抑癌基因Rb、MTS1的表达与膀胱癌的预后
孙光 陈志文 张淑敏 马腾骧
摘 要 目的：研究抑癌基因Rb、MTS1的表达与膀胱癌的预后。方法：用S-P免疫组化法同步检测60例膀胱移行细胞癌抑癌基因Rb、MTS1的表达，观察其与预后的关系。结果：PRb、p16表达阳性组生存率明显优于阴性组。结论：PRb与p16均具有膀胱癌的预后价值，而同步检测两者的预后价值优于单一检测。
关键词：膀胱肿瘤 癌 基因 预后
膀胱癌生物学行为的多变性与其基因改变密切相关，其中抑癌基因的失活比原癌基因的激活可能更具重要作用。本实验同步检测膀胱癌组织中抑癌基因Rb与MTS1的表达，探讨抑癌基因的表达与膀胱癌预后的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
, 百拇医药
标本来自我院1975～1994年间手术治疗的60例膀胱移行细胞癌患者，均经10%甲醛固定、石蜡包埋。病理分级(WHO法)G1 5例、G2 19例、G3 36例。临床分期(UICC.TNM法)：表浅癌Tis～T1 38例，浸润癌T2～422例。本组26例术后1～5年死于膀胱癌，其余术后随访均达5年以上。
1.2 试剂与方法
PRb(C-15)兔抗人多克隆抗体、p16(C-20)兔抗人多克隆抗体均为美国Santa Cruz产品，S-P试剂盒DAB购自北京中山生物技术公司，一抗滴度为PRb 1：25，p16 1：100，二抗、三抗均为1：100。
采用S-P免疫组化染色法进行检测，TBS替代一抗作空白阴性对照，膀胱移行细胞癌PRb、p16阳性片作阳性对照。根据染色范围及着色程度判定结果。阴性：无着色或着色<10%视野；阳性：10%～30%为+，30%～50%为，50%～75%为，>75%为。
, 百拇医药
1.3 统计方法
数据分析采用卡方检验，生存比较采用Kaplan-Meier曲线及Log-rank时序检验。
2 结果
PRb着色的组织学特征为核着色，而p16显色以胞浆为主，与正常粘膜交界处着色加深。PRb及p16的表达率与膀胱癌病理分级、临床分期的关系见表1，2。由于G1肿瘤例数少，将G1与G2合并为低分级组，G3为高分级组。比较两组PRb表达率无显著性差异(P>0.05)，p16表达率则是低分级组显著高于高分级组(P<0.05)。表浅癌的PRb、p16表达率均显著高于浸润癌(P<0.05)。分别比较PRb或p16阳性组与阴性组的生存概率(图1、2)，阳性组均明显高于阴性组(P<0.01)。进一步比较同步检测PRb、p16的结果(表3)，发现两者同时缺失组的病死率明显高于单一缺失组或同时表达组(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 PRb、p16表达率与膀胱癌分级的关系
分 级
例 数
PRb
p16
G1
5
4(80.0)
4(80.0)
G2
19
12(63.2)
14(73.7)
, 百拇医药
G3
36
16(44.4)
12(33.3)
总 计
60
32(53.3)
30(50.0)
( )内为%表2 PRb、p16表达率与膀胱癌分期的关系
分 期
例 数
PRb
, 百拇医药
p16
Tis～T1
38
24(63.2)
24(63.2)
T2～T4
22
8(36.4)
6(27.2)
( )内为%表3 PRb、p16同步检测与预后的关系(%)
分 组
, 百拇医药
例数
生存人数
死亡人数
PRb、p16同时阳性
19
16(84.2)
3(15.8)
PRb或p16单一阳性
24
14(58.3)
10(41.7)
PRb、p16同时阴性
, 百拇医药
17
4(23.5)
13(76.5)
图1 PRb(+)组与PRb(-)组生存曲线比较
图2 p16(+)组与p16(-)组生存曲线比较
3 讨论
肿瘤可视为基因病变，癌基因的激活和抑癌基因的失活是正常细胞转化成癌细胞的主要原因。抑癌基因在细胞周期中是重要的调控因子，起着阻滞细胞增殖促进细胞分化的作用，其失活可能对肿瘤生物学行为影响更大。本组60例膀胱癌中41例(68.3%)抑癌基因Rb和(或)MTS1的蛋白产物失表达，其缺失程度与肿瘤的分级、分期，患者的生存概率、病死率均密切相关。
Rb基因是从人类视网膜母细胞瘤中发现并克隆出的第一个肿瘤抑制基因。在膀胱癌组织中约1/3表现为Rb基因突变或缺失[1]。Rb基因编码蛋白(PRb)是110KD的磷酸核蛋白，位于核内，具有DNA结合力，既可通过与E2F、Elf-1等转录因子结合成复合物阻止转录因子活化，又可通过调控与细胞增殖有关的原癌基因的功能，如c-myc、c-fos等，完成抑制细胞增殖促进细胞分化的作用。本组浸润性膀胱癌的PRb失表达率(63.6%)明显高于表浅癌(36.8%)，与Cordon等[2]的报告基本相符。提示PRb失表达与膀胱癌的侵袭性生物学行为有关。PRb阳性组生存率高于PRb阴性组则进一步说明PRb失表达是膀胱癌预后不良的信号。
, 百拇医药
