR产物回收纯化，以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，插入pBluscriptKS克隆载体的相应酶切位点，转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定(图1)，质粒DNA经PEG法纯化，采用荧光标记法于ABI373A自动测序仪测定核苷酸序列。测序结果显示，hGM-CSF的cDNA成熟区5′端的插入和定点突变完全符合设计要求，读码框正确，所编码的氨基酸序列与文献发表的完全一致。实验表明，PCR方法中，使用设计合理的寡核苷酸引物，可在信号肽与成熟蛋白编码序列之间进行有效的定点和插入突变。这种方法简单实用，为外源基因的克隆、修饰和高效表达提供了快速有效的方法。
图1 PCR产物及表达质粒的电泳图谱
Fig 1 Gel-electrophoresis of PCR produc tion and PBV220 expression vector
, 百拇医药
A.pBV220 expression vector was digested with EcoRⅠ/BamHⅠ;B.molecular marker;C.PCR production;D.pBV220 negative control
hGM-CSF基因在大肠杆菌中的高效表达 将pBluscriptKS质粒DNA以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，低融点胶回收纯化小片段DNA，以pBV220为表达载体，插入至相应酶切位点，使hGM-CSF基因位于PRPL启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定筛选阳性转化克隆，单菌落接种于5mlLB培养基，30℃摇床培养过夜，以1∶20转种于100mlLB培养基，30℃培养至A600约0.5，迅速升温至42℃继续震荡培养5h，离心收集菌体，溶于电泳样品缓冲液，100℃煮沸5min，行15%SDS-PAGE电泳。结果表明，工程菌株经42℃热诱导后，出现明显的相对分子量14700大小的蛋白条带，与天然hGM-CSF相对分子量相符，表达量约占细菌总蛋白的25%(图2)。表达产物以包涵体形式存在。一些研究表明，除非在真核基因前融合一些细菌蛋白成分，否则难以在大肠杆菌中高效表达，而修饰后的hGM-CSF基因5′端，由于提高了大肠杆菌高频使用密码子的数量，同时丰富了A和T的含量，在不同程度上满足了pBV220表达载体对外源基因高效表达的条件需求，使hGM-CSF基因在转录和翻译两个水平被促进，从而大大提高了外源基因在大肠杆菌中的表达量。
, 百拇医药
图2 表达产物的SDS-PAGE电泳
Fig 2 SDS-PAGE of recombinant hGM-CSF
A.before inducement; B.after inducement;
C.inclusion; D.molecular marker
表达产物的初步纯化和生物学活性测定 集落形成实验结果表明，3个浓度的复性液均可刺激集落形成，并呈剂量依赖曲线，一周时主要出现粒细胞集落，14天则以巨噬细胞为主(图3)。而空白对照组则无集落形成。
图3 rhGM-CSF刺激下形成的骨髓细胞集落
, http://www.100md.com
Fig 3 Formation of marrow cell clone stimulated by rhGM-CSF
TF-1细胞刺激实验结果表明，表达菌体溶于含有蔗糖和Triton-X100的Tris-HCl中，经超声破碎、洗涤、离心后得粗制包涵体，包涵体溶于8mol/L的尿素和DTT，温浴1.5h，离心制备纯化包涵体。包涵体液以1∶30溶于Tris-HCl中，18h后加入EDTA，室温下透析复性。粗纯化的hGM-CSF经MTT法测定对依赖株细胞TF-1的生物学活性。结果表明，修饰表达的hGM-CSF蛋白比活性达1.5×107U/mg。
表达纯化产物的鉴定 经ABI473A多肽氨基酸顺序测定仪分析重组蛋白N末端氨基酸序列，重组hGM-CSFN端前16位氨基酸顺序为：MAPARSPSPSTQPWEH，与天然蛋白的氨基酸顺序完全一致。
蛋白免疫印迹实验 结果表明，抗hGM-CSF单抗可与相对分子量14700大小的电泳条带发生特异性反应(图4)，从而证明表达产物具有hGM-CSF的蛋白构型。
, http://www.100md.com
图4 表达产物的免疫印迹实验
Fig 4 Western-blot of the recombinant hGM-CSF
A.band of recombinant hGM-CSF protein;
B.molecular marker
以上结果表明，PCR反应可有效的对hGM-CSF的cDNA5′端基因进行插入和定点突变，由修饰基因所建立的工程菌株可以高效表达hGM-CSF重组蛋白，表达产物具有与天然蛋白相同的生物学活性。重组hGM-CSF在大肠杆菌中的高效表达，对进一步研究突变基因与结构功能间的相互关系，以及更有效地利用蛋白质工程技术，为临床应用hGM-CSF奠定了基础。
1通讯作者：军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京100071；*第四军医大学牙髓生物学实验室
, http://www.100md.com
作者单位：中国科学院微生物研究所病毒室，北京 100081
参考文献
