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编号:10496356
谷胱甘肽巯基转移酶 pi 参与肿瘤细胞耐药性的产生
http://www.100md.com 中国医学科学学院学报 1999年第21卷第5期
     曹威* 左瑾 方福德#

     摘 要 目的 建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶 pi (GST-pi) cDNA 的细胞表达体系。方法 用磷酸钙沉淀法将重组质粒 pSV-GT 和载体质粒 pSV-neo 分别转染 HeLa 细胞,G418 筛选得两株转染阳性细胞 HeLa/pSV-GT 和 HeLa/pSV-neo;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的 GST-pi cDNA 为探针,检测两细胞株 GST-pi mRNA 的表达水平;用 MTT 法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果 HeLa/pSV-GT 的 GST-pi mRNA 表达明显升高,而 HeLa/pSV-neo 和 HeLa 细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素 C 和顺铂对 HeLa/pSV-GT 的 IC50 分别为 70.13、10.95 和 16.52 μg/ml,对 HeLa/pSV-neo 的 IC50 分别为 10.34、7.48 和 13.70 μg/ml,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论 HeLa/pSV-GT 细胞具有较高的耐药性。GST-pi mRNA 的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在 GST-pi 与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。
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    关键词:谷胱甘肽巯基转移酶 pi 肿瘤耐药性

    谷胱甘肽巯基转移酶 (glutathione S-transferase, GST) 是一组与细胞内化学物质代谢和物质转运有关的同工酶系,在人类可分为 alpha、mu、pi 和 theta 型及微粒体 GST。GST-pi 在一些癌变组织和诱发的转化组织细胞中的含量、活性和 mRNA 表达均有升高,由此将 GST-pi 作为细胞癌变的标志。另外发现血中 GST-pi 含量与肿瘤细胞对化疗药的耐受性有关[1,2]。本实验室以往的工作亦表明 GST-pi 与肿瘤抗药性相关,在此基础上,将含有大鼠 GST-pi cDNA 的重组质粒转入 HeLa 细胞株中,试图建立一个稳定的遗传学表达系统,观察其对化疗药物敏感性的改变,以证实 GST-pi 基因的表达与细胞耐药的关系,为进一步研究提供模型。

    1 材料和方法

    材料
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    质粒和细胞株:质粒 pSV-neo 和 pSV-GT,其中 pSV-GT 为以 pSV-neo 为载体的含有

    单个正向连接的大鼠 GST-pi cDNA 的重组质粒,由本实验室构建。人宫颈上皮癌 HeLa 细胞株为本组冻存。

    细胞培养及转染所用试剂:完全培养基 [RPMI 1640 (GIBCO) 内含 10% 新生小牛血清,HEPES 25 mmol/L,谷氨酰胺 2 mmol/L,青霉素、链霉素各 100 IU/ml,pH 7.2]、筛选培养基 [完全培养基内含 G418 Sulfate (GIBCO) 500 μg/ml]、细胞消化液 (0.25% 胰酶-0.02% EDTA)、2×HBS、2 mol/L CaCl2

    放射性 DNA 标记及检测试剂盒:德国 Boehringer Mannheim Biochemica 公司产品。
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    细胞染色液:Mayer 苏木精染液和伊红染液。

    细胞耐药性检测所用试剂:5 mg/ml 四甲基偶氮唑盐 (MTT,Sigma) 溶液、细胞裂解液 (20% SDS-50% DMF)、丝裂霉素 C (MMC,日本协和发酵工业株式会社,效价 4%)、阿霉素 (ADR,意大利爱宝大药厂,批号 4017BA)、二氨二氯顺铂 (CDDP,中国齐鲁制药厂)、硫酸醛酰长春碱 (VCR,广州明兴制药厂)。

    细胞的转染和筛选 磷酸钙-DNA 共沉淀法将质粒 pSV-GT 和 pSV-neo 分别转染 HeLa 细胞,转染第 4 天开始用选择培养基稀释培养,约 2 周后,挑选阳性克隆的细胞扩增培养,并传代冻存。将 pSV-GT 和 pSV-neo 转染阳性细胞分别称为 HeLa/pSV-GT 和 HeLa/pSV-neo。

