氧化低密度脂蛋白、低氧和 5-HT 对血管平滑肌细胞5-HT2A 受体及胞内游离钙的影响
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中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
庞懿 许澍淮 薛全福
摘 要：目的 为探讨粥样硬化病变动脉对 5-HT 收缩反应增加的机制，观察与粥样硬化有关因子氧化低 密度脂蛋 白(oxLDL)、低氧、5-HT 对血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体及其基因表达，以及细胞 [Ca2+]i 的效应。 方法 分别将大鼠主动脉平滑肌细胞单独以 50 μg/ml oxLDL 培养 8 h， 2% 低氧处理 24 和 48 h， 10 μmol/L 5-HT 处理 30 min，放射配基结合分析测定 5-HT2A 受体； RT-PCR 和 Southern 杂交检测受体基因的 mRNA； 激光共聚焦扫描显微镜测单个细胞 [ Ca2+]i。 结果 经 oxLDL 、 低氧、 5-HT 处理， 血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体显著上调 (P<0 .01)； oxLDL 及低氧处理的受体基因的 mRNA 表达增加； oxLDL、 低氧处理后， 5-H T 刺激的血 管平滑肌细胞 [Ca2+]i 升高幅度显著加大 (P<0.05 及 P<0.01)。 结论 oxLDL、低氧、5-HT 引起血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体上调及细胞 [Ca2+ ]i 增加，可能是粥样硬化动脉对 5-HT 收缩反应增强的部分原因。
, 百拇医药
关键词：低氧 血管平滑肌细胞 氧化低密度脂蛋白 5-羟色 胺 5-HT2A 受体
据报道动脉血管病变或损伤的人和动物，其血管对 5-羟色胺 (5-HT) 的收缩反应增强， 血小板对 5-HT 的聚集反应增强[1～3]。 向冠心病患者冠状动脉内注入不引起正 常人冠状动脉收缩的低浓度 5-HT 可诱发冠脉痉挛[4]，在动脉粥样硬化动物实验 中也观察到类似现象[5]。已有工作表明血管、血小板对 5-HT 的高反应性与 5- HT2A 受体的变化有关[6～8]，但直接测定血管平滑肌细胞上 5-HT2A 受体 的报道很少。本实验观察体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，经氧化修饰的低密度 脂蛋白(oxLDL，模拟动脉粥样硬化的危险因素)、低氧(模拟缺血、缺氧)、5-HT(模拟缺血 和血管病变引起的局部5-HT升高)处理后，5-HT2A受体、受体基因的 mRNA 和细胞 内游离钙([Ca2+]i)的变化，以探讨血管平滑肌对 5-HT 高反应性的机制。
, 百拇医药
材料和方法
大鼠主动脉平滑肌细胞的培养 用贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，用光镜和免疫组化鉴定。培养3～8代用于实验。
oxLDL 的制备 取健康人血浆 200 ml，超速离心法制备 LDL 后，按下列步骤进行氧化：在含有 EDTA 的透析液(0.01% EDTA，0.02% NaN3，0.09% NaCl，0.02 mol/L Tris*HCl，pH7.4)中透析 24 h，再在无 EDTA 的 PBS 中透析48 h以除去 EDTA。接着在含 10 μmol/L C uSO4 的 PBS 中，37℃ 透析 48 h，最后在 200 μmol/L EDTA 的 PBS 液中透析 24 h以终止氧化，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤。荧光分光光度法测定过氧化脂质丙二醛(MD A)含量为 21.2 nmol/L (未经处理的 LDL 为 0.72 nmol/L)，表明 LDL 已被氧化修饰成 oxLDL。Lowry 法测定蛋白的含量。4℃保存备用。
, 百拇医药
低氧条件的确定 向自制的低氧箱内持续通入 2% O2、5% CO2、93% N 2 的混合气体，通气量为 1 L/min，持续通气 10 min后，调整至维持量 0.5 L/min ，持续通气，使箱内的氧分压维持在 1.84～2.48 kPa 范围内。
细胞 [Ca2+]i 的测定[9] 用 fluo3 作为荧光探针，37℃ 孵育细胞 40 min后，激光共聚焦扫描显微镜测定下列各组细胞在 10 μmol/L 5-HT 刺激下，细胞 [Ca2+]i 升高的峰值： (1) 未经处理 组(即单纯 5-HT 组)；(2) 低氧 24 h组；(3) 低氧 48 h组； (4) oxLDL 组： 50 μg/m l oxLDL 培养 8 h。
5-HT2A 受体的测定 将培养的血管平滑肌细胞按 2×105 个细胞/ml 接种到 24 孔培养板上，贴壁后，换无血 清培养基，培养 12 h，分组： (1) 对照组：不作任何处理； (2) 低氧 24 h组：将培养板放入低氧箱 24 h； (3) 低氧 48 h组：将培养板放入低氧箱 48 h； (4) oxLDL 组：向培养板每孔加入 50 μg/ml oxLDL 培养 8 h； (5) 5-HT 组：向培养板每孔加入 10 μ mol/L 5-HT 培养 30 min。放射配基结合分析前用冷 PBS 洗两次。以3H-Keta nserin 为标记配基，浓度范围为 0.5～4.0 nmol/L 共5个点，以 Ketanserin 为非标记配基，最后加孵育缓冲液至每孔总体积为 1 ml。37℃ 孵育细 胞 40 min后，立即弃孵育液，以冷 PBS 小心洗 4 次(注意勿使细胞悬起)，每孔加 0.5 ml 消化液(Triton-X100)，反复吹打，使贴壁细胞完全消化，将消化液全部移至玻璃纤维素滤膜上，置恒温箱中烤干后，将膜片置液闪杯中，加 5 ml 闪烁液，液闪计数仪测定总结合值和非特异结合值。
