蛋白酶抗蛋白酶失衡在内毒素诱发急性肺损伤中的作用
揭志军 杨文兰 蔡映云 金美玲 朱威 祝慈芳
摘 要：目的：研究蛋白酶抗蛋白酶失衡在内毒素诱发急性肺损伤(ALI)兔模型中的作用。方法：成年健康新西兰大白兔16只经麻醉、气管切开插管后给予机械通气。随机分成2组(每组8只)：即内毒素(LPS)致ALI模型组(LPS组)和生理盐水对照组(NS组)。监测动脉血氧分压(PaO2)、动脉血压(BP)、外周血白细胞数(WBC)、气道峰压(Ppeak)、静态总呼吸顺应性(TRC)和肺内动静脉分流(
s/t)等指标的变化；比较实验8小时后血浆α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)含量和活性、支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)样活性、α1-AT活性、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、总磷脂(TPL)、饱和磷脂酰胆碱(DSPC)含量及肺湿重与干重比(W/D)的差异。结果：与基础值相比，静注LPS后PaO2下降，氧合指数<26.67 kPa(1 kPa=7.5 mmHg),TRC下降>50%，肺内动静脉分流增加>25%；与NS组相比，血浆α1-AT含量增高但活性下降，外周血白细胞减少，而BALF中TP含量、NE样活性、IL-8和TNF-α浓度增加，α1-AT活性、TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP下降，W/D增高。结论：急性肺损伤时中性粒细胞过度活化并释放出NE，使蛋白酶抗-蛋白酶失衡；NE对肺血管屏障具有破坏作用，促进了肺损伤的发生。
, http://www.100md.com
关键词：肺损伤，急性 α1-抗胰蛋白酶 弹性蛋白酶，中性粒细胞 兔 内毒素
急性肺损伤(ALI)是由于感染、休克和创伤等多种原因引起的肺部并发症，其发病机制尚不清楚。一般认为肺部炎症细胞的聚集并释放炎症介质从而损伤肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞是发病的重要病理基础，而中性粒细胞及其释放的弹性蛋白酶(NE)则起重要作用。
正常机体有足够的抗蛋白酶对抗NE的活性，防止正常组织受到NE的过度破坏。肺组织最主要的蛋白酶抑制物是α1抗胰蛋白酶(α1AT[1]，由肝细胞和单核细胞产生)。因此，NE与抗蛋白酶的平衡对维护肺组织的稳定性起重要作用。目前研究表明，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中NE的含量和活性明显增高，而抗蛋白酶含量相对不足，又易受到氧自由基的氧化失活，因此认为蛋白酶抗蛋白酶失衡在ALI的发病机制中起重要作用[26]。
, 百拇医药
本实验采用新西兰兔静脉注射内毒素脂多糖(LPS)制作ALI动物模型，研究NE与抗蛋白酶(如α1AT)失衡在ALI发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组：16只健康成年新西兰大白兔(由上海医科大学试验动物部提供)，雌雄不拘，体重2.0～2.5 kg，随机分成2组：①内毒素致ALI模型组(LPS组)；②生理盐水对照组(NS组)。
1.2 方 法：
1.2.1 实验动物：经兔耳缘静脉静注1%戊巴比妥钠20 mg/kg麻醉，然后气管切开，插入内径为3.5 mm的气管插管，接人工呼吸机(Siemens SV900c)进行机械通气，通气方式为定容通气。潮气量(VT)8～10 ml/kg，呼吸频率(RR)40次/min，吸∶呼(I∶E)为1∶2，吸入氧浓度(FiO2)为0.40。根据血气分析结果调节VT，使最初的二氧化碳分压(PaCO2)维持在4.76～6.00 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)。经耳缘静脉插入一静脉导管，建立静脉通道，经此进行补液和给药；直视下分离一侧颈总动脉，插入动脉导管并与压力换能器相连，连续检测体动脉压，并经此采集动脉血标本，用于血气分析和生化测定。在试验过程中，连续静滴1%戊巴比妥钠5 mg.kg-1.h-1维持麻醉，间断肌注潘库溴胺0.5 mg.kg-1.h-1，以抑制动物自主呼吸。用微量输液泵按8 ml.kg-1.h-1输入乳酸林格氏液以补充血容量，并根据情况进行调整。
, http://www.100md.com
