环境对产毒性大肠杆菌定居因子表达的调控
陈 清 王雅贤 俞守义 申 洪
摘 要 探讨几种环境因素对产毒性大肠杆菌(ETEC)两种主要定居因子CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响。结果表明细菌的生长期以及细胞外渗透压、pH、气体组成的不同均可不同程度地影响CFA Ⅰ和CFAⅡ的表达，其中渗透压对两种定居因子的影响有所不同。研究结果提示ETEC的CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达与环境适应有关。
关键词：产毒性大肠杆菌 定居因子 环境 表达
定居因子(colonization factor antigens,CFAs)是产毒性大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一，缺失CFAs的ETEC虽然仍可产生肠毒素，但不具致病力。已知CFAs在25℃以下不表达，在37℃时表达最高，但其它环境因素对CFAs表达的影响尚不清楚。本文观察了培养时间、pH、渗透浓度、气体成分等环境因素对ETEC的主要定居因子CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的调控。
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1 材料与方法
1.1 菌株 表达CFA Ⅰ的E44813及表达CFA Ⅱ的E44815ETEC标准株购自北京生物药物制品鉴定所。
1.2 细菌培养
培养基：LB、K培养基[1]及CFA培养基，CFA平板含1%水解酪蛋白(Oxoid产品)、0.15%酵母粉(Oxiod产品)、0.005%MgSO4、0.005%MnCl2、2%琼脂粉。不同pH的培养环境是将LB培养基用NaOH或HCl调pH至4.0～10.0。不同渗透浓度的培养基是在K培养基基础上加入不同摩尔浓度的NaCl或蔗糖而成，厌氧培养条件为N280%、H210%和CO210%。
不同环境条件下细菌的培养：细菌在3mlLB肉汤中37℃生长至对数期中期(6小时)，3000rmp离心，用PBS(pH7.2)洗3次，重悬于3ml不同环境条件的新鲜培养基，继续培养12小时。
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1.3 CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的检测 用ELISA法，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ(CS3)兔抗血清由军事医学科学院张兆山教授惠赠，血凝效价在1∶100以上。经培养的细菌在检测前均用PBS把OD560nm值调整为0.200(约1×108CFU)，10倍系列稀释作滴度检测。
1.4 肠片粘附试验 正常豚鼠用乙醚麻醉后解剖，取出回肠，用手术刀纵向切开，用PBS清洗后切成0.5cm×2cm的片段，置RKT缓冲液[2]中备用。ETEC菌株在37℃培养18小时后，离心，用PBS洗，重悬，根据OD560nm值把细菌密度调至1×108CFU/ml左右，取0.1ml加入0.9ml不同pH的培养基中，并加入甘露糖使终浓度为1%，马上放入肠片，室温作用20分钟。用PBS洗3次，2.5%戊二醛固定。作扫描电镜观察，每片肠片随机计数30个视野(×2000)，计数粘附的细菌数。
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1.5 小肠上皮细胞粘附试验 豚鼠小肠上皮细胞的分离：参照Izhar等[3]的方法进行。细胞浓度调整为1×107CFU，备用。取0.1ml细菌悬液加入0.8ml不同pH的培养基中，马上加入0.1ml细胞悬液和0.1ml甘露糖，室温作用20分钟，吸附于醋酸纤维膜上，乙醇梯度脱水，作扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 不同培养基对CFA Ⅰ及CFA Ⅱ表达的影响 K培养基+0.1molNaCl渗透浓度约为270mOsm，与CFA和LB培养基渗透浓度相似。E44813和E44815在这3种液体培养基中培养后CFAs的OD值虽然以CFA培养基的较高，但滴度相似，固体培养基培养时CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的OD值高于液体培养基培养时2倍左右，滴度高1个剂量级，尤以CFA培养基为明显。
2.2 培养时间对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响 E44813和E44815在LB肉汤中培养至3小时已经可以检测到CFA，滴度为1：100，培养至8小时，CFAⅠ和CFAⅡ的滴度均达1∶100000，继续延长培养时间至12、16、20、24小时，其滴度不再增加，最大OD值也接近，说明CFA的表达主要在细菌生长对数期。
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2.3 pH环境对CFA Ⅰ及CFA Ⅱ表达的影响 观察了5.0、7.0及8.5三个pH梯度对E44813和E44815表达CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的影响。在3种pH培养条件下，CFA Ⅰ的滴度均为1∶100000，但OD值有差异，最高OD值在这3种条件下分别为0.456、0.500和0.533。CFA Ⅱ在3种pH培养条件下滴度分别为1∶1000、1∶100000和1∶100000，OD值也以pH为8.5时最高。
2.4 渗透压对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