[1]Mayer P, Lam C, Obenaus H, et al. Recombinan t human GM-CSF induces leucocytosis and activates peripheral blood polymorphonu clear neutrophils in nonhuman primates. Blood, 1987, 70:206～213
[2]Martin J, Bosch O, Moraleda G, et al. Pilot study of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in the treatment of chronic hepatitis B. Hepatology, 1993, 1:8775～8780
, 百拇医药
[3]Burgess AW, Begley CG, Johnson GR,et al. Pur ification and proporties of bacterially synthesized human granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Blood, 1987, 69:43～51
[4]Au LC, Liu TJ, Shen HD, et al. Secretory pro duction of bioactive recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulati ng factor by a baculovirus expression system. J Biotechnol, 1996, 51:107～113
[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab, 1989, 百拇医药(荫俊1 孙叶方* 张郁* 史俊南* 王革)
摘 要 目的 对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)cDNA 5′端进行修饰以实现在大肠杆菌中的高效表达。方法 采用PCR方法进行插入和定点突变，转化大肠杆菌实现原核系统表达。通过细胞和生物学方法对表达产物进行鉴定。结果 修饰后基因的氨基酸序列与文献报道完全一致，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的25%；重组蛋白可刺激体外培养的TF-1细胞生长和细胞集落形成；其蛋白比活达到1.5×107/mg。氨基酸N末端序列分析表明，前16位氨基酸序列与天然序列完全一致。结论 对GM-CSFcDNA5′端进行修饰可有效地提高N末端启始区的翻译效率，从而实现在大肠杆菌中的高效表达。获得具有生物学活性的重组蛋白。
关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 基因修饰 表达 大肠杆菌
, http://www.100md.com
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)主要来源于激活的T、B淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，是刺激造血前体细胞分化及增殖的细胞因子。同时在机体免疫调节过程中具有重要作用。hGM-CSF由144个氨基酸组成，其中前17个氨基酸为信号肽。成熟的hGM-CSF基因由127个氨基酸组成，相对分子量约为147000，其生物学活性不受糖基化的影响。目前hGM-CSF基因已分别在真核和原核表达系统中得到表达[1～4]。尽管大肠杆菌表达系统缺乏蛋白质的翻译后加工能力，并可能潜在地影响表达蛋白质的稳定性、抗原性及生物学活性，但大肠杆菌表达系统所具有的低成本、高产量等优点则是其他体系无法比拟的，因此仍是目前最常用的外源基因表达系统。由于hGM-CSF的cDNA5′端起始序列的G和C含量较高，同时还具有大肠杆菌使用频率低的密码子，因此天然hGM-CSF基因序列难以在原核系统中高效表达。为此本实验采用PCR技术，利用设计合成的一对引物，对hGM-CSF基因5′端序列进行插入和定点修饰，以期提高N端起始区的翻译效率，并实现在大肠杆菌中的高效表达。为进一步深入研究其基因结构与生物学活性关系奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
菌株和质粒 大肠杆菌DH5α、JM109和质粒pBluscript KS及pBV220由本室保存，含有hGM-CSF基因的cDNA的质粒由本室构建。
酶及试剂 限制性内切酶、DNA连接酶、DNA纯化试剂盒购自Promega公司，Taq DNA聚合酶购自华美生物技术公司。
引物合成及PCR反应 PCR引物采用固相亚磷酰胺法在ABI381A DNA 合成仪上合成。合成产物经PAGE电泳纯化。PCR反应以含有hGM-CSF全长cDNA的质粒为模板，反应总体积为100μl，含引物各100pmol，dNTP200pmol,10μl10×Taq聚合酶Buffer。反应程序为95℃变性30s，55℃退火50s，75℃延伸50s，在PCR自动反应仪(PE公司)作30个循环。PCR产物经低融点胶电泳纯化回收。
hGM-CSFcDNA克隆和核苷酸序列测定 实验操作依文献[5]进行，PCR产物经回收纯化、Klenow补平、EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后双粘端连接到pBluscriptKS克隆载体上，经转化、酶切筛选鉴定阳性克隆，以PEG纯化的质粒双链DNA为模板，采用荧光染料标记法在ABI373A自动测序仪测定核苷酸序列。