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特异结合值=总结合值-非特异结合值
Scatchard 作图求受体的最大结合容量(Bmax)及平衡解离常数(Kd)。
5-HT2A 受体基因表达的检测 用 β-actin 作为内对照，RT-PCR 结合 Southern 杂交的方法，检测 5-HT2A 受 体基因的 mRNA 表达。实验分组同 5-HT2A 受体的测定。
细胞总 RNA 的提取：采用一步法[10] 提取细胞总RNA， 紫外分光光度法测定 RNA 的含量和纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的完整性。
逆转录反应：2 μl(5 μg) 总RNA，20U Rnasin， 10U AMV 逆转录酶， 4μl 5×逆转 录缓冲液，1 μl Oiligo(dt) 15 引物，2 μl dNTP， DEPC 水补足总体积 20μl，42℃ 反应 1 h，95℃ 灭活 2 min。-80℃ 冰箱内存放。
, 百拇医药
RT-PCR： 合成的 5-HT2A 受体和 β-actin 的引物序列分别为：
5-HT2A 受体上游引物： 5′-CAGTCCATCAGCA-
ATGAGCAAAAGG-3′
5-HT2A 受体下游引物： 5′-TGTTTTCCTTGTA-
CTGACACTGAAT-3′
β-actin 上游引物： 5′-CAACCGTGAAAAGA-
TGACCCAGATC-3′
β-actin 下游引物： 5′-TTTAATGTCACGCA-
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CGATTTCCCTC-3′
2 μl 逆转录产物，5 μl 10×PCR 反应缓冲液，1U Taq 酶，5 μl 引物，高压消毒的去离子水补足体积为 50 μl，加一定量的石蜡油覆盖。95℃ 预变性 5 min后，进行下列循环：95℃变性 55 秒，56℃退火 50 秒，72℃ 延伸 55 秒。共循环 30 圈，最后充分延伸 10 min。
Southern 杂交：取 10 μl PCR 反应产物，1.5% 的琼脂糖凝胶电泳，转至尼龙膜上。68 ℃预杂交 12 h。用合成的寡核苷酸作为探针：(5-HT2A 受体基因探针序列为：5 ′-ACAAACACATTGAGCAGGGC-3′，β-actin 探针序列为：5′-AGGATCTTCATGAGGTACTC- 3′)，末端标记，65℃杂交 16 h，洗膜，放射自显影。扫描灰度值，以 5-HT2A 受体对 β-actin 灰度的比值作为半定量结果。
, 百拇医药
统计学处理 结果用均数 ± 标准差(X±s)表示，t 检验统计组间差异显著性。
结 果
平滑肌细胞 [Ca2+]i 的变化 以 10 μmol/L 5-HT 刺激平滑肌细胞即刻，细胞 [Ca2+]i 较静息时升高 2.8 倍。预先分别用低氧处理平滑肌细胞 24 和 48 h或与 oxLDL 共培养 8 h，再以 5-HT 刺 激即刻，则细胞 [Ca2+]i 升高幅度较 5-HT 直接刺激未经以上处理的平滑肌细胞 [Ca2+]i 升高幅度显著增加(P<0.05 或 P<0.01)(图1)。
图 1 低氧、oxLDL 对 5-HT 刺激的平滑肌细胞[Ca2+]i 的影响
, 百拇医药
Fig 1 Effects of hypoxia, oxLDL on [Ca2+]i of smooth muscle cell challenged with 5-HT * P<0.05, ** P<0.01 compared with 5-HT
Vertical axis indicates 5-HT-induced smooth muscle cell [Ca2 +]i increased by % (using the level of rest cell [Ca2+]i as 100%)
平滑肌细胞 5-HT2A 受体的变化 经低氧分别处理 24 和 48 h、oxLDL 培养 8 h、5-HT 处理 30 min，平滑肌细胞 5-HT 2A 受体 Bmax 明显升高(附表)。所有实验组，受体对配基的亲和力未见明显变化(图2) 。
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图 2 血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体放射配基结合分析的饱和曲线
Fig 2 The saturation curve of vascular smooth muscle cell 5-HT2A recepto r radiobinding assay
附表 低氧、oxLDL 和 5-HT 对培养大鼠主动脉平滑肌细胞 5-HT2A 受体密度的影响
Table Effects of hypoxia, oxLDL, and 5-HT on 5-HT 2A receptor density
of cultured rat aortic smooth muscle cells
, 百拇医药
Groups
n
Bmax (fmol/2×105 cells)
