钙预适应在心肌内源性保护机制中的应用
吴熹 王康 马旺扣 杨如松
摘 要 目的 观察钙离子变化对心肌保护作用的影响。方法 将56只雄性SD大鼠随机分为7组，A:缺血对照(IC)组；B：短暂无钙复钙灌流(CPC)组；C：短暂缺血复灌(IPC)组；D：短暂无钙复钙灌流十维拉帕米(CPC+Vera)组；E：短暂缺血复灌十维拉帕米(IPC+Vera)组；F：钙通道激动剂(Bay K8644)组；G：L-型钙通道阻滞剂[维拉帕米(verapamil)]组。实验中观察缺血前及再灌后左心功能，检测乳酸脱氢酶(LDH)等含量并辅以心肌超微结构观测。结果 与IC组相比，IPC组及CPC组左心室收缩压(LVSP)恢复显著好转，分别为[(79.6±2.3)%、(81.3±1.6)%和(45.1±2.2)%，P<0.05]，在IPC、CPC组中加入维拉帕米后，与IPC、CPC组相比较，LVSP等各项指标均提示心肌损伤明显加重(P<0.05)。Bay K8644组优于对照组(P<0.05)；而与IPC、CPC组相比较各项指标差异无显著性(P>0.05)。结论 (1)缺血及钙预适应可诱导出心肌内源性保护作用。(2)钙拮抗剂可通过减少钙内流而阻断缺血及钙预适应的心肌内源性保护作用。(3)增加钙内流可模拟IPC、CPC的心肌保护作用。
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关键词：缺血预适应 钙预适应 心肌保护 缺血再灌注
短暂反复缺血再灌注不会造成心肌损伤叠加，却可提高心肌对缺血缺氧耐受，那么短暂反复无钙复钙灌注是否对心肌有同样作用，我们对此进行了探讨，现将结果报道如下。材料与方法
1.实验对象及分组：200～250 g雄性SD大鼠共56只，分7组，离体心脏主动脉根部灌注10 min，心脏功能趋于稳定后进入各组实验流程。A.缺血对照(IC)组：正常灌流20 min，继而缺血再灌注(I/R)(缺血40 min+再灌注30 min)；B.短暂无钙复钙灌流(CPC)组：无钙灌流1 min，复钙灌流5 min，反复3次，继而I/R；C.短暂缺血复灌(IPC)组：缺血5 min，再灌15 min，继而I/R；D.短暂无钙复钙灌流+维拉帕米(CPC+Vera)组：2 μmol/L Verapamil在第1次循环前3 min至第3次循环结束以0.2 ml/min灌注，5 min冲洗后，继而I/R；E.短暂缺血复灌+维拉帕米(IPC+Vera)组：2 μmol/L Verapamil在缺血前5 min、再灌15 min时以0.2 ml/min灌注，5 min冲洗后，继而I/R；F.钙通道激动剂(Bay K8644)组：含3×10-2 μmol/L Bay K8644 K-H液先灌流10 min，然后以不含Bay K8644 K-H液冲洗10 min，继而I/R；G.L-型钙通道阻滞剂(Verapamil)组：K-H液及2 μmol/L Verapamil以0.2 ml/min灌注10 min，然后以正常K-H液冲洗10 min，继而I/R。
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2.实验指标：(1)左心室收缩压(LVSP)；(2)冠脉流量恢复率(CF)；(3)乳酸脱氢酶(LDH)测定；(4)ATP测定；(5)心肌细胞超微结构观察。
3.统计学处理：实验结果以均数±标准差(X±s)表示。统计学处理采用单因素方差分析(ANOVA)和q检验(newman-Keuls),用SAS 6.12版统计软件。
结 果
1.缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)、钙适应(calcium preconditioning,CPC)的心肌保护作用：IPC组与CPC组比较，各指标差异均无显著性(P>0.05).
