60Co辐射对在体红细胞变形和取向能力的影响
谢利德 郑建军 刘东海 姚伟娟 陈凯 孙大公 文宗曜
摘 要：采用60Co大剂量全身均匀急性辐射的方法造成一种辐射贫血的动物模型，然后在较长时间内连续观测60Co辐射对在体红细胞变形和取向能力的影响。本文采用一种在低粘切变流场中能将红细胞变形指数DI分解为取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d的新型激光衍射法[1]，研究了60Co大剂量辐射后在体红细胞压积、变形和取向能力、沉降率和红细胞计数等血液流变学指标的变化规律，并与正常对照组红细胞的相应参数作比较，发现在60Co大剂量辐射后，开始这些参数变得明显异常，40天后逐渐接近于正常对照组水平。表明60Co大剂量急性辐射对动物体内血液循环系统的影响是长期的、严重的。这为研究辐射对血液流变特性的影响及正确地挑选辐射贫血模型提供了理论与实验的基础。
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关键词：红细胞 流变特性 变形指数 取向指数 压积 血沉 新型激光衍射法
辐射对动物体的影响是医学放射生物学的研究重点。辐射对动物体循环系统的影响是全方位的，就循环系统而言，急性放射病对大、中型血管病变较轻，而以小动静脉及毛细血管的变化最为显著。慢性放射病时，小血管的放射损伤在机体许多重要器官的损伤发病过程中起着重要的作用[2]。以往许多科学家从白细胞的角度研究了辐射的影响[3]，对红细胞的功能及流变特性的影响研究甚少，而红细胞是动物体循环系统中最多的有形成分，其流变特性不仅决定了其本身的寿命，而且在很大程度上决定了整个机体微循环的好坏，进而影响脏器的病生理状况。因此，在研究辐射对机体微循环系统的影响时，有必要考虑红细胞流变特性的变化。本文采用一种在低粘切变流场中能将红细胞变形指数DI分解为取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d的新型激光衍射法，通过强剂量60Co急性辐射的方法造成动物贫血，对可能产生的大量同步生长的代偿性红细胞衰老过程中流变特性的变化规律进行了研究，进而对这种红细胞在体衰老模型加以评价。
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1 材料与方法
1.1 材料
北京普利生仪器中心生产的LBY-BX2型激光衍射仪，LBY-XC16型全自动动态血沉测试仪，北京贝斯特公司提供的F-820血球计数仪(日本产)，北京大白兔(体重2.5-3Kg，年龄8个月左右，由北京医科大学动物实验部提供)，肝素(美国Sigma公司出品)，肝素化红细胞压积管，橡皮泥板，红细胞压积测量尺，3F-2型多功能微量高速离心机。等渗PBS缓冲液(磷酸二氢钾0.5Mm，磷酸氢二纳0.02Mm，氯化钠0.13Mm，pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg)；PVP溶液1(分子量=30kD,pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg，PVP浓度=3%，粘度=1.2cP，含0.004%的牛血清白蛋白)；PVP溶液2(分子量=30kD，pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg,PVP浓度=15%，粘度=8cP，含0.004%的牛血清白蛋白)。
1.2 方法
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1.2.1 取7只正常北京大白兔，每次每只耳缘静脉取血2ml(新鲜肝素抗凝)，作以下测量：
用微压积管测定红细胞压积；用LBY-XC16型全自动动态血沉测试仪测血沉(每个血样用血0.6ml);用LBY-BX2型激光衍射仪测红细胞在切变率为50-1000s-1范围内的变形指数DI(5ml溶液2配成浓度为2×107个/ml的红细胞悬液)、在切变率为50-140s-1范围内的取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d(5ml溶液1配成浓度为2×107个/ml的红细胞悬液)。以上测量连续5天，将每天所测结果取平均值，作为照射前的正常对照。
1.2.2 取方法1中的5只兔(2雌，3雄)，用60Co(由北京医科大学钴源室提供)一次性全身均匀照射7Gy，照射后的第二天仍进行方法1 中的各种测量，以后每隔2-3天测量一次，坚持测量60天，另外两只未照兔(1雄，1雌)同时作相应测量作为对照。