Kd(nmol/L)
Control
5
224.8±13.1
1.42±0.20
Hypoxia 24 h
3
351.7±22.3*
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1.43±0.14
Hypoxia 48 h
3
512.1±54.1*
1.45±0.03
oxLDL 8 h
3
285.1±10.5*
1.18±0.08
5-HT 30 min
3
, 百拇医药 414.7±88.3*
2.50±0.91
* P<0.01 compared with control
平滑肌细胞 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达 扫描 Southern 杂交放射自显影图象的灰度，以 5-HT2A 受体与 β-ac tin 受体灰度比值表示 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达强度，对照组 5-HT2A /β-actin 比值为 1.00，oxLDL 组为 1.64， 5-HT 组为 0.84，低氧 24 h组为 2.20，低氧 48 h组为 2.40 (两次实验结果重复性好)，表明低氧 24 和 48 h及 oxLDL 培养 8 h，平滑肌细胞 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达明显增加， 5-HT 组其受体基因的 mRNA 水平未见明显变化(图3)。
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图 3 5-HT2A 受体 mRNA 水平的 RT-PCR 与 Southern 杂交检测结果
Fig 3 The results of 5-HT2A receptor mRNA level estimated by RT-PC R and Southern blot
A. RT-PCR： electrophoretic analysis of amplified products of 5-HT2A and β-actin
1. PBR 322-Hinf1 marker; 2. β-actin； 3. 5-HT2A receptor
B. Southern blot
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讨 论
发生粥样硬化病变的冠状动脉和主动脉对 5-HT 收缩反应敏感已有较多报道[1，11] ，但其机制尚不十分清楚。本实验观察培养大鼠主动脉平滑肌细胞在某些与动脉粥样硬化和缺血相关因子作用下，其[Ca2+]i 及 5-HT2A 受体的变化，探讨血管对 5-HT 高收缩反应性机制。已知 oxLDL 是动脉粥样硬化的独立危险因子，本实验将 ox LDL 与平滑肌细胞共培养 8 h，再用 5-HT 刺激，细胞 [Ca2+]i 升高幅度较 单独用 5-HT 刺激时加大；还观察到 oxLDL可使 5-HT2A 受体结合位点增加，受体基因的 mRNA表达增强，提示 oxLDL 引起的 5-HT2A 受体上调和 5-HT2A 受体 信号转导加强，是血管平滑肌对 5-HT 收缩反应增强的原因之一。在结扎左冠状动脉造成 心 肌梗塞的大鼠，冠状动脉对 5-HT 的收缩反应也明显增强[12]。为了模拟整体缺 血状态，本实验将平滑肌细胞置 2% 低氧条件下培养 24 和 48 h，结果显示 5-HT 刺 激时细胞 [Ca2+]i 较未经低氧处理的细胞显著升高， 5-HT2A 受体结合 位点也明显增加，受体基因的 mRNA 表达增强，且这些变化的程度随低氧处理时间延长而加 剧，提示缺血引起 5-HT2A 受体及其信号转导的变化同样也是血管平滑肌对 5-HT 收缩反应增强的原因之一。据报道低氧可引起冠状动脉、主动脉等血管平滑肌细胞的分裂 和增殖，以及诱导血小板源生长因子、肾上腺素、内皮素-1 等受体基因表达增强，并认为 上述受体基因表达增强，是由于低氧时某些核转录因子的脱氧状态所致，脱氧状态的核转录 因子可以作为第二信使，刺激并提高受体基因的 mRNA 转录水平[13]。但至今鲜见 低氧对 5-HT2A 受体影响的报道。本实验表明 5-HT 作为一种促分裂原[14] ，同样使血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体上调，但受体基因的 mRNA 表达无明显变 化，说明 5-HT 使受体上调机制与 oxLDL 和低氧不同，即并非通过增加受体的合成，而可 能是合成后调节机制起作用。
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基金项目：国家自然科学基金 (39470302) 资助 Supported by the National Nat ural
Sciences Foundation of China (39470302)
作者简介：许澍淮 Corresponding author Tel: 01065296476, Fax:01065256546,E-mail: j zwang @public.fhnet.cn.net
作者单位：庞懿(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
许澍淮(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
薛全福(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
