抗氧化剂槲皮素诱导人白血病HL-60细胞凋亡作用
作者：李忌 陈俊杰 高小平 周健 罗弟祥 李伯刚
单位：李忌 陈俊杰(610041 成都，华西医科大学基础医学院医学分子生物学开放实验室)；高小平 周健 罗弟祥 李伯刚(中国科学院成都地奥制药公司新药部)
关键词：
中华血液学杂志000613 槲皮素(quercetin，Que)是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物，有较强的抗氧化作用[1]。以往的研究结果表明，Que可抑制多种肿瘤细胞的生长，且可加强某些抗癌药物的抗癌作用[1，2]；Que对白血病细胞的DNA合成有抑制作用[3]。因而，Que被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物，但Que的作用机制尚未阐明。我们的研究结果显示，Que可有效诱导人白血病HL-60细胞发生凋亡，且引发抗凋亡基因bcl-2的蛋白发生降解。
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材料和方法
1 试剂 Que、噻唑蓝(MTT)及碘化丙锭(PI)为Sigma公司产品，其它常用试剂均为国产分析纯。
2 细胞培养及存活率测定 HL-60细胞由本室长期传代，以1×105/ml浓度接种于含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FCS)，100U/ml 青霉素，100μg/ml 链霉素的新鲜RPMI 1640(Gibco公司产品)培养液中培养(37℃，体积分数为5%的CO2)。采用MTT法测定细胞存活率[4]。
3 细胞形态学观察 HL-60细胞与一定浓度Que共同培养不同时间后，于倒置显微镜下观察或制成细胞涂片，经Giemsa染色后于光镜下观察。
4 流式细胞仪计数分析[5] 收集细胞，用体积分数为70%的乙醇4℃固定4h后，加入RNA酶(终浓度为50μg/ml) 37℃反应1h，再用PI(浓度为100μg/ml)溶液染色20～30min后，用流式细胞仪(Becton Dickinson 公司，美国)分析。
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5 细胞DNA片段化分析 收集细胞(106个细胞以上)，加入裂解液(10g/L NP40,20mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)反应10s。离心收集上清，加入SDS至10g/L浓度，并用RNA酶(终浓度50μg/ml)56℃作用1～2h，然后再加入蛋白酶κ至2.5mg/ml，37℃处理2h，用乙醇沉淀DNA，用10～20μl TE溶解DNA，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳。
6 Western blot分析[6] 提取经Que处理后的细胞总蛋白质，用BCA检测试剂盒(Sigma公司)进行定量。取30μg蛋白质样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，120g/L)，转膜，按照ECL Western blot试剂盒(Amershan公司)的程序进行Western blot，第一抗体为兔抗人Bcl-2单抗(Santa公司)。
结 果
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1 Que抑制HL-60细胞增殖 不同浓度Que对HL-60细胞生长有抑制作用，这种作用呈时间、剂量依赖性。随Que浓度的增加细胞存活率降低(见图1)。时效关系曲线与量效关系曲线相似。
2 Que对HL-60细胞形态学影响 经100μmol/L Que处理HL-60细胞24h后，HL-60细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化：细胞体积缩小、细胞核固缩、膜起泡、核断裂及形成凋亡小体等。
3 流式细胞仪分析HL-60细胞DNA含量 经不同浓度Que处理后的HL-60细胞，可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群，这群细胞的百分率随Que浓度的递增而增加(图2)。
4 DNA电泳 100μmol/L的Que处理HL-60细胞24h和48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状降解条带。
5 Que使Bcl-2发生降解 HL-60是一种Bcl-2高表达的细胞系[7]，经Western blot分析，我们发现100μmol/L Que处理HL-60细胞24h或48h，均导致Bcl-2发生降解(图3)，与标准分子量Marker比较并计算得知：大片段相对分子质量为25×103，类似于Bcl-2α同工酶[8]；小片段为20×103。目前，它的功能还不得而知。
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图1 不同浓度Que作用于HL-60细胞24h的量效关系曲线
图2 流式细胞仪分析HL-60细胞凋亡情况
1：对照组；2：100μmol/L Que处理24h；3：100μmol/L Que处理48h
图3 Western blot分析Bcl-2降解情况
讨 论
本研究结果表明，Que在100 μmol/L时能有效诱导HL-60细胞发生凋亡，表现为：①形态学上细胞体积缩小、核浓缩致密及凋亡小体形成；②琼脂糖凝胶电泳有梯状条带出现；③流式细胞术检测有亚G1峰出现。并且这种凋亡的作用有时间和浓度依赖性，Western blot检测发现Que诱导HL-60细胞凋亡过程中，引发Bcl-2蛋白降解为相对分子质量为25×103和20×103的片段。
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有关Que诱发Bcl-2降解的研究尚未见报道。Bcl-2的降解提示有相关蛋白酶的激活，凋亡发生是一个复杂的由caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，相对分子质量为20×103的降解产物的产生还不知是何种caspases激活所致[8]。不同类型细胞由于其生物学特性不同，发生凋亡时可能存在不同的蛋白酶激活，Bcl-2也可能作为多种蛋白酶的底物被降解。Que诱发HL-60细胞的Bcl-2发生降解，可能是激活了相关蛋白酶，具体机制有待进一步研究。
我们根据自己及其他实验室的实验结果提出：细胞氧化还原平衡状态的改变是导致细胞凋亡的重要原因，因此，抗氧化剂Que诱导HL-60细胞发生凋亡可能与它改变细胞氧化还原状态的平衡有关。
参考文献
1，Eiattar TMA, Virji AS. Modulating effect of resveratol and quercetin on oral cancer cell growth and proliferation. Anti-Cancer Drugs, 1999, 10:187-193.