MTS1基因是1994年才发现的重要新型抑癌基因。Kamb等[3]发现290种不同肿瘤细胞系中75%存在MTS1基因的缺失与突变，其中膀胱癌突变率为33%。MTS1基因的编码蛋白p16分子量为16KD，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。p16直接参与G1期关卡效应，阻滞细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。p16的缺失将直接影响细胞周期的调控，加速肿瘤的恶化进程。本组膀胱癌p16总表达率为50.0%，其中G1 80%，G2 73.4%，G3 33.3%；浅表癌63.2%，浸润癌27.2%，与袁建林[4]检测结果近似。提示p16的表达与膀胱癌的分化程度、浸润能力密切相关。p16阳性组生存概率明显高于p16阴性组，进一步说明p16在膀胱癌预后判定中具有重要价值。
近年发现抑癌基因蛋白产物PRb和p16均参与细胞周期调控的反馈调节环。在细胞周期中非磷酸化PRb通过与转录因子TF结合抑制其转录活性，发挥促进细胞分化抑制细胞增殖的作用。而细胞周期素D(Cyclin-D)与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合后，其复合物可使PRb磷酸化，释出TF。游离的TF恢复转录活性，促进细胞从G1期进入S期，合成DNA进行增殖。随着MTS1转录增强，p16亦增多。p16可与Cyclin D竞争结合CDK4，通过抑制CDK4的活性阻止PRb的磷酸化，从而减少TF释出，反馈性抑制细胞增殖。而PRb磷酸化下降使游离TF减少，MTS1转录减弱，p16随之下降，细胞增殖又将增强。显然，在这一反馈调节环中PRb与p16存在交互作用。Shapiro等[5]与Yeager等[6]已发现PRb正常的细胞中p16水平较低或检测不到，而PRb缺失的细胞中p16水平较高。本实验同步检测膀胱癌PRb与p16，发现两者同时缺失组的病死率(76.5%)显著高于单一缺失组(41.7%)(P<0.05)和两者同时表达组(15.8%)(P<0.005)。这一结果可能是由于PRb、p16同时缺失后，两者在细胞周期中的交互作用随之丧失，G1期到S期的阻滞完全消失，受损基因难以修复，导致肿瘤细胞增殖失控，表现出极为不良的生物学行为。我们认为分别检测膀胱癌组织中的PRb与p16均有助于判定肿瘤的预后，而同步检测PRb和p16比单一检测更具预后判定价值。
, http://www.100md.com
基金项目：本文课题受天津市高教委重点学科科研资金资助
作者单位：孙光(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
陈志文(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
张淑敏(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
马腾骧(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
参考文献：
1，Horowitz JM,Yandell DW,Park SH, et al. Point mutation in-activation of the retinoblastoma antioncogene. Science,1989;243：937
, http://www.100md.com
2，Cordon-Cardo C,Wartinger D, Petrylak D, et al. Altered expr-ession of the re-
tinoblastoma gene product; prognostic indicator in bladder cancer. J Natl. Cancer Inst, 1992;84：1251
3，Kamb A,Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle re-gulator potenially involved in genes of many tumor types. Science, 1994;264：436
4，袁建林，王剑波，于茂生，等.抑癌基因p16在膀胱肿瘤中的表达及意义.中华泌尿外科杂志，1995；16：722
5，Shapiro gL,Edwards CD,Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inacti-vation and p16 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995;55：505
6，Yeager T, Stadler W, Belair C, et al. Increased p16 levels corr-elate with pRb alterations in human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55：493, 百拇医药
