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编号:10496368
Vogt-Koyanagi-Harada 综合征与HLA-DRB基因的相关性
http://www.100md.com 中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
     张美芬 邱长春 胡天圣

    摘 要:目的 从基因水平研究汉族VKH综合征(Vog t -Koyanagi-Harada syndrome)患者发病的免疫遗传基础。方法 应用 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测51例汉族VKH患者及62例正常人的HLA -DRB基因,并进一步应用序列特异的寡核苷酸探针(sequence specific oligonucleotide probe, SSOP) 斑点杂交法及限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length po lymorphism, RFLP)方法检测DR4等位基因。结果 VKH患者组DRB1*0 4 05阳性率显著高于对照组(80.4% vs 8.1%, Pc<10-7),相对危险性为46 .7。而VKH患者组DRB1*14及DRB1*08的阳性率显著低于对照组(DRB1*14:2.0% vs 1 7.7%,Pc<0.05,RR=0.09; DRB1*08:0% vs 11.3%,Pc<0.05)。在D RB1 *0405阴性的VKH患者及正常人中,VKH患者组DRB1*15的阳性率显著高于对照组(70.0% vs 28.1%, Pc<0.05),相对危险性为6.0。比较DRB1*0405阳性与DRB1*0405阴性VK H患者的临床表现、并发症及视力预后,两组间无显著性差异。结论 (1) DRB1*0405及DRB1*15与VKH综合征的易感性呈正相关,它们可能是VKH综合征的易感 基因,DRB1*0405为主要易感基因,DRB1*15为次易感基因;(2) DRB1*08及DRB1*14与VKH的易感性呈负相关,它们可能是VKH的两个抗性基因;(3) VKH患者的临床表 现及预后与DRB1*0405无相关性。
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    关键词:Vogt-Koyanagi-Harada综合征 HLA-DRB基因 DRB1*04 05

    沃格特-小柳-原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome, VKH) 是累及眼、皮肤、听觉及脑多种器官的自身免疫性疾病。其临床表现为双侧弥漫性肉芽肿型葡萄膜炎,伴有耳鸣、听力减退、脑膜刺激症状、脱发、白发及白癜风。有色人种发病率高,日本、我国、拉丁美洲(特别是巴西)及美国印第安人为高发人群,其病因及发病机制尚不清楚。据报道此病可能与病毒感染[1]、自身免疫[2]及遗传因素[3]有关。组织病理学研究发现,VKH患者的脉络膜黑色素细胞上有HLA-DR抗原的表达,推测该抗原可能参与VKH的发病[2]。血清学研究表明,VKH与HLA-DR4抗原高度关联[4]。但是编码DR4抗原的基因有多个等位基因,Shindo等[5]已从基因水平证实日本VKH患者主要与HLA-DRB1*0405密切相关。本实验应用多种分子生物学方法检测VKH患者的HLA-DRB1、B3、B43个位点的16个基因及DR4的12个等位基因,旨在揭示我国汉族VKH患者与HLA-DRB基因的相关性。
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    对象和方法

    对象 VKH患者51例,均系本院葡萄膜炎专科门诊患者,其中多数为外院转诊患者,均符合1978年美国葡萄膜炎协会制定的诊断标准[6]。男24例,女27例,平均发病年龄为35.5岁。正常对照62人,均系本院工作人员,男30人,女32人;年龄22~65岁,无自身免疫病及遗传病家族史。