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参考文献：
[1] Wiernsperger NF. Serotonin, 5-HT2 receptors, and their blockade by naftidrof uryl: a targeted therapy of vascular disease. J Cardiovasc Pharmacol, 1994, 23( supple 3): S37-S44
[2] Hirofumi T, Tomoike H, Mitsuoka W, et al. Hyperreactivity of aortic smooth muscle to serotonin is related to the presence of atheroma in watanabe heritable hyperlipoidemic rabbits. Cardiovasc Res, 1993, 27: 2164-2169
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[3] Mitsuoka W, Egashira S, Tagawa H, et al. Augmentation of coronary arterial responsiveness to serotonin at the site of X-ray-induced intimal thickening in miniature pigs. Cardiovasc Res, 1995, 30: 246-254
[4] McFadden EP, Clarke JG, Davies GJ, et al. Effect of intracoronary serotonin on coronary vessels in patients with stable angina and patients with variant an gina. N Engl J Med, 1991, 324: 648-654
[5] Miwa Y, Hirata KI, Matsuda Y, et al. Augmented receptor-mediated Ca2+ mobilization causes supersensitivity of contractile response to serotonin in at herosclerosis arteries. Circ Res, 1994, 75: 1092-1102
, 百拇医药
[6] Fujiman T, Shiba C. Augmented response to 5-HT2A receptor mediated vasoc onstrictions in atherosclerotic rabbit common carotid arteries. J Cardiovasc Ph armacol, 1995, 26: 503-510
[7] 庞 懿，许澍淮，斯 琴， 等. 5-HT2A 受体与心肌缺血再灌注损伤及腹蛇抗栓酶 的保护作用. 基础医学与临床， 1998， 18(2)： 38-42
[8] 杨丽明， 林松柏， 庞 懿， 等. 冠心病患者血小板 5-羟色胺2A 受体变化及 运动试验的影响. 中国医学科学院学报， 1997， 19(5)： 337-341
[9] Elizabeth IP, Maurice BH. Temporal and spatial resolution of Ca2+ realeas e and influx in human neutrophils using confocal laser scanning mode. Biochem B iophys Res Commun, 1996, 226(1): 109-113
, 百拇医药
[10] 王申五主编. 基因诊断技术. 北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1992 . 46
[11] Kadokami T, Egashira K, Kuwata K, et al. Altered serotonin receptor subtype s mediated coronary microvascular hyperreactivity in pigs with chronic inhibitio n of nitric oxide synthesis. Circulation, 1996, 94: 182-188
[12] Stassen FRM， Faggi GE, Leenders PJA, et al. Coronary arterial hyperreactiv it y and mesenteric arterial hyporeactivity after myocardial infarction in the rat. J Cardiovasc Pharmacol, 1997, 29(6): 780-788
[13] Helfman T, Falanga V. Gene expression in low oxygen tension. Am J Med Sci, 199 3, 306(1): 37-42
[14] Fanbury BL, Lee SL. A new role for an old molecule: serotonin as a mitogen. Am J Physiol, 1997, 272: L795-L806, 百拇医药