摘 要 目的：研究抑癌基因Rb、MTS1的表达与膀胱癌的预后。方法：用S-P免疫组化法同步检测60例膀胱移行细胞癌抑癌基因Rb、MTS1的表达，观察其与预后的关系。结果：PRb、p16表达阳性组生存率明显优于阴性组。结论：PRb与p16均具有膀胱癌的预后价值，而同步检测两者的预后价值优于单一检测。
关键词：膀胱肿瘤 癌 基因 预后
膀胱癌生物学行为的多变性与其基因改变密切相关，其中抑癌基因的失活比原癌基因的激活可能更具重要作用。本实验同步检测膀胱癌组织中抑癌基因Rb与MTS1的表达，探讨抑癌基因的表达与膀胱癌预后的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
, 百拇医药
标本来自我院1975～1994年间手术治疗的60例膀胱移行细胞癌患者，均经10%甲醛固定、石蜡包埋。病理分级(WHO法)G1 5例、G2 19例、G3 36例。临床分期(UICC.TNM法)：表浅癌Tis～T1 38例，浸润癌T2～422例。本组26例术后1～5年死于膀胱癌，其余术后随访均达5年以上。
1.2 试剂与方法
PRb(C-15)兔抗人多克隆抗体、p16(C-20)兔抗人多克隆抗体均为美国Santa Cruz产品，S-P试剂盒DAB购自北京中山生物技术公司，一抗滴度为PRb 1：25，p16 1：100，二抗、三抗均为1：100。
采用S-P免疫组化染色法进行检测，TBS替代一抗作空白阴性对照，膀胱移行细胞癌PRb、p16阳性片作阳性对照。根据染色范围及着色程度判定结果。阴性：无着色或着色<10%视野；阳性：10%～30%为+，30%～50%为，50%～75%为，>75%为。
, 百拇医药
1.3 统计方法
数据分析采用卡方检验，生存比较采用Kaplan-Meier曲线及Log-rank时序检验。
2 结果
PRb着色的组织学特征为核着色，而p16显色以胞浆为主，与正常粘膜交界处着色加深。PRb及p16的表达率与膀胱癌病理分级、临床分期的关系见表1，2。由于G1肿瘤例数少，将G1与G2合并为低分级组，G3为高分级组。比较两组PRb表达率无显著性差异(P>0.05)，p16表达率则是低分级组显著高于高分级组(P<0.05)。表浅癌的PRb、p16表达率均显著高于浸润癌(P<0.05)。分别比较PRb或p16阳性组与阴性组的生存概率(图1、2)，阳性组均明显高于阴性组(P<0.01)。进一步比较同步检测PRb、p16的结果(表3)，发现两者同时缺失组的病死率明显高于单一缺失组或同时表达组(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 PRb、p16表达率与膀胱癌分级的关系
分 级
例 数
PRb
p16
G1
5
4(80.0)
4(80.0)
G2
19
12(63.2)
14(73.7)
, 百拇医药
G3
36
16(44.4)
12(33.3)
总 计
60
32(53.3)
30(50.0)
( )内为%表2 PRb、p16表达率与膀胱癌分期的关系
分 期
例 数
PRb
, 百拇医药
p16
Tis～T1
38
24(63.2)
24(63.2)
T2～T4
22
8(36.4)
6(27.2)
( )内为%表3 PRb、p16同步检测与预后的关系(%)
分 组
, 百拇医药
例数
生存人数
死亡人数
PRb、p16同时阳性
19
16(84.2)
3(15.8)
PRb或p16单一阳性
24
14(58.3)
10(41.7)
PRb、p16同时阴性
, 百拇医药
17
4(23.5)
13(76.5)
图1 PRb(+)组与PRb(-)组生存曲线比较
图2 p16(+)组与p16(-)组生存曲线比较
3 讨论
肿瘤可视为基因病变，癌基因的激活和抑癌基因的失活是正常细胞转化成癌细胞的主要原因。抑癌基因在细胞周期中是重要的调控因子，起着阻滞细胞增殖促进细胞分化的作用，其失活可能对肿瘤生物学行为影响更大。本组60例膀胱癌中41例(68.3%)抑癌基因Rb和(或)MTS1的蛋白产物失表达，其缺失程度与肿瘤的分级、分期，患者的生存概率、病死率均密切相关。
Rb基因是从人类视网膜母细胞瘤中发现并克隆出的第一个肿瘤抑制基因。在膀胱癌组织中约1/3表现为Rb基因突变或缺失[1]。Rb基因编码蛋白(PRb)是110KD的磷酸核蛋白，位于核内，具有DNA结合力，既可通过与E2F、Elf-1等转录因子结合成复合物阻止转录因子活化，又可通过调控与细胞增殖有关的原癌基因的功能，如c-myc、c-fos等，完成抑制细胞增殖促进细胞分化的作用。本组浸润性膀胱癌的PRb失表达率(63.6%)明显高于表浅癌(36.8%)，与Cordon等[2]的报告基本相符。提示PRb失表达与膀胱癌的侵袭性生物学行为有关。PRb阳性组生存率高于PRb阴性组则进一步说明PRb失表达是膀胱癌预后不良的信号。
, 百拇医药