, http://www.100md.com
hGM-CSF基因在大肠杆菌中的表达 将含有hGM-CSF基因的pBluscriptKS质粒酶切，回收小片段，Klenow补平、酶切后定向克隆进pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α，转化后经酶切鉴定，接种LB培养基30℃活化过夜，按1∶20转种于LB培养基，30℃摇床培养至吸光度A6000.5，迅速升温至42℃，继续培养5h，收集菌体直接溶于电泳上样缓冲液，行15%SDS-PAGE电泳。表达菌体溶于50mmol/L的Tris-HCl,经超声破碎，TE反复离心洗涤后，溶于8mol/L的尿素，包涵体经复性后，进行生物学活性测定。部分纯化包涵体经HPLC进一步纯化后，进行N端氨基酸序列测定。
生物学活性测定
骨髓细胞集落形成实验： 取外科整形手术中的正常人骨髓，经RPMI1640洗涤后混悬，加淋巴细胞分离液取单个核细胞层，调整细胞数至2×105/ml，与0.3%软琼脂1∶1混合接种于35mm平皿中，分别加入10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml复性hGM-CSF，另设空白和标准hGM-CSF对照，37℃，体积分数为0.05的CO2培养2周，计数>40个细胞的集落，压片染色后镜检。
, http://www.100md.com
细胞染色掺入法： 表达后的菌体离心洗涤，经超声破碎提取包涵体，溶于8mol/L的尿素，稀释复性后以1640培养液以1～2ng/ml作倍比稀释。TF-1细胞传代3次，RPMI1640培养液洗涤3次，调整细胞数至1×105/ml，接种96孔细胞培养板，rhGM-CSF复性液倍比稀释加入培养孔，37℃，体积分数为0.05的CO2培养36h，MTT法测定A值，以半数最大刺激量计算rhGM-CSF的生物学活性。
蛋白免疫印迹实验 表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，通过电转移至PVDF膜，分别与抗hGM-CSF单抗、酶标二抗和显色系统反应后观察结果。
表达产物的N端氨基酸序列测定 表达产物经HPLC纯化后，用MicroTFA Filter偶联，上样量60μl(500pmol)，于ABI476A氨基酸序列测定仪测定N末端氨基酸序列。
2 结果和讨论
, 百拇医药
hGM-CSFcDNA的克隆及5′端修饰 在天然hGM-CSF成熟基因5′端，编码前几个氨基酸的密码子在大肠杆菌中使用率极低，同时这部分的GC含量很高，转录成mRNA后很容易形成二级结构，影响翻译启始。由于大肠杆菌不能识别哺乳类基因的翻译控制序列，也不能裂解分泌性蛋白前体，因此必须对外源基因进行适当修饰，因而参照文献发表的基因序列，设计合成了一对PCR引物，旨在切除hGM-CSF的cDNA的信号肽序列，在编码成熟蛋白的基因序列前直接引入了EcoRⅠ酶切位点和启始密码子ATG，并在不改变编码氨基酸的前提下将核苷酸中的一些G和C改成A或T，使其成为大肠杆菌使用率高的密码子，以期有效地提高N端起始区的翻译效率(5′-AGGAATTCAATGGCACCTGCCCGTTCTC-CGAGCCCGAGCACTCAGCCGTGGG-3′)。在hGM-CSF成熟基因序列3′端引入了大肠杆菌的强终止密码子TAA和BamHⅠ酶切位点(5′-CGGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC-3′)。经PCR反应后得到了修饰后完整的hGM-CSF成熟区基因序列。
, 百拇医药
修饰后hGM-CSF基因的核苷酸序列分析 将PCR产物回收纯化，以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，插入pBluscriptKS克隆载体的相应酶切位点，转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定(图1)，质粒DNA经PEG法纯化，采用荧光标记法于ABI373A自动测序仪测定核苷酸序列。测序结果显示，hGM-CSF的cDNA成熟区5′端的插入和定点突变完全符合设计要求，读码框正确，所编码的氨基酸序列与文献发表的完全一致。实验表明，PCR方法中，使用设计合理的寡核苷酸引物，可在信号肽与成熟蛋白编码序列之间进行有效的定点和插入突变。这种方法简单实用，为外源基因的克隆、修饰和高效表达提供了快速有效的方法。
图1 PCR产物及表达质粒的电泳图谱
Fig 1 Gel-electrophoresis of PCR produc tion and PBV220 expression vector
, 百拇医药
A.pBV220 expression vector was digested with EcoRⅠ/BamHⅠ;B.molecular marker;C.PCR production;D.pBV220 negative control