2.维拉帕米阻断IPC、CPC的心肌保护作用：各项指标与IC组相比差异无显著性(P>0.05)，在IPC、CPC组中加入此剂量的维拉帕米后，其LVSP、CF、LDH、ATP及心肌细胞超微结构的变化与IPC、CPC组相比较，各项指标均提示心肌损伤明显加重(P<0.05)，表明维拉帕米可阻断IPC、CPC的心肌保护作用。
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3.Bay K8644模拟IPC、CPC的心肌保护作用：LVSP、CF恢复率、LDH、ATP及心肌细胞超微结构的变化与缺血对照组相比较，均显示出差异有显著性(P<0.05)；而与IPC、CPC组相比较各项差异无显著性(P>0.05)，提示此剂量的Bay K8644可模拟IPC、CPC的心肌保护作用。
4.心肌细胞超微结构观察：IPC、CPC组与IC组相比损伤明显减轻。Bay K8644组损伤较小，提示钙离子激动剂可模拟心肌保护作用。在IPC、CPC组中加入Verapamil，损伤明显加重，提示钙离子可能参与心肌内源性保护机制。
讨 论
1.心肌缺血预适应与钙适应：预适应可能是一种非特异性抗损伤机制。我们在本实验中以短暂无钙复钙灌流离体心脏来代替短暂缺血，结果仍可诱导出对抗缺血再灌注损伤的心肌保护作用。这种作用与IPC相比较，在左心功能指标、CF、ATP、LDH及心肌超微结构变化等方面差异均无显著性，表明钙适应和缺血预适应有相同的心肌保护作用。
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2.钙离子在IC、IPC和CPC中的变化：短暂缺血再灌注引起细胞钙增加的途径有：(1)质膜钙通道的转运，主要是L-型钙通道，使钙内流增加。(2)Na+-Ca2+交换，来源于Na+的电化学梯度。短时间缺血再灌注时，内线粒体等细胞器功能尚未严重受损，膜性结构尚完整，膜上离子泵损伤较轻，通过钙系统的调节可维持基本正常胞浆Ca2+水平。长时间缺血造成细胞膜结构和通透性不可逆受损。再灌注时氧自由基大量产生，引发脂质过氧化反应增强，加重了膜损伤，致使钙内流增加量较大。钙反常的主要损伤是无钙灌流期细胞膜外板和糖被表面的分离(两者由Ca2+连结在一起)。这为复钙灌流时钙内流提供了条件。短暂的无钙复钙灌流引起的钙内流增加量较小，而长时间则钙内流增加量较大。
3.钙离子短暂内流引起心肌内源性保护作用的机制：在本实验中，我们通过使用L-钙通道阻断剂阻断了IPC、CPC的短暂钙内流而阻断其内源性保护作用。用钙通道激动剂诱导出短暂钙内流，模拟IPC样内源性保护作用，证实Ca2+内流短暂增加参与了内源性保护机制。这种短暂的Ca2+内流在心肌内源性保护中有重要作用，它主要通过激活蛋白酶C(PKC)触发[1]。钙离子还可通过Gq蛋白-磷脂酶V(PLC)途径激活PKC。预适应时内源性物质释放后必须与相应受体结合并通过信息传递系统方能诱发出心肌内源性保护作用。由于细胞内游离钙浓度的增加对于PKC的转位和激活不可或缺，而PKC是联系多种心肌内源性保护因素的中心环节，因而我们认为短暂心肌缺血可引起内源性物质释放，并与相应受体结合导致钙离子内流短暂增加，后者激活PKC而引发心肌内源性保护作用。
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作者单位：吴熹(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
王康(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
马旺扣(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
杨如松(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
参考文献
[1]Brown JH, Martinson JH. Phosphoinositide generated second messengers in cardiac signal transduction. Trends Cardiovasc Med, 1992,2:209-213., 百拇医药
摘 要 目的 观察钙离子变化对心肌保护作用的影响。方法 将56只雄性SD大鼠随机分为7组，A:缺血对照(IC)组；B：短暂无钙复钙灌流(CPC)组；C：短暂缺血复灌(IPC)组；D：短暂无钙复钙灌流十维拉帕米(CPC+Vera)组；E：短暂缺血复灌十维拉帕米(IPC+Vera)组；F：钙通道激动剂(Bay K8644)组；G：L-型钙通道阻滞剂[维拉帕米(verapamil)]组。实验中观察缺血前及再灌后左心功能，检测乳酸脱氢酶(LDH)等含量并辅以心肌超微结构观测。结果 与IC组相比，IPC组及CPC组左心室收缩压(LVSP)恢复显著好转，分别为[(79.6±2.3)%、(81.3±1.6)%和(45.1±2.2)%，P<0.05]，在IPC、CPC组中加入维拉帕米后，与IPC、CPC组相比较，LVSP等各项指标均提示心肌损伤明显加重(P<0.05)。Bay K8644组优于对照组(P<0.05)；而与IPC、CPC组相比较各项指标差异无显著性(P>0.05)。结论 (1)缺血及钙预适应可诱导出心肌内源性保护作用。(2)钙拮抗剂可通过减少钙内流而阻断缺血及钙预适应的心肌内源性保护作用。(3)增加钙内流可模拟IPC、CPC的心肌保护作用。
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关键词：缺血预适应 钙预适应 心肌保护 缺血再灌注
短暂反复缺血再灌注不会造成心肌损伤叠加，却可提高心肌对缺血缺氧耐受，那么短暂反复无钙复钙灌注是否对心肌有同样作用，我们对此进行了探讨，现将结果报道如下。材料与方法
1.实验对象及分组：200～250 g雄性SD大鼠共56只，分7组，离体心脏主动脉根部灌注10 min，心脏功能趋于稳定后进入各组实验流程。A.缺血对照(IC)组：正常灌流20 min，继而缺血再灌注(I/R)(缺血40 min+再灌注30 min)；B.短暂无钙复钙灌流(CPC)组：无钙灌流1 min，复钙灌流5 min，反复3次，继而I/R；C.短暂缺血复灌(IPC)组：缺血5 min，再灌15 min，继而I/R；D.短暂无钙复钙灌流+维拉帕米(CPC+Vera)组：2 μmol/L Verapamil在第1次循环前3 min至第3次循环结束以0.2 ml/min灌注，5 min冲洗后，继而I/R；E.短暂缺血复灌+维拉帕米(IPC+Vera)组：2 μmol/L Verapamil在缺血前5 min、再灌15 min时以0.2 ml/min灌注，5 min冲洗后，继而I/R；F.钙通道激动剂(Bay K8644)组：含3×10-2 μmol/L Bay K8644 K-H液先灌流10 min，然后以不含Bay K8644 K-H液冲洗10 min，继而I/R；G.L-型钙通道阻滞剂(Verapamil)组：K-H液及2 μmol/L Verapamil以0.2 ml/min灌注10 min，然后以正常K-H液冲洗10 min，继而I/R。
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2.实验指标：(1)左心室收缩压(LVSP)；(2)冠脉流量恢复率(CF)；(3)乳酸脱氢酶(LDH)测定；(4)ATP测定；(5)心肌细胞超微结构观察。
3.统计学处理：实验结果以均数±标准差(X±s)表示。统计学处理采用单因素方差分析(ANOVA)和q检验(newman-Keuls),用SAS 6.12版统计软件。
结 果
1.缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)、钙适应(calcium preconditioning,CPC)的心肌保护作用：IPC组与CPC组比较，各指标差异均无显著性(P>0.05).