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1.2.3 用F-820血球计数仪测定照射前后红细胞计数随天数的变化。对上述结果采用SAS数理统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 用微压积管测得的60Co照射后0-60天红细胞压积与正常对照组红细胞压积的变化曲线如图1所示。
图1 60Co照射后0-60天红细胞压积的变化
2.2 全自动动态血沉测试仪测得的血沉与天数的关系如图2所示。
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图2 60Co照射后0-60天血沉的变化
2.3 用传统和新型激光衍射法，测得红细胞的变形指数和取向指数如图3所示。
图3A 照射后红细胞变形指数DI 图3B 照射后红细胞取向指数(DI)or
和综合变形指数IDI的变化 和小变形指数(DI)d的变化
2.4 照射后红细胞计数随天数变化的趋势如图4所示。
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图4 照射后红细胞计数随天数的变化
3 讨论
3.1 由图1见，在照射后的0-16天红细胞压积的总的变化趋势在逐渐减小，16-19天达到最低点，这是因为动物体在受到大剂量急性辐射时，造血系统中造血干、祖细胞和幼稚祖细胞对射线十分敏感，受照射后很快分裂增殖受抑，甚至完全丧失，使外周血中成熟血细胞的来源匮乏，网织红细胞很快减少以至消失[4]。加上成熟红细胞消耗增加和死亡加速，因此全血中的红细胞逐渐减少，如图4红细胞计数随天数变化的曲线所示，导致红细胞压积逐渐减小，照射剂量越大，造血损伤越重，外周血细胞的减少越甚，从而红细胞压积减小越显著且越早。照射后19天左右开始，随着机体辐射损伤的逐渐恢复，血液中网织红细胞生成增多，全血中红细胞计数增加(如图4所示)，红细胞压积逐渐增大，43天以后，达到一相对稳定值，此值略小于照前对照值，是因为造血系统受辐射后，造血机能减弱所致。值得注意的是由于新生红细胞是逐渐增加的，故这些红细胞并不是同步生长的!
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3.2 由图2可见，红细胞血沉，在照射后0-16天内，随全血中红细胞的数量减小，全血粘度减小而增大，且呈现极明显的增大现象，这是由于除以上二者外，还由于全血中网织红细胞消失，新生红细胞基本为零，全血中的红细胞受照射后加速老化，而老化的红细胞相对年轻红细胞比重增大[5]，因此更加速了血沉的增大，此外，使血沉在16-23天内出现窄而突出明显的峰值，血沉比压积和粘度的变化更为突出，可能是红细胞表面电荷降低，聚集增强所致。在约20天以后，随压积和粘度的逐渐恢复，血沉逐渐减小，到43天左右达到一稳定值，但此稳定值比对照值略大，这与全血粘度稀化现象一致。
3.3 由图3A可见，在照射后0-16天内红细胞的变形指数DI和变形积分指数IDI都在逐渐减小，且最低点与正常值有明显的变化关系，这主要由于受照后，全血中的新生红细胞来源匮乏，原有红细胞普遍逐渐老化，红细胞会发生一系列的生物物理和生物化学特性的变化，如红细胞膜流动性的降低、膜骨架蛋白的交联等，使红细胞变形能力降低[6，7]，因而导致其变形指数DI下降，从而变形积分指数也下降。在照射后16天左右变形能力逐渐增大，是由于机体辐射损伤逐渐恢复，全血中新生红细胞逐渐增多，新生红细胞的变形能力相对老化红细胞要强，且比例越来越大，而使整体变形指数增大，50天左右达到一稳定值，此稳定值小于照射前，是由于造血系统辐射损伤后所产生的新生红细胞功能下降而致。
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3.4 同时，我们还利用新型激光衍射法[1]测量了红细胞在体衰老过程中取向指数和小变形指数的变化规律。新型激光衍射法是由文宗曜、严宗毅等在传统激光衍射法的基础上提出的，传统激光衍射法采用高粘的悬浮介质(如PVP)测量红细胞在高切变率下的变形指数(DI)，而新型激光衍射法则采用低粘的悬浮介质PBS，将红细胞在低切变率下的变形指数(DI)分解成表征红细胞在流场中沿C=0轨道排列能力的取向指数(DI)or和变形能力的小变形指数(DI)d。红细胞的取向指数主要反映红细胞的形状的变化[8]，小变形指数则与红细胞膜的流动性呈正相关[9]。由图3B可见，受照射0-16天内，随着红细胞取向能力下降，说明红细胞的形态可能发生了变化：由正常双凹圆盘形变得不太规则，同时红细胞的小变形指数也呈下降趋势，表明红细胞在受到辐射后膜流动性有所降低。在16-40天左右变形逐渐增大的过程中，其取向、小变形也在逐渐增大，反映出由于新生红细胞的不断增加，动物体内红细胞的形态等指标都有所改善，在45天左右达到一稳定值。