hGM-CSF基因在大肠杆菌中的高效表达 将pBluscriptKS质粒DNA以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，低融点胶回收纯化小片段DNA，以pBV220为表达载体，插入至相应酶切位点，使hGM-CSF基因位于PRPL启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定筛选阳性转化克隆，单菌落接种于5mlLB培养基，30℃摇床培养过夜，以1∶20转种于100mlLB培养基，30℃培养至A600约0.5，迅速升温至42℃继续震荡培养5h，离心收集菌体，溶于电泳样品缓冲液，100℃煮沸5min，行15%SDS-PAGE电泳。结果表明，工程菌株经42℃热诱导后，出现明显的相对分子量14700大小的蛋白条带，与天然hGM-CSF相对分子量相符，表达量约占细菌总蛋白的25%(图2)。表达产物以包涵体形式存在。一些研究表明，除非在真核基因前融合一些细菌蛋白成分，否则难以在大肠杆菌中高效表达，而修饰后的hGM-CSF基因5′端，由于提高了大肠杆菌高频使用密码子的数量，同时丰富了A和T的含量，在不同程度上满足了pBV220表达载体对外源基因高效表达的条件需求，使hGM-CSF基因在转录和翻译两个水平被促进，从而大大提高了外源基因在大肠杆菌中的表达量。
, 百拇医药
图2 表达产物的SDS-PAGE电泳
Fig 2 SDS-PAGE of recombinant hGM-CSF
A.before inducement; B.after inducement;
C.inclusion; D.molecular marker
表达产物的初步纯化和生物学活性测定 集落形成实验结果表明，3个浓度的复性液均可刺激集落形成，并呈剂量依赖曲线，一周时主要出现粒细胞集落，14天则以巨噬细胞为主(图3)。而空白对照组则无集落形成。
图3 rhGM-CSF刺激下形成的骨髓细胞集落
, http://www.100md.com
Fig 3 Formation of marrow cell clone stimulated by rhGM-CSF
TF-1细胞刺激实验结果表明，表达菌体溶于含有蔗糖和Triton-X100的Tris-HCl中，经超声破碎、洗涤、离心后得粗制包涵体，包涵体溶于8mol/L的尿素和DTT，温浴1.5h，离心制备纯化包涵体。包涵体液以1∶30溶于Tris-HCl中，18h后加入EDTA，室温下透析复性。粗纯化的hGM-CSF经MTT法测定对依赖株细胞TF-1的生物学活性。结果表明，修饰表达的hGM-CSF蛋白比活性达1.5×107U/mg。
表达纯化产物的鉴定 经ABI473A多肽氨基酸顺序测定仪分析重组蛋白N末端氨基酸序列，重组hGM-CSFN端前16位氨基酸顺序为：MAPARSPSPSTQPWEH，与天然蛋白的氨基酸顺序完全一致。
蛋白免疫印迹实验 结果表明，抗hGM-CSF单抗可与相对分子量14700大小的电泳条带发生特异性反应(图4)，从而证明表达产物具有hGM-CSF的蛋白构型。
, http://www.100md.com
图4 表达产物的免疫印迹实验
Fig 4 Western-blot of the recombinant hGM-CSF
A.band of recombinant hGM-CSF protein;
B.molecular marker
以上结果表明，PCR反应可有效的对hGM-CSF的cDNA5′端基因进行插入和定点突变，由修饰基因所建立的工程菌株可以高效表达hGM-CSF重组蛋白，表达产物具有与天然蛋白相同的生物学活性。重组hGM-CSF在大肠杆菌中的高效表达，对进一步研究突变基因与结构功能间的相互关系，以及更有效地利用蛋白质工程技术，为临床应用hGM-CSF奠定了基础。
1通讯作者：军事医学科学院微生物流行病学研究所 北京100071；*第四军医大学牙髓生物学实验室
, http://www.100md.com
作者单位：中国科学院微生物研究所病毒室，北京 100081
参考文献
[1]Mayer P, Lam C, Obenaus H, et al. Recombinan t human GM-CSF induces leucocytosis and activates peripheral blood polymorphonu clear neutrophils in nonhuman primates. Blood, 1987, 70:206～213
[2]Martin J, Bosch O, Moraleda G, et al. Pilot study of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in the treatment of chronic hepatitis B. Hepatology, 1993, 1:8775～8780
, 百拇医药
[3]Burgess AW, Begley CG, Johnson GR,et al. Pur ification and proporties of bacterially synthesized human granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Blood, 1987, 69:43～51
[4]Au LC, Liu TJ, Shen HD, et al. Secretory pro duction of bioactive recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulati ng factor by a baculovirus expression system. J Biotechnol, 1996, 51:107～113
[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab, 1989, 百拇医药(荫俊1 孙叶方* 张郁* 史俊南* 王革)