CFA Ⅰ和CFA Ⅱ在受渗透压影响方面是不同的。在NaCl≤0.3mol的渗透浓度下，CFA Ⅱ的表达随渗透浓度的增加而减弱，但当渗透浓度为0.5molNaCl时，CFA Ⅱ的表达反而增加，在0.7molNaCl培养条件下，CFA Ⅱ的表达也高于0.3molNaCl环境，对蔗糖的反应也相似。提示过高或过低的渗透压都是促进CFA Ⅱ表达的环境信号。
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CFA Ⅰ在0.7molNaCl或0.6mol蔗糖培养环境下表达最高，随培养基渗透浓度的降低而减少。可见高渗透压是促进CFA Ⅰ表达的环境信号。
图1 渗透浓度对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
(K=K培养基，0.1mNa=K+0.1molNaCl,0.1ms=K+0.1molsucrose,余类推纵坐标为OD值或滴度对数)
2.5 培养环境气体条件对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响 ETEC的生长密度与培养的气体环境有关，37℃培养18h细菌密度以5%CO2>10%CO2>厌氧>空气>20%CO2。CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达受环境中气体条件的影响相似，均以在含5%～10%CO2的培养环境下的表达最高，其次为厌氧环境，在空气环境中表达较低，当CO2的浓度达20%时，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达受到明显的抑制。
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表1 培养环境气体条件对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
培养条件
CFA Ⅰ滴度(倒数)
CFA Ⅱ滴度(倒数)
厌氧
105
105
空气
104
103
空气+5%CO2
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105
105
空气+10%CO2
105
105
空气+20%CO2
103
102
2.6 pH对ETEC粘附作用的影响 从表2可见，pH对ETEC的粘附作用有一定的影响，在酸性环境下，ETEC的粘附作用较低。用豚鼠小肠上皮细胞作粘附试验，也可看到同样的结果(图2和图3)。
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图2 ETEC在pH5.0环境下对豚鼠小肠上皮细胞的粘附。×4000
表2 环境对ETEC粘附作用的影响
环境条件
E44813对豚鼠回肠的粘附(个/平均每视野)
pH5.0
0.74±1.14
pH7.0
2.50±1.91
pH8.5
2.15±1.98
图3 ETEC在pH8.5环境下对豚鼠小肠上皮细胞的粘附。×4000
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3 讨 论
CFA Ⅰ和CFA Ⅱ明显受到生长期的调控。在细菌生长至稳定期后，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达均受到抑制。Yamamoto等[4]的研究表明，CFA Ⅰ或CFA Ⅱ阳性的ETEC对人小肠的粘附力与培养时间有关，培养3小时比培养20小时的粘附力要大，并认为这种现象与ETEC鞭毛的表达有关。根据本研究结果，我们认为也可能与CFA的表达有关。最近Rosenshine报道EPEC的致病力也受细菌的生长期调控；Fang等曾报道沙门菌的毒力基因受生长期调控；已知CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达也受温度调控，在25℃以下表达很低，在37℃环境下才明显表达，这些现象提示，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达与其它肠道致病菌某些毒力因子的表达一样与环境适应有关。在体内，CFA可能对于最初的繁殖是需要的，一旦适应了环境，为了节省能量，ETEC不再表达CFA。
本研究结果表明培养环境pH的变化(在5.0～8.5之间)对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达有影响；酸性环境下，ETEC对豚鼠回肠片及分离的豚鼠小肠上皮细胞的粘附作用大大减弱。Hillman等曾报道来源于猪回肠的乳酸杆菌在体外培养时能明显抑制猪源性ETEC的生长[5]，Bernet等也报道人的双歧杆菌可以抑制ETEC对人肠上皮细胞的粘附作用[6]。我们的结果表明酸性环境不仅能抑制ETEC毒素的表达[7]，还能减少其粘附。因此通过改良肠道微生态环境的方法预防ETEC腹泻发生是可能的。
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渗透压对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达也有调控作用，而且两种CFA对渗透压的反应有所不同。培养基的渗透浓度过高或过低，都可促进CFA Ⅱ的表达，而CFA Ⅰ的表达却与一些侵袭性肠道杆菌的侵袭因子相似，受高渗透性的正调控。提示这两种CFAs在ETEC定植中的作用可能不完全相似。ETEC在含一定浓度CO2的空气环境中生长最好，说明一定浓度的CO2对ETEC的生长有促进作用，而且对CFA的表达也有调控作用。在自然环境中，空气中所含的CO2不大于0.05%，而肠道中的CO2含量为5.5%～27%，ETEC表达CFA显然是为了适应在肠道环境的需要。