1.2.2 动物麻醉和插管操作完毕后，稳定30分钟，然后测定基础数值，包括动脉血气、血常规、动脉血压(BP)、VT、气道峰压(Ppeak)、平台压(Pplate)、静态总呼吸顺应性(TRC)以及肺内动静脉分流(s/t)等。
1.2.3 2组动物在测定完基础数值后分别给药，LPS组由微量泵静注LPS(Escherichia coli,O55:B5，Sigma公司)500 μg/kg，30～45分钟输完；NS组静注0.9 % NaCl 1 ml/kg。然后连续机械通气8小时。实验过程中除s/t于4和8小时复查外，其余生理指标均每小时复查1次。
, 百拇医药
1.2.4 实验8小时后所有动物留取2 ml血浆待测α1AT含量和活性。然后过量戊巴比妥钠处死动物，立即打开胸腔，结扎左肺门，取左下肺置10%甲醛中固定，留待病理检查。取左上肺称湿重(W)后，置60 ℃恒温箱，48小时后再称干重(D)，计算肺湿重与干重比值(W/D)。右肺进行支气管肺泡灌洗(BAL)：用0.9% NaCl 10 ml/kg经右主支气管灌入，然后流出，再注入与前次流出量相等的0.9% NaCl，同法操作，共灌洗3次。灌洗液经双层纱布过滤后计算回收量，然后4 ℃离心(200×g)，留取上清液，分装7份后保存于-70 ℃超低温冰箱中，留待测定BALF中α1AT活性、NE样活性及总蛋白(TP)、白细胞介素8(IL8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、总磷脂(TPL)和饱和磷脂酰胆碱(DSPC)等的含量。
血浆中α1AT含量测定：采用速率散射比浊法(用美国BECKMAN公司的ARRAY 3.6型全自动特定蛋白药物分析系统进行测定)。
, 百拇医药
血浆和BALF中α1AT活性测定：BALF在-70 ℃冷冻抽干，浓缩10倍后再测定。按文献[7]方法进行测定，利用α1AT能抑制胰蛋白酶水解发色底物N苯甲酰DL精氨酸对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)的原理，建立测定α1AT生物活性的方法。
BALF中NE样活性按文献[8]方法测定：根据NE能分解底物Suc(Ala)3NA产生发光物质对硝基苯胺(pNA)的特点，用猪胰蛋白酶为标准参照，计算BALF中NE样活性。
BALF中IL8和TNFα含量测定：分别应用ELISA试剂盒采用双抗体夹心ABCELISA法测定(试剂盒购于上海森熊科技实业有限公司)。
BALF中TP测定：采用双缩脲法测定。
BALF中TPL和DSPC测定：BALF以2∶1的氯仿甲醇溶液分离，其中氯仿层含磷脂；饱和磷脂与其他磷脂的分离按文献[9]方法测定。经氮气吹干后，以四氧化锇氧化15分钟，然后氮气吹干，经20∶1的氯仿甲醇溶解后过中性铝柱，收集经氯仿甲醇氨水(70∶30∶2)洗脱后液体，便可得到已和其他磷脂分离的富含DSPC的液体。按文献[10]方法进行测定。
, http://www.100md.com
1.2.5 肺组织的病理观察：取左下肺数小块用石蜡包埋、切片、苏木紫伊红染色后光镜检查。
1.3 统计学方法：各组数据用general linear model procedure,Dunnett t方法处理；组间数据用studentnewmankeaultest方法处理。
2 结 果
2.1 实验过程中LPS组动脉血氧分压(PaO2)至5小时降为(10.05±3.15)kPa，氧合指数(PaO2/FiO2)<26.67 kPa，形成ARDS模型。同时Ppeak逐渐升高，TRC逐渐降低；外周血白细胞(WBC)0.5小时即明显下降，随后虽有所回升，但仍低于NS组。BP在0.5小时后开始下降(表1)。LPS组4小时和8小时的s/t值均高于基础值和NS组(表2)。
, http://www.100md.com
表1 2组动物生理指标的变化(X±s)
组别
基础值(0时)
0.5小时
1小时
2小时
3小时
PaO2(kPa)
LPS组
21.85±0.99
16.48±2.75＃*
15.73±3.49＃*
, http://www.100md.com
14.73±3.43＃*
11.32±1.93＃*
NS组
21.45±1.69
21.68±1.24
21.24±1.17
22.00±1.17
21.28±0.88
Ppeak(kPa)
LPS组
0.76±0.18
, http://www.100md.com
0.91±0.18
0.94±0.19＃*
1.07±0.17＃*
1.16±0.19＃*
NS组
0.76±0.08
0.75±0.08
0.79±0.06
0.80±0.05
0.77±0.03
TRC(ml/kPa)
, http://www.100md.com