摘 要：目的 为探讨粥样硬化病变动脉对 5-HT 收缩反应增加的机制，观察与粥样硬化有关因子氧化低 密度脂蛋 白(oxLDL)、低氧、5-HT 对血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体及其基因表达，以及细胞 [Ca2+]i 的效应。 方法 分别将大鼠主动脉平滑肌细胞单独以 50 μg/ml oxLDL 培养 8 h， 2% 低氧处理 24 和 48 h， 10 μmol/L 5-HT 处理 30 min，放射配基结合分析测定 5-HT2A 受体； RT-PCR 和 Southern 杂交检测受体基因的 mRNA； 激光共聚焦扫描显微镜测单个细胞 [ Ca2+]i。 结果 经 oxLDL 、 低氧、 5-HT 处理， 血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体显著上调 (P<0 .01)； oxLDL 及低氧处理的受体基因的 mRNA 表达增加； oxLDL、 低氧处理后， 5-H T 刺激的血 管平滑肌细胞 [Ca2+]i 升高幅度显著加大 (P<0.05 及 P<0.01)。 结论 oxLDL、低氧、5-HT 引起血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体上调及细胞 [Ca2+ ]i 增加，可能是粥样硬化动脉对 5-HT 收缩反应增强的部分原因。
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关键词：低氧 血管平滑肌细胞 氧化低密度脂蛋白 5-羟色 胺 5-HT2A 受体
据报道动脉血管病变或损伤的人和动物，其血管对 5-羟色胺 (5-HT) 的收缩反应增强， 血小板对 5-HT 的聚集反应增强[1～3]。 向冠心病患者冠状动脉内注入不引起正 常人冠状动脉收缩的低浓度 5-HT 可诱发冠脉痉挛[4]，在动脉粥样硬化动物实验 中也观察到类似现象[5]。已有工作表明血管、血小板对 5-HT 的高反应性与 5- HT2A 受体的变化有关[6～8]，但直接测定血管平滑肌细胞上 5-HT2A 受体 的报道很少。本实验观察体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，经氧化修饰的低密度 脂蛋白(oxLDL，模拟动脉粥样硬化的危险因素)、低氧(模拟缺血、缺氧)、5-HT(模拟缺血 和血管病变引起的局部5-HT升高)处理后，5-HT2A受体、受体基因的 mRNA 和细胞 内游离钙([Ca2+]i)的变化，以探讨血管平滑肌对 5-HT 高反应性的机制。
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材料和方法
大鼠主动脉平滑肌细胞的培养 用贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，用光镜和免疫组化鉴定。培养3～8代用于实验。
oxLDL 的制备 取健康人血浆 200 ml，超速离心法制备 LDL 后，按下列步骤进行氧化：在含有 EDTA 的透析液(0.01% EDTA，0.02% NaN3，0.09% NaCl，0.02 mol/L Tris*HCl，pH7.4)中透析 24 h，再在无 EDTA 的 PBS 中透析48 h以除去 EDTA。接着在含 10 μmol/L C uSO4 的 PBS 中，37℃ 透析 48 h，最后在 200 μmol/L EDTA 的 PBS 液中透析 24 h以终止氧化，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤。荧光分光光度法测定过氧化脂质丙二醛(MD A)含量为 21.2 nmol/L (未经处理的 LDL 为 0.72 nmol/L)，表明 LDL 已被氧化修饰成 oxLDL。Lowry 法测定蛋白的含量。4℃保存备用。
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低氧条件的确定 向自制的低氧箱内持续通入 2% O2、5% CO2、93% N 2 的混合气体，通气量为 1 L/min，持续通气 10 min后，调整至维持量 0.5 L/min ，持续通气，使箱内的氧分压维持在 1.84～2.48 kPa 范围内。
细胞 [Ca2+]i 的测定[9] 用 fluo3 作为荧光探针，37℃ 孵育细胞 40 min后，激光共聚焦扫描显微镜测定下列各组细胞在 10 μmol/L 5-HT 刺激下，细胞 [Ca2+]i 升高的峰值： (1) 未经处理 组(即单纯 5-HT 组)；(2) 低氧 24 h组；(3) 低氧 48 h组； (4) oxLDL 组： 50 μg/m l oxLDL 培养 8 h。
5-HT2A 受体的测定 将培养的血管平滑肌细胞按 2×105 个细胞/ml 接种到 24 孔培养板上，贴壁后，换无血 清培养基，培养 12 h，分组： (1) 对照组：不作任何处理； (2) 低氧 24 h组：将培养板放入低氧箱 24 h； (3) 低氧 48 h组：将培养板放入低氧箱 48 h； (4) oxLDL 组：向培养板每孔加入 50 μg/ml oxLDL 培养 8 h； (5) 5-HT 组：向培养板每孔加入 10 μ mol/L 5-HT 培养 30 min。放射配基结合分析前用冷 PBS 洗两次。以3H-Keta nserin 为标记配基，浓度范围为 0.5～4.0 nmol/L 共5个点，以 Ketanserin 为非标记配基，最后加孵育缓冲液至每孔总体积为 1 ml。37℃ 孵育细 胞 40 min后，立即弃孵育液，以冷 PBS 小心洗 4 次(注意勿使细胞悬起)，每孔加 0.5 ml 消化液(Triton-X100)，反复吹打，使贴壁细胞完全消化，将消化液全部移至玻璃纤维素滤膜上，置恒温箱中烤干后，将膜片置液闪杯中，加 5 ml 闪烁液，液闪计数仪测定总结合值和非特异结合值。