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上述结果表明：用大剂量60Co辐射条件下造成兔血液流变学指标的异常是严重的、长期的，而且恢复是十分缓慢的，所产生的新生红细胞是非同步的，这种非同步化红细胞生长是完全不能作红细胞衰老模型的，其原因如下：
(1)此模型研究的是在机体受到严重辐射损伤后，无新生红细胞产生的情况下，机体原有的非同步产生的红细胞的衰老过程的流变学特性，和机体受到严重辐射损伤后，恢复过程中产生的新生红细胞的流变学特性，都是红细胞生命过程的一部分，是在严重非正常生理条件下进行的(其非正常生理条件可由实验过程中全血中白细胞计数的异常变化进一步得到证实)。
(2)由于辐射对机体的损伤是全方位的，恢复期较长，通常为一周或几周，仅网织细胞大量出现的时间就在15天左右或更长。因此，本模型在造成动物贫血的程度上受很大限制，过量照射易造成动物死亡(正如实验过程中所证实的那样)，本模型造成贫血的最小压积在20%以上，所以本模型造成贫血的效果并不理想。
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(3)由于成熟红细胞对射线反应不很敏感，因此，本模型在辐射后红细胞压积、计数、变形指数、等曲线变化缓慢，在16、17天才能达到最小值，40多天后，或更长时间才能基本恢复。
因此，此模型作为红细胞在体同步衰老模型是不合适的，但作为辐射对红细胞流变特性影响的研究仍存在一定意义。
*国家自然科学基金(号39770203)资助
作者简介：谢利德 博士生
文宗曜 博士生导师，博士点号9729
作者单位：谢利德(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
郑建军(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
刘东海(承德医学院物理教研室 (河北0670000))
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姚伟娟(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
陈凯(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
孙大公(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
文宗曜(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
参考文献：
[1]文宗曜，严宗毅，施岩等.测量红细胞膜剪切弹性模量及粘度的新方法—新型激光衍射法.现代力学与科技进步，1997.
[2]刘树铮.医学放射生物学.北京：原子能出版社，1986；30，202
[3]夏寿萱.放射生物学.军事医学科学出版，1998.8.
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[4]刘及.辐射血液学.北京：原子能出版社，1991：41.
[5]宋立川.吕智红.孙大公.施岩.杨跃平.文宗曜，红细胞衰老过程中的密度变化.中国生物医学工程学报，1997，16(3):219-223.
[6]宋立川.文宗曜.饶用清.刘永葆.60Co-辐射对红细胞影响.北京生物医学工程，1996，15(1),42-44.
[7]宋立川.吕智红.孙大公.施岩.杨跃平.文宗曜.红细胞衰老过程中微观流变学行为的研究.物理学报，1997，13(4)：113-117.
[8]Wen Zong-yao,Gao Tie,Ma Wei-yuan.Effects of albumun on orientation of RBC in a shear flow field of low viscosity,Clinical Hemorheology.1996,Vol.16(3):291-301.