2.维拉帕米阻断IPC、CPC的心肌保护作用：各项指标与IC组相比差异无显著性(P>0.05)，在IPC、CPC组中加入此剂量的维拉帕米后，其LVSP、CF、LDH、ATP及心肌细胞超微结构的变化与IPC、CPC组相比较，各项指标均提示心肌损伤明显加重(P<0.05)，表明维拉帕米可阻断IPC、CPC的心肌保护作用。
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3.Bay K8644模拟IPC、CPC的心肌保护作用：LVSP、CF恢复率、LDH、ATP及心肌细胞超微结构的变化与缺血对照组相比较，均显示出差异有显著性(P<0.05)；而与IPC、CPC组相比较各项差异无显著性(P>0.05)，提示此剂量的Bay K8644可模拟IPC、CPC的心肌保护作用。
4.心肌细胞超微结构观察：IPC、CPC组与IC组相比损伤明显减轻。Bay K8644组损伤较小，提示钙离子激动剂可模拟心肌保护作用。在IPC、CPC组中加入Verapamil，损伤明显加重，提示钙离子可能参与心肌内源性保护机制。
讨 论
1.心肌缺血预适应与钙适应：预适应可能是一种非特异性抗损伤机制。我们在本实验中以短暂无钙复钙灌流离体心脏来代替短暂缺血，结果仍可诱导出对抗缺血再灌注损伤的心肌保护作用。这种作用与IPC相比较，在左心功能指标、CF、ATP、LDH及心肌超微结构变化等方面差异均无显著性，表明钙适应和缺血预适应有相同的心肌保护作用。
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2.钙离子在IC、IPC和CPC中的变化：短暂缺血再灌注引起细胞钙增加的途径有：(1)质膜钙通道的转运，主要是L-型钙通道，使钙内流增加。(2)Na+-Ca2+交换，来源于Na+的电化学梯度。短时间缺血再灌注时，内线粒体等细胞器功能尚未严重受损，膜性结构尚完整，膜上离子泵损伤较轻，通过钙系统的调节可维持基本正常胞浆Ca2+水平。长时间缺血造成细胞膜结构和通透性不可逆受损。再灌注时氧自由基大量产生，引发脂质过氧化反应增强，加重了膜损伤，致使钙内流增加量较大。钙反常的主要损伤是无钙灌流期细胞膜外板和糖被表面的分离(两者由Ca2+连结在一起)。这为复钙灌流时钙内流提供了条件。短暂的无钙复钙灌流引起的钙内流增加量较小，而长时间则钙内流增加量较大。
3.钙离子短暂内流引起心肌内源性保护作用的机制：在本实验中，我们通过使用L-钙通道阻断剂阻断了IPC、CPC的短暂钙内流而阻断其内源性保护作用。用钙通道激动剂诱导出短暂钙内流，模拟IPC样内源性保护作用，证实Ca2+内流短暂增加参与了内源性保护机制。这种短暂的Ca2+内流在心肌内源性保护中有重要作用，它主要通过激活蛋白酶C(PKC)触发[1]。钙离子还可通过Gq蛋白-磷脂酶V(PLC)途径激活PKC。预适应时内源性物质释放后必须与相应受体结合并通过信息传递系统方能诱发出心肌内源性保护作用。由于细胞内游离钙浓度的增加对于PKC的转位和激活不可或缺，而PKC是联系多种心肌内源性保护因素的中心环节，因而我们认为短暂心肌缺血可引起内源性物质释放，并与相应受体结合导致钙离子内流短暂增加，后者激活PKC而引发心肌内源性保护作用。
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作者单位：吴熹(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
王康(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
马旺扣(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
杨如松(210009南京铁道医学院心血管病防治中心)
参考文献
[1]Brown JH, Martinson JH. Phosphoinositide generated second messengers in cardiac signal transduction. Trends Cardiovasc Med, 1992,2:209-213., 百拇医药