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特异结合值=总结合值-非特异结合值
Scatchard 作图求受体的最大结合容量(Bmax)及平衡解离常数(Kd)。
5-HT2A 受体基因表达的检测 用 β-actin 作为内对照，RT-PCR 结合 Southern 杂交的方法，检测 5-HT2A 受 体基因的 mRNA 表达。实验分组同 5-HT2A 受体的测定。
细胞总 RNA 的提取：采用一步法[10] 提取细胞总RNA， 紫外分光光度法测定 RNA 的含量和纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的完整性。
逆转录反应：2 μl(5 μg) 总RNA，20U Rnasin， 10U AMV 逆转录酶， 4μl 5×逆转 录缓冲液，1 μl Oiligo(dt) 15 引物，2 μl dNTP， DEPC 水补足总体积 20μl，42℃ 反应 1 h，95℃ 灭活 2 min。-80℃ 冰箱内存放。
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RT-PCR： 合成的 5-HT2A 受体和 β-actin 的引物序列分别为：
5-HT2A 受体上游引物： 5′-CAGTCCATCAGCA-
ATGAGCAAAAGG-3′
5-HT2A 受体下游引物： 5′-TGTTTTCCTTGTA-
CTGACACTGAAT-3′
β-actin 上游引物： 5′-CAACCGTGAAAAGA-
TGACCCAGATC-3′
β-actin 下游引物： 5′-TTTAATGTCACGCA-
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CGATTTCCCTC-3′
2 μl 逆转录产物，5 μl 10×PCR 反应缓冲液，1U Taq 酶，5 μl 引物，高压消毒的去离子水补足体积为 50 μl，加一定量的石蜡油覆盖。95℃ 预变性 5 min后，进行下列循环：95℃变性 55 秒，56℃退火 50 秒，72℃ 延伸 55 秒。共循环 30 圈，最后充分延伸 10 min。
Southern 杂交：取 10 μl PCR 反应产物，1.5% 的琼脂糖凝胶电泳，转至尼龙膜上。68 ℃预杂交 12 h。用合成的寡核苷酸作为探针：(5-HT2A 受体基因探针序列为：5 ′-ACAAACACATTGAGCAGGGC-3′，β-actin 探针序列为：5′-AGGATCTTCATGAGGTACTC- 3′)，末端标记，65℃杂交 16 h，洗膜，放射自显影。扫描灰度值，以 5-HT2A 受体对 β-actin 灰度的比值作为半定量结果。
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统计学处理 结果用均数 ± 标准差(X±s)表示，t 检验统计组间差异显著性。
结 果
平滑肌细胞 [Ca2+]i 的变化 以 10 μmol/L 5-HT 刺激平滑肌细胞即刻，细胞 [Ca2+]i 较静息时升高 2.8 倍。预先分别用低氧处理平滑肌细胞 24 和 48 h或与 oxLDL 共培养 8 h，再以 5-HT 刺 激即刻，则细胞 [Ca2+]i 升高幅度较 5-HT 直接刺激未经以上处理的平滑肌细胞 [Ca2+]i 升高幅度显著增加(P<0.05 或 P<0.01)(图1)。
图 1 低氧、oxLDL 对 5-HT 刺激的平滑肌细胞[Ca2+]i 的影响
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Fig 1 Effects of hypoxia, oxLDL on [Ca2+]i of smooth muscle cell challenged with 5-HT * P<0.05, ** P<0.01 compared with 5-HT
Vertical axis indicates 5-HT-induced smooth muscle cell [Ca2 +]i increased by % (using the level of rest cell [Ca2+]i as 100%)
平滑肌细胞 5-HT2A 受体的变化 经低氧分别处理 24 和 48 h、oxLDL 培养 8 h、5-HT 处理 30 min，平滑肌细胞 5-HT 2A 受体 Bmax 明显升高(附表)。所有实验组，受体对配基的亲和力未见明显变化(图2) 。
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图 2 血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体放射配基结合分析的饱和曲线
Fig 2 The saturation curve of vascular smooth muscle cell 5-HT2A recepto r radiobinding assay
附表 低氧、oxLDL 和 5-HT 对培养大鼠主动脉平滑肌细胞 5-HT2A 受体密度的影响
Table Effects of hypoxia, oxLDL, and 5-HT on 5-HT 2A receptor density