[9]Wen Zon-gao,Zong-yi Yan,Tie Gao,Huan Dou,Jingfen Lu,Dagong Sun and Zhihong Lu.The study of effects of WGA and ConA on RBC receptors with a new Ektacytometry.Clinical Heomrhology and Microcirculation,Vol.17(6);1997 467-478., 百拇医药
摘 要：采用60Co大剂量全身均匀急性辐射的方法造成一种辐射贫血的动物模型，然后在较长时间内连续观测60Co辐射对在体红细胞变形和取向能力的影响。本文采用一种在低粘切变流场中能将红细胞变形指数DI分解为取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d的新型激光衍射法[1]，研究了60Co大剂量辐射后在体红细胞压积、变形和取向能力、沉降率和红细胞计数等血液流变学指标的变化规律，并与正常对照组红细胞的相应参数作比较，发现在60Co大剂量辐射后，开始这些参数变得明显异常，40天后逐渐接近于正常对照组水平。表明60Co大剂量急性辐射对动物体内血液循环系统的影响是长期的、严重的。这为研究辐射对血液流变特性的影响及正确地挑选辐射贫血模型提供了理论与实验的基础。
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关键词：红细胞 流变特性 变形指数 取向指数 压积 血沉 新型激光衍射法
辐射对动物体的影响是医学放射生物学的研究重点。辐射对动物体循环系统的影响是全方位的，就循环系统而言，急性放射病对大、中型血管病变较轻，而以小动静脉及毛细血管的变化最为显著。慢性放射病时，小血管的放射损伤在机体许多重要器官的损伤发病过程中起着重要的作用[2]。以往许多科学家从白细胞的角度研究了辐射的影响[3]，对红细胞的功能及流变特性的影响研究甚少，而红细胞是动物体循环系统中最多的有形成分，其流变特性不仅决定了其本身的寿命，而且在很大程度上决定了整个机体微循环的好坏，进而影响脏器的病生理状况。因此，在研究辐射对机体微循环系统的影响时，有必要考虑红细胞流变特性的变化。本文采用一种在低粘切变流场中能将红细胞变形指数DI分解为取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d的新型激光衍射法，通过强剂量60Co急性辐射的方法造成动物贫血，对可能产生的大量同步生长的代偿性红细胞衰老过程中流变特性的变化规律进行了研究，进而对这种红细胞在体衰老模型加以评价。
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1 材料与方法
1.1 材料
北京普利生仪器中心生产的LBY-BX2型激光衍射仪，LBY-XC16型全自动动态血沉测试仪，北京贝斯特公司提供的F-820血球计数仪(日本产)，北京大白兔(体重2.5-3Kg，年龄8个月左右，由北京医科大学动物实验部提供)，肝素(美国Sigma公司出品)，肝素化红细胞压积管，橡皮泥板，红细胞压积测量尺，3F-2型多功能微量高速离心机。等渗PBS缓冲液(磷酸二氢钾0.5Mm，磷酸氢二纳0.02Mm，氯化钠0.13Mm，pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg)；PVP溶液1(分子量=30kD,pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg，PVP浓度=3%，粘度=1.2cP，含0.004%的牛血清白蛋白)；PVP溶液2(分子量=30kD，pH=7.4，渗透压=300mOsm/Kg,PVP浓度=15%，粘度=8cP，含0.004%的牛血清白蛋白)。
1.2 方法
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1.2.1 取7只正常北京大白兔，每次每只耳缘静脉取血2ml(新鲜肝素抗凝)，作以下测量：
用微压积管测定红细胞压积；用LBY-XC16型全自动动态血沉测试仪测血沉(每个血样用血0.6ml);用LBY-BX2型激光衍射仪测红细胞在切变率为50-1000s-1范围内的变形指数DI(5ml溶液2配成浓度为2×107个/ml的红细胞悬液)、在切变率为50-140s-1范围内的取向指数(DI)or和小变形指数(DI)d(5ml溶液1配成浓度为2×107个/ml的红细胞悬液)。以上测量连续5天，将每天所测结果取平均值，作为照射前的正常对照。