本研究结果将有助于深入认识ETEC的致病本质，并为从新的角度开拓ETEC的防治研究提供思路。
作者单位：陈 清 王雅贤 俞守义 第一军医大学流行病学教研室 广州 510515
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申 洪 第一军医大学病理学教研室
参考文献
[1]Kennedy EP.Osmotic regulation and the biosynthesis of membrane-derived oligosaccharides in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci.USA.1982;79:1092
[2]Yamamoto T and Yokota T.Electron microscopic study of Vibrio cholerae 01 adherence to the mucus coat and villus surface in the human small intestine.Infect Immun.1988;56:2753
[3]Izhar M,etal.Adherence of Shigella flexneri to guinea pig intestinal cells mediated by a mucosal adhesin.Infect Immun,1982;35:1110
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[4]Yamamoto T, etal.Adherence characteristics to human small intestinal mucosa of Escherichia coli isolated from patients with diarrhea or urinary tract infections.J Infect Dis.1990;162:896
[5]Hillman K,etal.Inhibitiom of enterotoxigenic Escherichia coli by the microflora of the porcine ileum,in an in vitro semicontinuous culture systen.J Appl Bacteriol.1994;76:294
[6]Berner M-F, etal.Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions.Appl Env Microbiol.1993;59:4121
[7]陈清，等.环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响.中国微生态学杂志.1998；10(5)：266, 百拇医药
摘 要 探讨几种环境因素对产毒性大肠杆菌(ETEC)两种主要定居因子CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响。结果表明细菌的生长期以及细胞外渗透压、pH、气体组成的不同均可不同程度地影响CFA Ⅰ和CFAⅡ的表达，其中渗透压对两种定居因子的影响有所不同。研究结果提示ETEC的CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达与环境适应有关。
关键词：产毒性大肠杆菌 定居因子 环境 表达
定居因子(colonization factor antigens,CFAs)是产毒性大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一，缺失CFAs的ETEC虽然仍可产生肠毒素，但不具致病力。已知CFAs在25℃以下不表达，在37℃时表达最高，但其它环境因素对CFAs表达的影响尚不清楚。本文观察了培养时间、pH、渗透浓度、气体成分等环境因素对ETEC的主要定居因子CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的调控。
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1 材料与方法
1.1 菌株 表达CFA Ⅰ的E44813及表达CFA Ⅱ的E44815ETEC标准株购自北京生物药物制品鉴定所。
1.2 细菌培养
培养基：LB、K培养基[1]及CFA培养基，CFA平板含1%水解酪蛋白(Oxoid产品)、0.15%酵母粉(Oxiod产品)、0.005%MgSO4、0.005%MnCl2、2%琼脂粉。不同pH的培养环境是将LB培养基用NaOH或HCl调pH至4.0～10.0。不同渗透浓度的培养基是在K培养基基础上加入不同摩尔浓度的NaCl或蔗糖而成，厌氧培养条件为N280%、H210%和CO210%。
不同环境条件下细菌的培养：细菌在3mlLB肉汤中37℃生长至对数期中期(6小时)，3000rmp离心，用PBS(pH7.2)洗3次，重悬于3ml不同环境条件的新鲜培养基，继续培养12小时。
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1.3 CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的检测 用ELISA法，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ(CS3)兔抗血清由军事医学科学院张兆山教授惠赠，血凝效价在1∶100以上。经培养的细菌在检测前均用PBS把OD560nm值调整为0.200(约1×108CFU)，10倍系列稀释作滴度检测。