, 百拇医药
2，Elia G, Santoro MG. Regulation of heat shock protein synthesis by quercetin in human erythroleukaemia cells. Biochem J, 1994, 300:201-209.
3，Uddin S, Chaudhry MA. Quercetin, a bioflavonoid, inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells. Biochem Mol Biol Int, 1995, 36:545-551.
4，王振华，李忌，郑荣梁，等. 菰帽悬钩子三萜糖酯的体外抗肿瘤活性. 中国药学杂志, 1999, 34:163-164.
5，Li X, Melamed MR, Darzynkiewicz Z. Detection of apoptosis and DNA strand breaks with fluorochromes of different color. Exp Cell Res, 1996, 222:28-37.
, 百拇医药
6，Grandgirard D, Studer E, Monney L, et al. Alphaviruses induce apoptosis in Bcl-2-overexpressing cells:evidence for a caspase-mediated, proteolytic inactivation of Bcl-2. EMBO J, 1998, 17:1268-1278.
7，Kawaii S, Tomono Y, Katase E, et al. Acridones as inducers of HL-60 cell differentiation. Leukemia Res, 1999, 23:263-269.
8，Yamamoto AM, Eloy L, Bach JF, et al. N-terminus cleavage of bcl-2 by a novel cellular non-ICE cysteine proteinase. Leukemia, 1998, 12:1467-1472.
9，Slater AFG, Nobel CSI, Orrenius S. The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271:59-62.
(收稿日期：1999-06-25), 百拇医药
单位：李忌 陈俊杰(610041 成都，华西医科大学基础医学院医学分子生物学开放实验室)；高小平 周健 罗弟祥 李伯刚(中国科学院成都地奥制药公司新药部)
关键词：
中华血液学杂志000613 槲皮素(quercetin，Que)是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物，有较强的抗氧化作用[1]。以往的研究结果表明，Que可抑制多种肿瘤细胞的生长，且可加强某些抗癌药物的抗癌作用[1，2]；Que对白血病细胞的DNA合成有抑制作用[3]。因而，Que被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物，但Que的作用机制尚未阐明。我们的研究结果显示，Que可有效诱导人白血病HL-60细胞发生凋亡，且引发抗凋亡基因bcl-2的蛋白发生降解。
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材料和方法
1 试剂 Que、噻唑蓝(MTT)及碘化丙锭(PI)为Sigma公司产品，其它常用试剂均为国产分析纯。
2 细胞培养及存活率测定 HL-60细胞由本室长期传代，以1×105/ml浓度接种于含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FCS)，100U/ml 青霉素，100μg/ml 链霉素的新鲜RPMI 1640(Gibco公司产品)培养液中培养(37℃，体积分数为5%的CO2)。采用MTT法测定细胞存活率[4]。
3 细胞形态学观察 HL-60细胞与一定浓度Que共同培养不同时间后，于倒置显微镜下观察或制成细胞涂片，经Giemsa染色后于光镜下观察。
4 流式细胞仪计数分析[5] 收集细胞，用体积分数为70%的乙醇4℃固定4h后，加入RNA酶(终浓度为50μg/ml) 37℃反应1h，再用PI(浓度为100μg/ml)溶液染色20～30min后，用流式细胞仪(Becton Dickinson 公司，美国)分析。
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5 细胞DNA片段化分析 收集细胞(106个细胞以上)，加入裂解液(10g/L NP40,20mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)反应10s。离心收集上清，加入SDS至10g/L浓度，并用RNA酶(终浓度50μg/ml)56℃作用1～2h，然后再加入蛋白酶κ至2.5mg/ml，37℃处理2h，用乙醇沉淀DNA，用10～20μl TE溶解DNA，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳。
6 Western blot分析[6] 提取经Que处理后的细胞总蛋白质，用BCA检测试剂盒(Sigma公司)进行定量。取30μg蛋白质样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，120g/L)，转膜，按照ECL Western blot试剂盒(Amershan公司)的程序进行Western blot，第一抗体为兔抗人Bcl-2单抗(Santa公司)。
结 果
, http://www.100md.com