1.2.2 取方法1中的5只兔(2雌，3雄)，用60Co(由北京医科大学钴源室提供)一次性全身均匀照射7Gy，照射后的第二天仍进行方法1 中的各种测量，以后每隔2-3天测量一次，坚持测量60天，另外两只未照兔(1雄，1雌)同时作相应测量作为对照。
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1.2.3 用F-820血球计数仪测定照射前后红细胞计数随天数的变化。对上述结果采用SAS数理统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 用微压积管测得的60Co照射后0-60天红细胞压积与正常对照组红细胞压积的变化曲线如图1所示。
图1 60Co照射后0-60天红细胞压积的变化
2.2 全自动动态血沉测试仪测得的血沉与天数的关系如图2所示。
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图2 60Co照射后0-60天血沉的变化
2.3 用传统和新型激光衍射法，测得红细胞的变形指数和取向指数如图3所示。
图3A 照射后红细胞变形指数DI 图3B 照射后红细胞取向指数(DI)or
和综合变形指数IDI的变化 和小变形指数(DI)d的变化
2.4 照射后红细胞计数随天数变化的趋势如图4所示。
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图4 照射后红细胞计数随天数的变化
3 讨论
3.1 由图1见，在照射后的0-16天红细胞压积的总的变化趋势在逐渐减小，16-19天达到最低点，这是因为动物体在受到大剂量急性辐射时，造血系统中造血干、祖细胞和幼稚祖细胞对射线十分敏感，受照射后很快分裂增殖受抑，甚至完全丧失，使外周血中成熟血细胞的来源匮乏，网织红细胞很快减少以至消失[4]。加上成熟红细胞消耗增加和死亡加速，因此全血中的红细胞逐渐减少，如图4红细胞计数随天数变化的曲线所示，导致红细胞压积逐渐减小，照射剂量越大，造血损伤越重，外周血细胞的减少越甚，从而红细胞压积减小越显著且越早。照射后19天左右开始，随着机体辐射损伤的逐渐恢复，血液中网织红细胞生成增多，全血中红细胞计数增加(如图4所示)，红细胞压积逐渐增大，43天以后，达到一相对稳定值，此值略小于照前对照值，是因为造血系统受辐射后，造血机能减弱所致。值得注意的是由于新生红细胞是逐渐增加的，故这些红细胞并不是同步生长的!
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3.2 由图2可见，红细胞血沉，在照射后0-16天内，随全血中红细胞的数量减小，全血粘度减小而增大，且呈现极明显的增大现象，这是由于除以上二者外，还由于全血中网织红细胞消失，新生红细胞基本为零，全血中的红细胞受照射后加速老化，而老化的红细胞相对年轻红细胞比重增大[5]，因此更加速了血沉的增大，此外，使血沉在16-23天内出现窄而突出明显的峰值，血沉比压积和粘度的变化更为突出，可能是红细胞表面电荷降低，聚集增强所致。在约20天以后，随压积和粘度的逐渐恢复，血沉逐渐减小，到43天左右达到一稳定值，但此稳定值比对照值略大，这与全血粘度稀化现象一致。
3.3 由图3A可见，在照射后0-16天内红细胞的变形指数DI和变形积分指数IDI都在逐渐减小，且最低点与正常值有明显的变化关系，这主要由于受照后，全血中的新生红细胞来源匮乏，原有红细胞普遍逐渐老化，红细胞会发生一系列的生物物理和生物化学特性的变化，如红细胞膜流动性的降低、膜骨架蛋白的交联等，使红细胞变形能力降低[6，7]，因而导致其变形指数DI下降，从而变形积分指数也下降。在照射后16天左右变形能力逐渐增大，是由于机体辐射损伤逐渐恢复，全血中新生红细胞逐渐增多，新生红细胞的变形能力相对老化红细胞要强，且比例越来越大，而使整体变形指数增大，50天左右达到一稳定值，此稳定值小于照射前，是由于造血系统辐射损伤后所产生的新生红细胞功能下降而致。
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3.4 同时，我们还利用新型激光衍射法[1]测量了红细胞在体衰老过程中取向指数和小变形指数的变化规律。新型激光衍射法是由文宗曜、严宗毅等在传统激光衍射法的基础上提出的，传统激光衍射法采用高粘的悬浮介质(如PVP)测量红细胞在高切变率下的变形指数(DI)，而新型激光衍射法则采用低粘的悬浮介质PBS，将红细胞在低切变率下的变形指数(DI)分解成表征红细胞在流场中沿C=0轨道排列能力的取向指数(DI)or和变形能力的小变形指数(DI)d。红细胞的取向指数主要反映红细胞的形状的变化[8]，小变形指数则与红细胞膜的流动性呈正相关[9]。由图3B可见，受照射0-16天内，随着红细胞取向能力下降，说明红细胞的形态可能发生了变化：由正常双凹圆盘形变得不太规则，同时红细胞的小变形指数也呈下降趋势，表明红细胞在受到辐射后膜流动性有所降低。在16-40天左右变形逐渐增大的过程中，其取向、小变形也在逐渐增大，反映出由于新生红细胞的不断增加，动物体内红细胞的形态等指标都有所改善，在45天左右达到一稳定值。