LPS组
0.34±0.09
0.26±0.04＃*
0.25±0.04＃
0.21±0.03＃*
0.20±0.02＃*
NS组
0.29±0.06
0.29±0.05
0.29±0.04
0.29±0.04
, 百拇医药
0.29±0.03
WBC(×109/L)
LPS组
4.90±0.30
2.80±0.60＃*
2.00±0.40＃*
1.80±0.30＃*
2.10±0.50＃*
NS组
4.90±0.30
, 百拇医药 4.80±0.20
4.50±0.20
4.30±0.30
4.20±0.30
BP(kPa)
LPS组
12.40±0.97
9.44±0.84＃*
8.81±0.59＃*
8.72±0.49＃*
8.59±0.56＃*
, http://www.100md.com
NS组
12.27±0.93
12.39±0.91
12.33±1.03
12.31±0.92
12.72±0.85
组别
4小时
5小时
6小时
7小时
8小时
, 百拇医药 PaO2(kPa)
LPS组
11.08±3.96＃*
10.05±3.15＃*
9.21±2.73＃*
8.24±2.07＃*
7.32±1.63＃*
NS组
21.53±1.17
21.80±0.76
, 百拇医药
21.27±1.57
20.99±1.21
21.48±1.00
Ppeak(kPa)
LPS组
1.30±0.31＃*
1.41±0.42＃*
1.47±0.40＃*
1.50±0.36＃*
1.55±0.36＃*
, 百拇医药
NS组
0.80±0.04
0.78±0.03
0.79±0.04
0.82±0.03
0.81±0.03
TRC(ml/kPa)
LPS组
0.18±0.03＃*
0.17±0.04＃*
0.15±0.03＃*
, http://www.100md.com
0.15±0.03＃*
0.14±0.02＃*
NS组
0.29±0.03
0.28±0.03
0.28±0.04
0.28±0.03
0.28±0.03
WBC(×109/L)
LPS组
2.40±0.70＃*
, 百拇医药
2.50±0.50＃*
2.70±0.60＃*
2.80±0.80＃*
3.20±1.00＃*
NS组
4.20±0.30
4.20±0.30
4.60±0.30
4.80±0.30
5.20±0.30
BP(kPa)
, 百拇医药
LPS组
8.01±0.79＃*
7.73±0.73＃*
7.40±0.93＃*
6.95±1.21＃*
7.05±1.09＃*
NS组
12.80±0.69
12.80±0.65
12.64±0.89
, 百拇医药
12.67±1.09
12.47±0.96
注：与基础值比较：＃P<0.05；与NS组比较：*P<0.05；1 kPa=10.20 cmH2O
表2 2组动物实验后不同时间点s/t值(X±s)
组别
基础值(0时)
, http://www.100md.com
4小时
8小时
LPS组
14.7±1.6
21.8±2.8＃**
26.2±1.3＃**
NS组
12.8±1.5
14.3±1.4
14.1±1.4
注：与基础值比较：＃P<0.05；与NS组比较：**P<0.01
, http://www.100md.com
2.2 2组动物实验后血浆α1AT含量、活性以及W/D的比较：NS组α1AT含量<100 mg/L(超出了测定的最低范围)。LPS组α1AT含量较NS组增高，但其活性却低于NS组。LPS组W/D明显高于NS组(表3)。
表3 2组动物实验8小时后血浆α1AT含量和活性以及W/D值(X±s)
组别
α1AT含量
(mg/L)
α1AT活性
(U/L)
W/D
, 百拇医药
LPS组
406.0±222.0*
210.0±80.0*
6.5±0.6*
NS组
<100
340.0±150.0
4.9±0.1
注：与NS组比较：*P<0.05
2.3 2组动物BALF中各指标的比较：LPS组BALF中α1AT活性明显低于NS组；NE样活性、IL8、TNFα和TP含量较NS组均明显增高，而TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP均明显低于NS组(表4)。
, 百拇医药
表4 2组动物BALF中α1AT活性、NE样活性、IL8、TNFα、TP、TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP测值(X±s)
组别
α1AT活性
(U/L)
NE样活性
(μmol.L-1.h-1)
IL8
(ng/L)
TNFα