MTS1基因是1994年才发现的重要新型抑癌基因。Kamb等[3]发现290种不同肿瘤细胞系中75%存在MTS1基因的缺失与突变，其中膀胱癌突变率为33%。MTS1基因的编码蛋白p16分子量为16KD，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。p16直接参与G1期关卡效应，阻滞细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。p16的缺失将直接影响细胞周期的调控，加速肿瘤的恶化进程。本组膀胱癌p16总表达率为50.0%，其中G1 80%，G2 73.4%，G3 33.3%；浅表癌63.2%，浸润癌27.2%，与袁建林[4]检测结果近似。提示p16的表达与膀胱癌的分化程度、浸润能力密切相关。p16阳性组生存概率明显高于p16阴性组，进一步说明p16在膀胱癌预后判定中具有重要价值。
近年发现抑癌基因蛋白产物PRb和p16均参与细胞周期调控的反馈调节环。在细胞周期中非磷酸化PRb通过与转录因子TF结合抑制其转录活性，发挥促进细胞分化抑制细胞增殖的作用。而细胞周期素D(Cyclin-D)与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合后，其复合物可使PRb磷酸化，释出TF。游离的TF恢复转录活性，促进细胞从G1期进入S期，合成DNA进行增殖。随着MTS1转录增强，p16亦增多。p16可与Cyclin D竞争结合CDK4，通过抑制CDK4的活性阻止PRb的磷酸化，从而减少TF释出，反馈性抑制细胞增殖。而PRb磷酸化下降使游离TF减少，MTS1转录减弱，p16随之下降，细胞增殖又将增强。显然，在这一反馈调节环中PRb与p16存在交互作用。Shapiro等[5]与Yeager等[6]已发现PRb正常的细胞中p16水平较低或检测不到，而PRb缺失的细胞中p16水平较高。本实验同步检测膀胱癌PRb与p16，发现两者同时缺失组的病死率(76.5%)显著高于单一缺失组(41.7%)(P<0.05)和两者同时表达组(15.8%)(P<0.005)。这一结果可能是由于PRb、p16同时缺失后，两者在细胞周期中的交互作用随之丧失，G1期到S期的阻滞完全消失，受损基因难以修复，导致肿瘤细胞增殖失控，表现出极为不良的生物学行为。我们认为分别检测膀胱癌组织中的PRb与p16均有助于判定肿瘤的预后，而同步检测PRb和p16比单一检测更具预后判定价值。
, http://www.100md.com
基金项目：本文课题受天津市高教委重点学科科研资金资助
作者单位：孙光(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
陈志文(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
张淑敏(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
马腾骧(天津医科大学第二医院泌尿科 天津市泌尿外科研究所 天津市 300211)
参考文献：
1，Horowitz JM,Yandell DW,Park SH, et al. Point mutation in-activation of the retinoblastoma antioncogene. Science,1989;243：937
, http://www.100md.com
2，Cordon-Cardo C,Wartinger D, Petrylak D, et al. Altered expr-ession of the re-
tinoblastoma gene product; prognostic indicator in bladder cancer. J Natl. Cancer Inst, 1992;84：1251
3，Kamb A,Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle re-gulator potenially involved in genes of many tumor types. Science, 1994;264：436
4，袁建林，王剑波，于茂生，等.抑癌基因p16在膀胱肿瘤中的表达及意义.中华泌尿外科杂志，1995；16：722
5，Shapiro gL,Edwards CD,Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inacti-vation and p16 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995;55：505
6，Yeager T, Stadler W, Belair C, et al. Increased p16 levels corr-elate with pRb alterations in human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55：493, 百拇医药