    HLA-DR4基因阳性正常人DNA34例,其中22例由本院内科赵岩博士惠赠。

    所有被检者均为汉族。

    方法

    采血及收集临床资料:取被检者静脉血5ml,用2% EDTA抗凝。收集VKH患者临床资料,包括发病年龄、眼外及眼部表现、并发症,治疗经过及矫正视力。

    人基因组DNA的制备[7]:采用酚-氯仿法从外周血白细胞中提取DNA。应用紫外分光光度计进行DNA纯度鉴定及定量。工作液浓度为0.1μg/μl。
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    HLA-DRB基因的扩增:所用引物序列见文献[8],由中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室提供,扩增DRB1、B3、B4基因的第二外显子。反应体系包括:基因组 DNA 0.1 μg,dNTPs 200 μmol/L,上、下游引物各5pmol,5×buffer 5μl,Taq多聚酶 0.5U,加水至25μl。PCR反应条件:94℃预变性2 min;于94℃变性40s,54℃退火45s,72 ℃延伸40s,循环30次;再72℃延伸5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    DR4等位基因的检测:(1)序列特异的寡核苷酸探针斑点杂交法(PCR-SSOP):根据Angelini等[9]方法,将10μl DR4基因PCR产物点在硝酸纤维素膜上,分别与8个32P标记的序列特异的寡核苷酸探针(SSOP)杂交,杂交膜与X光片于-70℃放射自显影。所用探针的碱基序列、特异性及杂交条件见表1。(2)限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP):取DR4基因PCR产物10μl,加2U限制性内切酶HaeⅡ,37℃水浴消化3h,反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳[10]。紫外灯下观察结果。
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    表1 斑点杂交所用序列特异的寡核苷酸探针

    Table1 Oligonucleotid es designed for the typing of DRB1*04 alleles

    Oligo

    Specificity

    (DRB1*04)

    Sequence(5′~3′)

    HT(℃)

    WT(℃)

    QK71

    01,09
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    GAGCAGAAGCGGGCCGC

    1×60

    52

    Dw10

    02

    GACATCCTGGAAGACGAGC

    6×58

    44

    Dw13c

    03,06,07,11

    AGCAGAGGCGGGCCGAGGT

    1×60
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    54

    Dw14

    04,05,08,10

    GAGCAGAGGCGGGCCGC

    4×58

    48

    Dw15

    05,09,10,11,12

    GCGGCCTAGCGCCGAGTAC

    3×58

    50

    Dw″KT2″
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    06

    CCAAGAGGAGTCCGTGCG

    5×58

    40

    PS36

    02,03,04,06,10,11,12

    CGGGGTTGTGGAGAGCTTC

    5×60

    48

    PS41

    01,05,07,08,09

    CTACGGGGTTGGTGAGAGC
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    5×60

    48

    HT:hybridization temperature; ×:SSPE concentration; WT: washing temperature 统计学处理:计量资料采用t检验,计数资料用χ2检验并进行显著性分析。对经统计学处理有差异的基因,同时计算其相对危险性(relative risk,RR)。

    结 果

    VKH与HLA-DRB基因的相关性 51例VKH患者及62例正常人HLA-DRB基因检测结果表明,VKH患者组DRB1*04及 DRB4阳性率显著高于正常对照组(DRB1*04:88.2% vs 19.4%, Pc<10-7, RR =31.3; DRB4:90.2% vs 50.0%, Pc<10-5, RR=9.2),而VKH患者组 DR B1*14 及DRB1*08阳性率显著低于正常对照组(DRB1*14:2.0% vs 17.7%,Pc<0 .05, RR=0.09; DRB1*08: 0% vs 11.3%, Pc<0.05) (图1,表2)。
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    图 1 HLA-DRB基因分型

    Fig 1 DRB genes typing by PCR-SSOP method

    M: marker(pBR 322/MspⅠ);B3: DRB3 gene;

    B4: DRB4 gene

    表 2 VKH患者和正常对照的HLA-DRB基因检测结果

    Table 2 Distribution of HLA-DRB genes in VKH patients and in the controls

    DRB genes

    VKH(N=51)
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    Controls(N=62)