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上述结果表明：用大剂量60Co辐射条件下造成兔血液流变学指标的异常是严重的、长期的，而且恢复是十分缓慢的，所产生的新生红细胞是非同步的，这种非同步化红细胞生长是完全不能作红细胞衰老模型的，其原因如下：
(1)此模型研究的是在机体受到严重辐射损伤后，无新生红细胞产生的情况下，机体原有的非同步产生的红细胞的衰老过程的流变学特性，和机体受到严重辐射损伤后，恢复过程中产生的新生红细胞的流变学特性，都是红细胞生命过程的一部分，是在严重非正常生理条件下进行的(其非正常生理条件可由实验过程中全血中白细胞计数的异常变化进一步得到证实)。
(2)由于辐射对机体的损伤是全方位的，恢复期较长，通常为一周或几周，仅网织细胞大量出现的时间就在15天左右或更长。因此，本模型在造成动物贫血的程度上受很大限制，过量照射易造成动物死亡(正如实验过程中所证实的那样)，本模型造成贫血的最小压积在20%以上，所以本模型造成贫血的效果并不理想。
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(3)由于成熟红细胞对射线反应不很敏感，因此，本模型在辐射后红细胞压积、计数、变形指数、等曲线变化缓慢，在16、17天才能达到最小值，40多天后，或更长时间才能基本恢复。
因此，此模型作为红细胞在体同步衰老模型是不合适的，但作为辐射对红细胞流变特性影响的研究仍存在一定意义。
*国家自然科学基金(号39770203)资助
作者简介：谢利德 博士生
文宗曜 博士生导师，博士点号9729
作者单位：谢利德(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
郑建军(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
刘东海(承德医学院物理教研室 (河北0670000))
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姚伟娟(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
陈凯(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
孙大公(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
文宗曜(北京医科大学物理教研室 (北京100083))
参考文献：
[1]文宗曜，严宗毅，施岩等.测量红细胞膜剪切弹性模量及粘度的新方法—新型激光衍射法.现代力学与科技进步，1997.
[2]刘树铮.医学放射生物学.北京：原子能出版社，1986；30，202
[3]夏寿萱.放射生物学.军事医学科学出版，1998.8.
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[4]刘及.辐射血液学.北京：原子能出版社，1991：41.
[5]宋立川.吕智红.孙大公.施岩.杨跃平.文宗曜，红细胞衰老过程中的密度变化.中国生物医学工程学报，1997，16(3):219-223.
[6]宋立川.文宗曜.饶用清.刘永葆.60Co-辐射对红细胞影响.北京生物医学工程，1996，15(1),42-44.
[7]宋立川.吕智红.孙大公.施岩.杨跃平.文宗曜.红细胞衰老过程中微观流变学行为的研究.物理学报，1997，13(4)：113-117.
[8]Wen Zong-yao,Gao Tie,Ma Wei-yuan.Effects of albumun on orientation of RBC in a shear flow field of low viscosity,Clinical Hemorheology.1996,Vol.16(3):291-301.
[9]Wen Zon-gao,Zong-yi Yan,Tie Gao,Huan Dou,Jingfen Lu,Dagong Sun and Zhihong Lu.The study of effects of WGA and ConA on RBC receptors with a new Ektacytometry.Clinical Heomrhology and Microcirculation,Vol.17(6);1997 467-478., 百拇医药