, http://www.100md.com
(ng/L)
TP
(mg/kg)
TPL
(mg/kg)
DSPC/TPL
DSPC/TP
(mg/g)
LPS组
18.0± 4.0
10.10±4.52*
1159.8±280.4*
, 百拇医药
74.0±33.6*
254±108*
8.6±3.2*
0.286±0.046*
9.7±5.5*
NS组
31.0±10.0
0.96±0.48
139.3±52.7
18.3±9.2
, http://www.100md.com 67±22
13.1±1.6
0.417±0.018
81.5±5.8
注：与NS组比较：*P<0.05
2.4 各组间病理形态观察的比较：LPS组肉眼见病变呈双侧性分布，肺脏表面见点状出血，肺脏肿胀。光镜下炎性粒细胞浸润，小血管淤血并有粒细胞扣押，弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡萎陷，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血(图1～3)。
图1 NS组正常肺组织形态结构(HE 10×10)
, 百拇医药
图2 LPS组弥漫性肺泡间隔增厚并有炎症细胞浸润，肺泡萎陷，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血，小血管内淤血并有粒细胞扣押(HE 10×10)
图3 LPS组高倍镜下见肺泡明显萎陷，肺间质和肺泡腔内见大量核呈分叶状的中性粒细胞浸润(HE 10×20)
3 讨 论
3.1 本实验给健康新西兰兔静注500 μg/kg LPS后，外周血WBC减少，动脉血氧分压下降，氧合指数<26.67 kPa，肺顺应性下降>50%，肺内动静脉分流增加>25%；BALF中蛋白浓度增加，肺湿重与干重比增加，提示肺毛细血管通透性增加。病理示弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血。这些病理生理变化均符合临床ARDS的改变。
, http://www.100md.com
3.2 研究表明NE在ALI的发病机制中起重要作用[25]。Donnelly等[2]通过放射免疫荧光法测定血浆NE水平，发现正常人NE血浓度为18.6 μg/L，多器官损伤但无ARDS者为117 μg/L，而多器官损伤并发生ARDS患者高达217 μg/L。而且血浆NE水平与氧合指数呈负相关，与机械通气的天数呈正相关。因此认为NE水平的高低可以预测ARDS发生的可能性。另外，ARDS患者BALF中除蛋白浓度、中性粒细胞和IL8增高外，NE也增高[5]。国外在内毒素致ALI大鼠模型和油酸致ALI豚鼠模型中，也发现BALF和血浆NE活性明显增高[11，12]。国内谢尔凡等[13]发现在烟雾吸入后，兔BALF中NE活性增高 ，并与血管外肺水量增加相关。本实验发现LPS组BALF中NE样活性为(10.10±4.52)μmol.L-1.h-1，明显高于NS组。说明在注射LPS后，肺泡腔内存在着大量激活的、游离的NE。
, 百拇医药
3.3 非心源性肺水肿是ALI的特征之一。在本实验中，LPS组BALF中的蛋白含量为(254±108)mg/kg，W/D为6.5±0.6，明显高于NS组，说明有大量血浆蛋白外渗，引起非心源性肺水肿。这可能与NE对血管屏障的破坏使血管通透性增加有关。NE的最适底物是弹性蛋白，此外，NE还能降解胶原蛋白、纤维连接蛋白等(这些物质都是构成肺泡细胞外基质的主要成分)。另外，Carden等[14]通过动物实验发现NE能分解钙粘连素(属钙依赖性细胞粘连分子家族，是细胞骨架之间相互连接的膜蛋白，它能在连接细胞之间形成同型带而限制溶质的外渗)，从而对肺微血管产生损伤。因此，在ALI时由于NE的大量释放，对血管屏障产生破坏，使血管通透性增加，大量血浆蛋白和活性物质渗透至肺间质和肺泡腔，造成非心源性肺水肿。
另外，NE还能分解补体；活化激肽、缓激肽、凝血纤溶系统和花生四烯酸等[15，16]；诱导细胞因子、生长因子及内皮素等[17]，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的NE。因此，这些多重效应构成了一个级联放大的网络，从而形成恶性循环。
, 百拇医药