1.4 肠片粘附试验 正常豚鼠用乙醚麻醉后解剖，取出回肠，用手术刀纵向切开，用PBS清洗后切成0.5cm×2cm的片段，置RKT缓冲液[2]中备用。ETEC菌株在37℃培养18小时后，离心，用PBS洗，重悬，根据OD560nm值把细菌密度调至1×108CFU/ml左右，取0.1ml加入0.9ml不同pH的培养基中，并加入甘露糖使终浓度为1%，马上放入肠片，室温作用20分钟。用PBS洗3次，2.5%戊二醛固定。作扫描电镜观察，每片肠片随机计数30个视野(×2000)，计数粘附的细菌数。
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1.5 小肠上皮细胞粘附试验 豚鼠小肠上皮细胞的分离：参照Izhar等[3]的方法进行。细胞浓度调整为1×107CFU，备用。取0.1ml细菌悬液加入0.8ml不同pH的培养基中，马上加入0.1ml细胞悬液和0.1ml甘露糖，室温作用20分钟，吸附于醋酸纤维膜上，乙醇梯度脱水，作扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 不同培养基对CFA Ⅰ及CFA Ⅱ表达的影响 K培养基+0.1molNaCl渗透浓度约为270mOsm，与CFA和LB培养基渗透浓度相似。E44813和E44815在这3种液体培养基中培养后CFAs的OD值虽然以CFA培养基的较高，但滴度相似，固体培养基培养时CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的OD值高于液体培养基培养时2倍左右，滴度高1个剂量级，尤以CFA培养基为明显。
2.2 培养时间对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响 E44813和E44815在LB肉汤中培养至3小时已经可以检测到CFA，滴度为1：100，培养至8小时，CFAⅠ和CFAⅡ的滴度均达1∶100000，继续延长培养时间至12、16、20、24小时，其滴度不再增加，最大OD值也接近，说明CFA的表达主要在细菌生长对数期。
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2.3 pH环境对CFA Ⅰ及CFA Ⅱ表达的影响 观察了5.0、7.0及8.5三个pH梯度对E44813和E44815表达CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的影响。在3种pH培养条件下，CFA Ⅰ的滴度均为1∶100000，但OD值有差异，最高OD值在这3种条件下分别为0.456、0.500和0.533。CFA Ⅱ在3种pH培养条件下滴度分别为1∶1000、1∶100000和1∶100000，OD值也以pH为8.5时最高。
2.4 渗透压对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
CFA Ⅰ和CFA Ⅱ在受渗透压影响方面是不同的。在NaCl≤0.3mol的渗透浓度下，CFA Ⅱ的表达随渗透浓度的增加而减弱，但当渗透浓度为0.5molNaCl时，CFA Ⅱ的表达反而增加，在0.7molNaCl培养条件下，CFA Ⅱ的表达也高于0.3molNaCl环境，对蔗糖的反应也相似。提示过高或过低的渗透压都是促进CFA Ⅱ表达的环境信号。
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CFA Ⅰ在0.7molNaCl或0.6mol蔗糖培养环境下表达最高，随培养基渗透浓度的降低而减少。可见高渗透压是促进CFA Ⅰ表达的环境信号。
图1 渗透浓度对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
(K=K培养基，0.1mNa=K+0.1molNaCl,0.1ms=K+0.1molsucrose,余类推纵坐标为OD值或滴度对数)
2.5 培养环境气体条件对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响 ETEC的生长密度与培养的气体环境有关，37℃培养18h细菌密度以5%CO2>10%CO2>厌氧>空气>20%CO2。CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达受环境中气体条件的影响相似，均以在含5%～10%CO2的培养环境下的表达最高，其次为厌氧环境，在空气环境中表达较低，当CO2的浓度达20%时，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达受到明显的抑制。
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表1 培养环境气体条件对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达的影响
培养条件
CFA Ⅰ滴度(倒数)
CFA Ⅱ滴度(倒数)
厌氧
105
105
空气
104
103
空气+5%CO2
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105
105
空气+10%CO2
105
105
空气+20%CO2
103
102
2.6 pH对ETEC粘附作用的影响 从表2可见，pH对ETEC的粘附作用有一定的影响，在酸性环境下，ETEC的粘附作用较低。用豚鼠小肠上皮细胞作粘附试验，也可看到同样的结果(图2和图3)。
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图2 ETEC在pH5.0环境下对豚鼠小肠上皮细胞的粘附。×4000
表2 环境对ETEC粘附作用的影响