    GST-pi mRNA 表达水平的检测 按试剂盒推荐的操作方法进行 GST-pi cDNA 的标记及检测。标记探针的浓度为 0.5 μg/ml,对 HeLa/pSV-GT、HeLa/pSV-neo 和 HeLa 进行细胞原位杂交反应[3] 后,苏木精-伊红染色并摄影,计数细胞内蓝色细小杂交颗粒数。杂交颗粒以 ±(<10)、+(10~30)、++(30~50) 和 +++(>50) 分成 4 组,3 种细胞各计数 100 个。
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    MTT 法测定转染细胞对抗癌药物的耐药性实验 将 5×104 个/ml 细胞悬液接种到 96 孔板中,100 μl/孔,置 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中;24 h 后换不同浓度的抗癌药物 (药物实验组) 或完全培养基 (药物对照组) 100 μl/孔,设 3~6 个平行孔;继续培养 20 h 后,加入 MTT 溶液 10 μl/孔,4 h 后加细胞裂解液 100 μl/孔,放置 4 h 以上,测 OD590 值。

    结果判断:每个实测的 OD 值减去空白孔的 OD 值后,将得到的 OD 值做统计学处理。细胞增殖抑制率计算公式如下:g0501.gif (1043 bytes)

    将药物浓度相同时的 HeLa/pSV-GT 和 HeLa/pSV-neo 的增殖抑制率作双侧 t 检验,以判定两种细胞对抗癌药物的敏感性。测定数据以平均值 ± 标准误 (X±S)表示。IC50 代表细胞增殖抑制率为 50% 时所用的药物剂量,相对抑制率 (relative resistance,RR) 计算公式为:
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    RR(%)=IC50(HeLa/pSV-GT)/IC50(HeLa/pSV-neo)×100%

    2 结果

    GST-pi mRNA 在转染细胞中的表达 GST-pi cDNA 在大多数 HeLa/pSV-GT 细胞内大量表达,±、+、++ 和 +++ 分别占 4.12、13.40、10.28 和 73.20%, 而 HeLa/pSV-neo 和 HeLa 细胞内 GST-pi mRNA 的表达水平极低,±、+、++ 和 +++ 分别占 66.35、31.73、1.92、0.00% 和 59.00、41.00、0.00、0.00%。

    抗癌药物对转染细胞的毒性作用 4 种抗癌药物对转染细胞的增殖抑制率均与药物剂量呈正相关 (附图)。HeLa/pSV-GT 对 ADR 和 MMC 的敏感性较 HeLa/pSV-neo 低,表现为增殖抑制率的降低;CDDP 对 HeLa/pSV-GT 的增殖抑制率较对 HeLa/pSV-neo 有下降的趋势,但只在 4 μg/ml 时差异有显著意义;VCR 对 2 种细胞的增殖抑制率无显著性差异。0506.gif (5941 bytes)
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    附图 阿霉素、丝裂霉素、二氨二氯顺铂和硫酸醛酰长春碱对转染细胞的增殖抑制作用

    Fig Inhibition effect of ADR, MMC, CDDP, or VCR on proliferation of transfected cells

    A. adriamycin (ADR); B. mitomycin C (MMC); C. cisplatinum (CDDP); D. vincristine (VCR);

    ■ HeLa/pSV-GT; ◆HeLa/pSV-neo; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001

    经统计计算得出 ADR 对 HeLa/pSV-GT 和 HeLa/pSV-neo 的 IC50 分别为 70.13 和 10.34 μg/ml,RR 为 678.24%,P<0.05;MMC 对两种转染细胞的 IC50 分别为 10.95 和 7.48 μg/ml,RR 为 146.39%,P<0.002;CDDP 对两种转染细胞的 IC50 分别为 16.52 和 13.70 μg/ml,RR 为 120.58%,P<0.005。以上结果显示了 HeLa/pSV-GT 对三种药物产生了不同程度的抗药性。
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    3 讨论

    肿瘤细胞原发性或获得性抗药性的产生是肿瘤化学治疗失败的主要原因之一,目前的研究表明耐药是多因素、多途径综合作用的结果,主要因膜糖蛋白 P-gp 介导的和非 P-gp 介导的药物转运能力的改变、细胞内药物代谢相关物质 (如 GSTS、GSH 等) 解毒功能的改变及 DNA 拓扑异构酶 Ⅱ (Topo Ⅱ) 活性的改变,而导致细胞内药物浓度下降、药物毒性降低和细胞的生存能力提高。GSTS 是细胞内解毒功能的主要酶系之一,尽管在耐药形成中的作用尚无定论,但考虑到耐药机制的多样性,不能排除 GST-pi 与某些耐药现象的产生有关。本研究结果表明,当转染的大鼠 GST-pi cDNA 在 HeLa 细胞中稳定表达后,细胞表现出对 ADR、MMC 和 CDDP 的耐受性,使以上药物对细胞增殖的抑制能力降低,该细胞株成为一个耐药细胞株,推测这是由于表达的 GST-pi 对药物的解毒功能增加所致。