3.4 α1AT是体内最主要的抗蛋白酶，血循环中90%的NE与α1AT结合形成NEα1AT复合物使NE失去活性，然后被网状内皮系统清除[18]。急性肺损伤时，中性粒细胞在肺毛细血管内趋化、粘附、聚集、激活，然后脱颗粒，释放出NE和氧自由基等对肺组织产生损伤。NE能分解细胞外基质和血管屏障，增加血管通透性；而氧自由基除引起肺实质细胞的死亡，还能氧化α1AT的活性中心蛋氨酸358，使α1AT失去对NE的抑制作用，从而使蛋白酶抗蛋白酶失衡[6]。本实验发现LPS组血浆α1AT含量也明显高于NS组，但由于NE样活性增高得更多，且α1AT的活性中心蛋氨酸残基容易被氧自由基氧化而失活[19]，因此，LPS组血浆α1AT活性却低于NS组。可见α1AT含量不足以抑制NE的活性，可能是肺组织损伤的重要原因。
, 百拇医药
3.5 中性粒细胞是参与肺损伤发病机制的主要炎症细胞。LPS组在静脉注射LPS后0.5小时外周血WBC就下降，并一直维持在很低的水平，这可能与中性粒细胞在肺组织内扣押有关。
肺泡表面活性物质(PS)是由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成和分泌的磷脂蛋白复合物。目前认为各种因素造成的PS继发性缺乏和活性下降是ARDS的重要发病机制之一[20]。实验发现LPS组总磷脂特别是饱和磷脂含量下降，这可能与NE对PS的降解有关，使PS功能发生改变[21]。
由此可见，在急性肺损伤时，中性粒细胞过度激活，释放出大量的NE，使蛋白酶抗蛋白酶失衡。而NE对肺血管屏障和其他生物活性物质具有破坏和激活作用，促进了肺损伤的发生。
基金项目：卫生部科技基金资助项目(981150)上海医科大学硕士研究生课题
, 百拇医药 注释：本文曾在香港第20届世界防痨联盟东亚区学术会议上交流
作者简介：揭志军(1973-)，男，江西贵溪人，硕士，医师。
作者单位：揭志军(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
杨文兰(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
蔡映云(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
金美玲(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
朱威(上海生物制品研究所，上海 200052；揭志军现在上海第二医科大学附属新华医院呼吸内科，上海 200092)
祝慈芳(上海生物制品研究所，上海 200052；揭志军现在上海第二医科大学附属新华医院呼吸内科，上海 200092)
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Vogelmeier C,Hubbard R C,Fells G A,et al.Anti-neutrophil elastase defense of the normal human respiratory epithelial surface provided by the secretory leukoprotease inhibitor.J Clin Invest,1991,87:482-488.
[2]Donnelly S C,MacGregor I,Zamani A,et al.Plasma elastase levels and the development of the adult respiratory distress syndrome.Am J Respir Crit Care Med,1995,151:1428-1433.
[3]Diaz J,Tornel P L,Jara P,et al.The value of polymorphonuclear elastase in adult respiratory distress syndrome.Clin Chim Acta,1995,236:119-127.
, 百拇医药
[4]Groeneveld A B,Raijmakers P G,Haik C E,et al.Interleukin 8related neutrophil elastase and the severity of the adult respiratory distress syndrome.Cytokine,1995,7(7):746-752.
[5]Taniguchi H,Koncloh Y,Ikuta N,et al.Diagnosis of acute respiratory distress syndrome:analysis of bronchoalveolar lavage fluid.Nippon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi,1995,33(Suppl):251-254.