1 Que抑制HL-60细胞增殖 不同浓度Que对HL-60细胞生长有抑制作用，这种作用呈时间、剂量依赖性。随Que浓度的增加细胞存活率降低(见图1)。时效关系曲线与量效关系曲线相似。
2 Que对HL-60细胞形态学影响 经100μmol/L Que处理HL-60细胞24h后，HL-60细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化：细胞体积缩小、细胞核固缩、膜起泡、核断裂及形成凋亡小体等。
3 流式细胞仪分析HL-60细胞DNA含量 经不同浓度Que处理后的HL-60细胞，可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群，这群细胞的百分率随Que浓度的递增而增加(图2)。
4 DNA电泳 100μmol/L的Que处理HL-60细胞24h和48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状降解条带。
5 Que使Bcl-2发生降解 HL-60是一种Bcl-2高表达的细胞系[7]，经Western blot分析，我们发现100μmol/L Que处理HL-60细胞24h或48h，均导致Bcl-2发生降解(图3)，与标准分子量Marker比较并计算得知：大片段相对分子质量为25×103，类似于Bcl-2α同工酶[8]；小片段为20×103。目前，它的功能还不得而知。
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图1 不同浓度Que作用于HL-60细胞24h的量效关系曲线
图2 流式细胞仪分析HL-60细胞凋亡情况
1：对照组；2：100μmol/L Que处理24h；3：100μmol/L Que处理48h
图3 Western blot分析Bcl-2降解情况
讨 论
本研究结果表明，Que在100 μmol/L时能有效诱导HL-60细胞发生凋亡，表现为：①形态学上细胞体积缩小、核浓缩致密及凋亡小体形成；②琼脂糖凝胶电泳有梯状条带出现；③流式细胞术检测有亚G1峰出现。并且这种凋亡的作用有时间和浓度依赖性，Western blot检测发现Que诱导HL-60细胞凋亡过程中，引发Bcl-2蛋白降解为相对分子质量为25×103和20×103的片段。
, http://www.100md.com
有关Que诱发Bcl-2降解的研究尚未见报道。Bcl-2的降解提示有相关蛋白酶的激活，凋亡发生是一个复杂的由caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，相对分子质量为20×103的降解产物的产生还不知是何种caspases激活所致[8]。不同类型细胞由于其生物学特性不同，发生凋亡时可能存在不同的蛋白酶激活，Bcl-2也可能作为多种蛋白酶的底物被降解。Que诱发HL-60细胞的Bcl-2发生降解，可能是激活了相关蛋白酶，具体机制有待进一步研究。
我们根据自己及其他实验室的实验结果提出：细胞氧化还原平衡状态的改变是导致细胞凋亡的重要原因，因此，抗氧化剂Que诱导HL-60细胞发生凋亡可能与它改变细胞氧化还原状态的平衡有关。
参考文献
1，Eiattar TMA, Virji AS. Modulating effect of resveratol and quercetin on oral cancer cell growth and proliferation. Anti-Cancer Drugs, 1999, 10:187-193.
, 百拇医药
2，Elia G, Santoro MG. Regulation of heat shock protein synthesis by quercetin in human erythroleukaemia cells. Biochem J, 1994, 300:201-209.
3，Uddin S, Chaudhry MA. Quercetin, a bioflavonoid, inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells. Biochem Mol Biol Int, 1995, 36:545-551.
4，王振华，李忌，郑荣梁，等. 菰帽悬钩子三萜糖酯的体外抗肿瘤活性. 中国药学杂志, 1999, 34:163-164.
5，Li X, Melamed MR, Darzynkiewicz Z. Detection of apoptosis and DNA strand breaks with fluorochromes of different color. Exp Cell Res, 1996, 222:28-37.
, 百拇医药
6，Grandgirard D, Studer E, Monney L, et al. Alphaviruses induce apoptosis in Bcl-2-overexpressing cells:evidence for a caspase-mediated, proteolytic inactivation of Bcl-2. EMBO J, 1998, 17:1268-1278.
7，Kawaii S, Tomono Y, Katase E, et al. Acridones as inducers of HL-60 cell differentiation. Leukemia Res, 1999, 23:263-269.
8，Yamamoto AM, Eloy L, Bach JF, et al. N-terminus cleavage of bcl-2 by a novel cellular non-ICE cysteine proteinase. Leukemia, 1998, 12:1467-1472.
9，Slater AFG, Nobel CSI, Orrenius S. The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271:59-62.
(收稿日期：1999-06-25), 百拇医药