of cultured rat aortic smooth muscle cells
, 百拇医药
Groups
n
Bmax (fmol/2×105 cells)
Kd(nmol/L)
Control
5
224.8±13.1
1.42±0.20
Hypoxia 24 h
3
351.7±22.3*
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1.43±0.14
Hypoxia 48 h
3
512.1±54.1*
1.45±0.03
oxLDL 8 h
3
285.1±10.5*
1.18±0.08
5-HT 30 min
3
, 百拇医药 414.7±88.3*
2.50±0.91
* P<0.01 compared with control
平滑肌细胞 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达 扫描 Southern 杂交放射自显影图象的灰度，以 5-HT2A 受体与 β-ac tin 受体灰度比值表示 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达强度，对照组 5-HT2A /β-actin 比值为 1.00，oxLDL 组为 1.64， 5-HT 组为 0.84，低氧 24 h组为 2.20，低氧 48 h组为 2.40 (两次实验结果重复性好)，表明低氧 24 和 48 h及 oxLDL 培养 8 h，平滑肌细胞 5-HT2A 受体基因的 mRNA 表达明显增加， 5-HT 组其受体基因的 mRNA 水平未见明显变化(图3)。
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图 3 5-HT2A 受体 mRNA 水平的 RT-PCR 与 Southern 杂交检测结果
Fig 3 The results of 5-HT2A receptor mRNA level estimated by RT-PC R and Southern blot
A. RT-PCR： electrophoretic analysis of amplified products of 5-HT2A and β-actin
1. PBR 322-Hinf1 marker; 2. β-actin； 3. 5-HT2A receptor
B. Southern blot
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讨 论
发生粥样硬化病变的冠状动脉和主动脉对 5-HT 收缩反应敏感已有较多报道[1，11] ，但其机制尚不十分清楚。本实验观察培养大鼠主动脉平滑肌细胞在某些与动脉粥样硬化和缺血相关因子作用下，其[Ca2+]i 及 5-HT2A 受体的变化，探讨血管对 5-HT 高收缩反应性机制。已知 oxLDL 是动脉粥样硬化的独立危险因子，本实验将 ox LDL 与平滑肌细胞共培养 8 h，再用 5-HT 刺激，细胞 [Ca2+]i 升高幅度较 单独用 5-HT 刺激时加大；还观察到 oxLDL可使 5-HT2A 受体结合位点增加，受体基因的 mRNA表达增强，提示 oxLDL 引起的 5-HT2A 受体上调和 5-HT2A 受体 信号转导加强，是血管平滑肌对 5-HT 收缩反应增强的原因之一。在结扎左冠状动脉造成 心 肌梗塞的大鼠，冠状动脉对 5-HT 的收缩反应也明显增强[12]。为了模拟整体缺 血状态，本实验将平滑肌细胞置 2% 低氧条件下培养 24 和 48 h，结果显示 5-HT 刺 激时细胞 [Ca2+]i 较未经低氧处理的细胞显著升高， 5-HT2A 受体结合 位点也明显增加，受体基因的 mRNA 表达增强，且这些变化的程度随低氧处理时间延长而加 剧，提示缺血引起 5-HT2A 受体及其信号转导的变化同样也是血管平滑肌对 5-HT 收缩反应增强的原因之一。据报道低氧可引起冠状动脉、主动脉等血管平滑肌细胞的分裂 和增殖，以及诱导血小板源生长因子、肾上腺素、内皮素-1 等受体基因表达增强，并认为 上述受体基因表达增强，是由于低氧时某些核转录因子的脱氧状态所致，脱氧状态的核转录 因子可以作为第二信使，刺激并提高受体基因的 mRNA 转录水平[13]。但至今鲜见 低氧对 5-HT2A 受体影响的报道。本实验表明 5-HT 作为一种促分裂原[14] ，同样使血管平滑肌细胞 5-HT2A 受体上调，但受体基因的 mRNA 表达无明显变 化，说明 5-HT 使受体上调机制与 oxLDL 和低氧不同，即并非通过增加受体的合成，而可 能是合成后调节机制起作用。
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基金项目：国家自然科学基金 (39470302) 资助 Supported by the National Nat ural
Sciences Foundation of China (39470302)
作者简介：许澍淮 Corresponding author Tel: 01065296476, Fax:01065256546,E-mail: j zwang @public.fhnet.cn.net
作者单位：庞懿(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
许澍淮(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