    Pc

    RR

    n

    %

    n

    %

    DRB1*01

    0

    0.0

    0

    0.0

    NS
, 百拇医药
    DRB1*15

    22

    43.1

    19

    30.6

    NS

    DRB1*16

    4

    7.8

    10

    16.1

    NS

    DRB1*03
, 百拇医药
    0

    0.0

    5

    8.1

    NS

    DRB1*04

    45

    88.2

    12

    19.4

    <10-7

    31.3

    DRB1*11
, 百拇医药
    4

    7.8

    7

    11.3

    NS

    DRB1*12

    9

    17.6

    14

    22.6

    NS

    DRB1*06

    1
, 百拇医药
    2.0

    5

    8.1

    NS

    DRB1*13

    1

    2.0

    6

    9.7

    NS

    DRB1*14

    1

    2.0
, 百拇医药
    11

    17.7

    <0.05

    0.09

    DRB1*07

    8

    15.7

    9

    14.5

    NS

    DRB1*08

    0

    0.0
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    7

    11.3

    <0.05…

    DRB1*09

    7

    13.7

    16

    25.8

    NS

    DRB1*10

    0

    0.0

    2
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    3.2

    NS

    DRB3

    7

    13.7

    17

    27.4

    NS

    DRB4

    46

    90.2

    31

    50.0
, 百拇医药
    <10-5

    9.2

    NS:not significant;△:one case is homozygous of DRB1*04

    DRB1*0405与VKH的相关性 应 用PCR-SSOP法检测DR4等位基因,结果显示VKH组DRB1*0405阳性率显著高于对照组(80.4% vs 8.1%, Pc<10-7,RR=46.7),其它DR4等位基因检测结果两组间无 显著性差异(表3)。

    表 3 VKH患者和正常对照的DR4等位基因检测结果

    Table 3 Distribution of DRB1*04 alleles in VKH patients and in the controls
, 百拇医药
    DRB1*04 alleles

    VKH(N=51)

    Controls(N=62)

    Pc

    RR

    n

    %

    n

    %

    DRB1*0401

    0

    0.0

    3
, 百拇医药
    4.8

    NS

    DRB1*0402

    0

    0.0

    0

    0.0

    NS

    DRB1*0403

    0

    0.0

    1

    1.6
, 百拇医药
    NS

    DRB1*0404

    2

    3.9

    1

    1.6

    NS

    DRB1*0405

    41

    80.4

    5

    8.1

    <10-7
, 百拇医药
    46.7

    DRB1*0406

    0

    0.0

    1

    1.6

    NS

    DRB1*0407

    0

    0.0

    1

    1.6

    NS
, 百拇医药
    DRB1*0408

    0

    0.0

    1

    1.6

    NS

    DRB1*0409

    0

    0.0

    0

    0.0

    NS

    DRB1*0410
, 百拇医药
    2

    3.9

    0

    0.0

    NS

    DRB1*0411

    0

    0.0

    0

    0.0

    NS

    DRB1*0412

    0
, 百拇医药
    0.0

    0

    0.0

    NS

    PCR-SSOP及PCR-RFLP结果均显示:VKH患者组DRB1*0405阳性率为91.1%(41/45),显著高于对照组的52.9%(18/34)和55.9%(19/34),Pc<0.01,RR分别为9.1和8.1(图2)。

    图2 HLA-DRB1的HaeⅡ限制性内切酶图谱

    Fig 2 Restriction patterns of HaeⅡ digestion

    Line1~6: DRB1*0405; Line7: DRB1*04;
, 百拇医药
    Line8: marker(pBR322/MspⅠ)

    DRB1*0405阴性VKH患者与正常对照的DRB基因比较 10例DRB1*0405阴性VKH患者的DRB1*15阳性率显著高于DRB1*0405阴性对照组(70.0% vs 2 8.1%, Pc<0.05, RR=6.0),DRB1*04和DRB4检出率VKH患者组与对照组比较差异无 显著意义。

    DRB1*0405与VKH患者临床表现的关系 DRB1*0405(+)VKH患者与DRB1*0405(-)VKH患者的平均发病年龄、眼外表现、并发症发生率及 视力预后均无显著性差异(表4)。

    表 4 DRB1*0405与VKH患者的临床表现

    Table 4 Relation between DRB1*0405 and the clinical features of VKH patients
, 百拇医药
    Clinical features

    DRB1*0405(+)

    (N=41,82 eyes)

    DRB1*0405(-)

    (N=10,20 eyes)

    P

    Average age at onset (yrs)

    36.27±12.76

    32.10±13.11

    NS

    Extraocular manifestations
, 百拇医药
    Signs of meningeal

    28(68.3%)

    9(90.0%)

    NS

    Irritation

    Alopecia

    25(61.0%)

    6(60.0%)

    NS

    Poliosis

    24(58.5%)

    5(50.0%)
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    NS

    Vitiligo

    21(51.2%)

    4(40.0%)

    NS

    Auditory disturbance

    26(63.4%)