    ADR 是蒽环类抗肿瘤抗生素的代表药物,肿瘤细胞对其耐药性的产生主要是由于 P-gp 介导的多药耐药,但这并非唯一机制。已明确醌基团可在 GST 催化下与 GSH 结合[4],加上 GST 可清除自由基的作用,推测 ADR 在代谢过程中产生的蒽环半醌基团及自由基由于 GST-pi 的解毒作用而对细胞的毒性降低。有不少实验证实 GSTS,尤其是 GST-pi 的升高与一些细胞系的 ADR 耐药有关[1,5,6],本研究结果与之一致。但也有相反的报道,即 GST-pi mRNA 表达对 ADR 的敏感性无明显影响[7]。推测 P-gp 和 GST-pi 是两个不相关的系统,但均与 ADR 耐药有关,在不同条件下都可能成为细胞耐药的充分条件,但都不是唯一原因。MMC 是烷化剂类抗肿瘤药物,在胞内经药物代谢 Ⅱ 相酶的作用,与亲水性基团结合形成易于排出的复合物,其对细胞的毒性同样依赖于烷化作用和醌基团自由基的生成。CDDP 是金属铂类抗肿瘤药物,由于其通过胞膜是扩散作用而非主动转运过程,所以它不是 P-gp 的作用底物[8]。CDDP 在胞内的解毒过程尚不清楚,但一些实验提示 GST-pi 与细胞对 CDDP 的耐受有关[6,8]。本研究证实 GST-pi 表达可使转染细胞对 MMC 和 CDDP 的耐受性有一定程度的提高 (分别提高 1.5 和 1.2 倍)。VCR 是植物碱类抗肿瘤药物,目前认为其耐药性的产生主要与细胞对 VCR 转运蛋白的功能变化有关。本实验未观察到 GST-pi 表达可影响细胞对 VCR 的敏感性,这与一些其它研究结果相吻合[6]
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    综合 GST-pi 与肿瘤细胞耐药的研究,我们看到并非所有的肿瘤细胞耐药都与 P-gp 有关,同时 GST-pi 也不是细胞耐药的唯一条件,GST-pi 的表达升高仅在某些条件下导致肿瘤细胞对部分抗癌药物产生一定程度的耐受,推测 GST-pi 可能与其它因素共同作用导致细胞耐药性的产生。

    注:国家科委“攀登项目”#通讯作者

    作者单位: 左瑾 中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 100005;

    曹威,中日友好医院临床医学研究所,北京 100029

    参考文献

    1 Peter WHM, Roelofs HMJ. Biochemical characterization of resistance to mitoxantrone and adriamycin in caco-2 human colon adenocarcinoma cells: a possible role for glutathione S-transferase. Cancer Res, 1992, 52: 1886~1890
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    2 Shen H, Paul S, Breuninger LM, et al. Cellular and in vitro transport of glutathione conjugates by MRP. Biochemistry, 1996, 35: 5719

    3 单惠敏,黄曼影. 离体细胞的非放射性原位杂交. 基础医学与临床,1995,15:393~395

    4 Tew KD. Glutathione-associated enzymes in anticancer drug resistance. Cancer Res, 1994, 54: 4313~4320

    5 Nakagawa K, Saijo N, Tsucheda S, et al. Glutathione S-transferase pi as a determinant of drug resistance in transfectant cell lines. J Biol Chem, 1990, 265: 4296~4301
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    6 Puchalski RB, Fahl WE. Expression of recombinant glutathione S-transferase π, Ya or Yb1 confers resistance to alkylating agents. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 2443~2447

    7 Moscow JA, Townsend AJ, Cowan KH. Elevation of pi class glutathione S-transferase activity in human breast cancer cells by transfection of the GST-pi gene and its effect on sensitivity to toxins. Mol Pharmacol, 1989, 36: 22~28

    8 Saburi Y, Nakagawa M, Ono M, et al. Increased expression of Glutathione S-transferase gene in cis-diamminedichloroplatinum (Ⅱ)-resistant variants of a chinese hamster ovary cell line. Cancer Res, 1989, 39: 365~369, http://www.100md.com(曹威* 左瑾 方福德#)