薛全福(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
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参考文献：
[1] Wiernsperger NF. Serotonin, 5-HT2 receptors, and their blockade by naftidrof uryl: a targeted therapy of vascular disease. J Cardiovasc Pharmacol, 1994, 23( supple 3): S37-S44
[2] Hirofumi T, Tomoike H, Mitsuoka W, et al. Hyperreactivity of aortic smooth muscle to serotonin is related to the presence of atheroma in watanabe heritable hyperlipoidemic rabbits. Cardiovasc Res, 1993, 27: 2164-2169
, http://www.100md.com
[3] Mitsuoka W, Egashira S, Tagawa H, et al. Augmentation of coronary arterial responsiveness to serotonin at the site of X-ray-induced intimal thickening in miniature pigs. Cardiovasc Res, 1995, 30: 246-254
[4] McFadden EP, Clarke JG, Davies GJ, et al. Effect of intracoronary serotonin on coronary vessels in patients with stable angina and patients with variant an gina. N Engl J Med, 1991, 324: 648-654
[5] Miwa Y, Hirata KI, Matsuda Y, et al. Augmented receptor-mediated Ca2+ mobilization causes supersensitivity of contractile response to serotonin in at herosclerosis arteries. Circ Res, 1994, 75: 1092-1102
, 百拇医药
[6] Fujiman T, Shiba C. Augmented response to 5-HT2A receptor mediated vasoc onstrictions in atherosclerotic rabbit common carotid arteries. J Cardiovasc Ph armacol, 1995, 26: 503-510
[7] 庞 懿，许澍淮，斯 琴， 等. 5-HT2A 受体与心肌缺血再灌注损伤及腹蛇抗栓酶 的保护作用. 基础医学与临床， 1998， 18(2)： 38-42
[8] 杨丽明， 林松柏， 庞 懿， 等. 冠心病患者血小板 5-羟色胺2A 受体变化及 运动试验的影响. 中国医学科学院学报， 1997， 19(5)： 337-341
[9] Elizabeth IP, Maurice BH. Temporal and spatial resolution of Ca2+ realeas e and influx in human neutrophils using confocal laser scanning mode. Biochem B iophys Res Commun, 1996, 226(1): 109-113
, 百拇医药
[10] 王申五主编. 基因诊断技术. 北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1992 . 46
[11] Kadokami T, Egashira K, Kuwata K, et al. Altered serotonin receptor subtype s mediated coronary microvascular hyperreactivity in pigs with chronic inhibitio n of nitric oxide synthesis. Circulation, 1996, 94: 182-188
[12] Stassen FRM， Faggi GE, Leenders PJA, et al. Coronary arterial hyperreactiv it y and mesenteric arterial hyporeactivity after myocardial infarction in the rat. J Cardiovasc Pharmacol, 1997, 29(6): 780-788
[13] Helfman T, Falanga V. Gene expression in low oxygen tension. Am J Med Sci, 199 3, 306(1): 37-42
[14] Fanbury BL, Lee SL. A new role for an old molecule: serotonin as a mitogen. Am J Physiol, 1997, 272: L795-L806, 百拇医药