    7(70.0%)

    NS

    Complications(eyes)

    Complicated cataract

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    6(30.0%)

    NS

    Secondary glaucoma

    11(13.4%)

    2(10.0%)

    NS

    Subretinal neovascular membranes

    1(1.2%)

    2(10.0%)

    NS

    Visual acuity(eyes)
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    ≥0.5

    47(57.3%)

    11(55.0%)

    NS

    ≤0.05

    7(8.5%)

    2(10.0%)

    NS

    讨 论 本研究应用PCR-SSOP法检测51例VKH患者及62例正常人的DRB1、B3、B4 3个位点的16个基因,结果显示VKH患者DR4基因阳性率显著高于正常人群。据目前所知,DR4基因有19个等位基因,为了确定VKH与DR4等位基因的相关性,应用PCR-SSOP斑点杂交法检测VKH患者及正常对照的DR4等位基因。结果显示:VKH与DRB1*0405强相关,相对危险性为46.7,它可能是与VKH易感性相关的基因,与Shindo等[5]结果相似。SSOP斑点杂交法灵敏度高,根据8个探针杂交的综合结果能鉴别出DR4的12个等位基因。为了验证斑点杂交的结果,进一步应用PCR-RFLP法检测VKH患者及正常对照的DRB1*0405,结果显示除1例正常对照的RFLP检测结果与SSOP斑点杂交结果不同外,余者均与PCR-SSOP分析结果相符,证明用SSOP斑点杂交法检测DR4等位基因,方法学上是可靠的。PCR-RFLP方法简便易行,特异性高,不需应用同位素,应是临床检测DRB1*0405的首选方法。
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    本文51例VKH患者中10例DRB1*0405阴性。为了筛选与VKH易感性相关的其它基因,同时排除基因间的连锁不平衡等干扰因素,本研究将DRB1*0405均为阴性的VKH患者与正常对照的DRB基因进行比较,结果显示VKH患者组DRB1*15阳性率明显高于对照组,相对危险性为6.0,提 示VKH易感性也与DRB1*15呈正相关,它可能是VKH的次易感基因。另外,VKH患者组与对照组DRB4阳性率相似(50.0%vs 45.6%),两组间无显著性差异,从而说明VKH易感性与DRB4无直接关系,本文VKH患者DRB4升高,可能与DRB1*0405的连锁不平衡有关,随着DRB1*0405的升高而升高。

    本文结果还显示,VKH患者DRB1*14及DRB1*08阳性率显著低于正常人群,提示中国汉族VKH患者与DRB1*14及DRB1*08基因呈负相关,它们可能是与VKH易感性相关的抗性基因;而日本VKH 患者主要与DRB1*13及DRB1*08基因负相关[11]
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    本文34例DR4基因阳性正常人中18例DRB1*0405阳性,提示DRB1*0405也是正常人群中最常见的DR4等位基因,与日本人群DR4基因分布一致[5]。与此相反,DRB1*0405在高加索人群中极少见,从而可从免疫遗传学角度解释VKH患病率的种族差异。另外也提示DRB1*0405只是与VKH易感性相关的基因,而不是致病基因。此外本研究中尚有3例VKH患者DRB1*0405及DRB1*15均为阴性,提示VKH的发病不仅涉及DRB基因,可能尚有其它因素参与,诸如DRB基因的调控基因、DQ基因以及环境因素等,这有待进一步研究。

    此外,对DRB1*0405与VKH患者临床表现的关系进行初步探讨,结果显示DRB1*0405(+)与DRB1*0405(-)VKH患者在平均发病年龄、眼外表现、并发症发生率及视力预后方面两组间差异无显著性。但是该结果有待积累更多DRB1*0405阴性患者,建立统一治疗方案,进行前瞻性研究,方能进一步确定DRB1*0405与VKH临床表现的关系。
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    作者简介:邱长春 National Laboratory of Medical Molecaular Biology,CAMS and PUMC;

    胡天圣 Corresponding author Tel:01065296356,Fax:01065124875

    作者单位:张美芬(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院眼科, 北京 100730)

    邱长春(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院眼科, 北京 100730)

    胡天圣(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院眼科, 北京 100730)

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