[6]Gadek J E,Pacht E R.The interdependence of lung antioxdants and antiprotease defense in ARDS.Chest,1996,110:273s-277s.
, 百拇医药
[7]Dietz A A,Metais P,Johnson D,et al.Measurement of alphalantitrypsin in serum by immunodiffusion and by enzymatic assay.Clin Chem,1974,20(3):396-401.
[8]Bieth J,Spiss B,Wermuth C G.The synthesis and analytical use of a highly sensitive and convenient substrate of elastase.Biochem Med,1974,11:350-357.
[9]Mason R J,Nellenbogen J,Clements J A.Isolation of disaturated phosphatidylcholine with osmium tetroxide.J Lipid Res,1976,17:281-284.
, 百拇医药
[10]Bartlett G B.Phosphorus assay in column chromatography.J Biol Chem,1959,23:466468.
[11]Yasui S,Nagai A,Aoshiba K,et al.A specific neutrophil elastase inhibitor (ONO-5046.Na)attenuates LPS-induced acute lung inflammation in the hamster.Eur Respir J,1995,8:1293-1299.
[12]Moriuchi H,Zaha M,Fukumoto T,et al.Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury.Intensive Care Med,1998,24(7):709-715.
, http://www.100md.com
[13]谢尔凡，杨宗城，安静，等.中性粒细胞及其释放产物在烟雾吸入伤发病机制中的作用.中国病理生理杂志，1995，11(1)：37-41.
[14]Carden D,Xiao F,Moak C,et al.Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins.Am J Physiol,1998,275:H385-H392.
[15]Lasson A,Ohlsson K.Acute pancreatitis：the correlation between clinical course,protease inhibitors and complement and kinin activation.Scand J Gastroenterol,1984,19:707-710.
, http://www.100md.com
[16]Rivkind A I,Siegel J H,Guadalupi P,et al.Sequential patterns of eicosanoid,platelet,and neutrophils interactions in the evolution of fulminant post-traumatic adult respiratory distress syndrome.Ann Surg,1989,210:355-373.
[17]Pedard M,McClure C D,Schiller N L.Release of interleukin-8,interleukin-6 and colony stimulating factors by upper airway epithelial cells:implications for cystic fibrosis.Am J Respir Cell Mol Biol,1993,9:141-145.
, http://www.100md.com
[18]Ohlsson K,Laurell C B.The disappearance of enzyme-inhibitor complexes from the circulation of man.Clin Sic Mol Med,1976,51:87-92.
[19]Buhl R,Meyer A,Vogelmeier C.Oxidant-protease interaction in the lung:prospects for antioxidant therapy.Chest,1996,110:267s-272s.
[20]Lewis J F,Jobe A H.Surfactant and the adult respiratory distress syndrome.Am J Respir Crit Care Med,1993,147:218-233.
[21]Lian P F,Yin N X,Huang J,et al.Effects of human polymorphonuclear leukocyte elastase upon surfactant proteins in vitro.Biochim Biophys Acta,1996,1302(2):117-128., http://www.100md.com