环境条件
E44813对豚鼠回肠的粘附(个/平均每视野)
pH5.0
0.74±1.14
pH7.0
2.50±1.91
pH8.5
2.15±1.98
图3 ETEC在pH8.5环境下对豚鼠小肠上皮细胞的粘附。×4000
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3 讨 论
CFA Ⅰ和CFA Ⅱ明显受到生长期的调控。在细菌生长至稳定期后，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达均受到抑制。Yamamoto等[4]的研究表明，CFA Ⅰ或CFA Ⅱ阳性的ETEC对人小肠的粘附力与培养时间有关，培养3小时比培养20小时的粘附力要大，并认为这种现象与ETEC鞭毛的表达有关。根据本研究结果，我们认为也可能与CFA的表达有关。最近Rosenshine报道EPEC的致病力也受细菌的生长期调控；Fang等曾报道沙门菌的毒力基因受生长期调控；已知CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达也受温度调控，在25℃以下表达很低，在37℃环境下才明显表达，这些现象提示，CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达与其它肠道致病菌某些毒力因子的表达一样与环境适应有关。在体内，CFA可能对于最初的繁殖是需要的，一旦适应了环境，为了节省能量，ETEC不再表达CFA。
本研究结果表明培养环境pH的变化(在5.0～8.5之间)对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ表达有影响；酸性环境下，ETEC对豚鼠回肠片及分离的豚鼠小肠上皮细胞的粘附作用大大减弱。Hillman等曾报道来源于猪回肠的乳酸杆菌在体外培养时能明显抑制猪源性ETEC的生长[5]，Bernet等也报道人的双歧杆菌可以抑制ETEC对人肠上皮细胞的粘附作用[6]。我们的结果表明酸性环境不仅能抑制ETEC毒素的表达[7]，还能减少其粘附。因此通过改良肠道微生态环境的方法预防ETEC腹泻发生是可能的。
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渗透压对CFA Ⅰ和CFA Ⅱ的表达也有调控作用，而且两种CFA对渗透压的反应有所不同。培养基的渗透浓度过高或过低，都可促进CFA Ⅱ的表达，而CFA Ⅰ的表达却与一些侵袭性肠道杆菌的侵袭因子相似，受高渗透性的正调控。提示这两种CFAs在ETEC定植中的作用可能不完全相似。ETEC在含一定浓度CO2的空气环境中生长最好，说明一定浓度的CO2对ETEC的生长有促进作用，而且对CFA的表达也有调控作用。在自然环境中，空气中所含的CO2不大于0.05%，而肠道中的CO2含量为5.5%～27%，ETEC表达CFA显然是为了适应在肠道环境的需要。
本研究结果将有助于深入认识ETEC的致病本质，并为从新的角度开拓ETEC的防治研究提供思路。
作者单位：陈 清 王雅贤 俞守义 第一军医大学流行病学教研室 广州 510515
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参考文献
[1]Kennedy EP.Osmotic regulation and the biosynthesis of membrane-derived oligosaccharides in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci.USA.1982;79:1092
[2]Yamamoto T and Yokota T.Electron microscopic study of Vibrio cholerae 01 adherence to the mucus coat and villus surface in the human small intestine.Infect Immun.1988;56:2753
[3]Izhar M,etal.Adherence of Shigella flexneri to guinea pig intestinal cells mediated by a mucosal adhesin.Infect Immun,1982;35:1110
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[4]Yamamoto T, etal.Adherence characteristics to human small intestinal mucosa of Escherichia coli isolated from patients with diarrhea or urinary tract infections.J Infect Dis.1990;162:896
[5]Hillman K,etal.Inhibitiom of enterotoxigenic Escherichia coli by the microflora of the porcine ileum,in an in vitro semicontinuous culture systen.J Appl Bacteriol.1994;76:294
[6]Berner M-F, etal.Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions.Appl Env Microbiol.1993;59:4121
[7]陈清，等.环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响.中国微生态学杂志.1998；10(5)：266, 百拇医药