摘 要：目的：研究蛋白酶抗蛋白酶失衡在内毒素诱发急性肺损伤(ALI)兔模型中的作用。方法：成年健康新西兰大白兔16只经麻醉、气管切开插管后给予机械通气。随机分成2组(每组8只)：即内毒素(LPS)致ALI模型组(LPS组)和生理盐水对照组(NS组)。监测动脉血氧分压(PaO2)、动脉血压(BP)、外周血白细胞数(WBC)、气道峰压(Ppeak)、静态总呼吸顺应性(TRC)和肺内动静脉分流(
s/t)等指标的变化；比较实验8小时后血浆α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)含量和活性、支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)样活性、α1-AT活性、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、总磷脂(TPL)、饱和磷脂酰胆碱(DSPC)含量及肺湿重与干重比(W/D)的差异。结果：与基础值相比，静注LPS后PaO2下降，氧合指数<26.67 kPa(1 kPa=7.5 mmHg),TRC下降>50%，肺内动静脉分流增加>25%；与NS组相比，血浆α1-AT含量增高但活性下降，外周血白细胞减少，而BALF中TP含量、NE样活性、IL-8和TNF-α浓度增加，α1-AT活性、TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP下降，W/D增高。结论：急性肺损伤时中性粒细胞过度活化并释放出NE，使蛋白酶抗-蛋白酶失衡；NE对肺血管屏障具有破坏作用，促进了肺损伤的发生。, http://www.100md.com
关键词：肺损伤，急性 α1-抗胰蛋白酶 弹性蛋白酶，中性粒细胞 兔 内毒素
急性肺损伤(ALI)是由于感染、休克和创伤等多种原因引起的肺部并发症，其发病机制尚不清楚。一般认为肺部炎症细胞的聚集并释放炎症介质从而损伤肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞是发病的重要病理基础，而中性粒细胞及其释放的弹性蛋白酶(NE)则起重要作用。
正常机体有足够的抗蛋白酶对抗NE的活性，防止正常组织受到NE的过度破坏。肺组织最主要的蛋白酶抑制物是α1抗胰蛋白酶(α1AT[1]，由肝细胞和单核细胞产生)。因此，NE与抗蛋白酶的平衡对维护肺组织的稳定性起重要作用。目前研究表明，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中NE的含量和活性明显增高，而抗蛋白酶含量相对不足，又易受到氧自由基的氧化失活，因此认为蛋白酶抗蛋白酶失衡在ALI的发病机制中起重要作用[26]。
, 百拇医药
本实验采用新西兰兔静脉注射内毒素脂多糖(LPS)制作ALI动物模型，研究NE与抗蛋白酶(如α1AT)失衡在ALI发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组：16只健康成年新西兰大白兔(由上海医科大学试验动物部提供)，雌雄不拘，体重2.0～2.5 kg，随机分成2组：①内毒素致ALI模型组(LPS组)；②生理盐水对照组(NS组)。
1.2 方 法：
1.2.1 实验动物：经兔耳缘静脉静注1%戊巴比妥钠20 mg/kg麻醉，然后气管切开，插入内径为3.5 mm的气管插管，接人工呼吸机(Siemens SV900c)进行机械通气，通气方式为定容通气。潮气量(VT)8～10 ml/kg，呼吸频率(RR)40次/min，吸∶呼(I∶E)为1∶2，吸入氧浓度(FiO2)为0.40。根据血气分析结果调节VT，使最初的二氧化碳分压(PaCO2)维持在4.76～6.00 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)。经耳缘静脉插入一静脉导管，建立静脉通道，经此进行补液和给药；直视下分离一侧颈总动脉，插入动脉导管并与压力换能器相连，连续检测体动脉压，并经此采集动脉血标本，用于血气分析和生化测定。在试验过程中，连续静滴1%戊巴比妥钠5 mg.kg-1.h-1维持麻醉，间断肌注潘库溴胺0.5 mg.kg-1.h-1，以抑制动物自主呼吸。用微量输液泵按8 ml.kg-1.h-1输入乳酸林格氏液以补充血容量，并根据情况进行调整。
, http://www.100md.com
1.2.2 动物麻醉和插管操作完毕后，稳定30分钟，然后测定基础数值，包括动脉血气、血常规、动脉血压(BP)、VT、气道峰压(Ppeak)、平台压(Pplate)、静态总呼吸顺应性(TRC)以及肺内动静脉分流(
s/t)等。1.2.3 2组动物在测定完基础数值后分别给药，LPS组由微量泵静注LPS(Escherichia coli,O55:B5，Sigma公司)500 μg/kg，30～45分钟输完；NS组静注0.9 % NaCl 1 ml/kg。然后连续机械通气8小时。实验过程中除
s/t于4和8小时复查外，其余生理指标均每小时复查1次。, 百拇医药
1.2.4 实验8小时后所有动物留取2 ml血浆待测α1AT含量和活性。然后过量戊巴比妥钠处死动物，立即打开胸腔，结扎左肺门，取左下肺置10%甲醛中固定，留待病理检查。取左上肺称湿重(W)后，置60 ℃恒温箱，48小时后再称干重(D)，计算肺湿重与干重比值(W/D)。右肺进行支气管肺泡灌洗(BAL)：用0.9% NaCl 10 ml/kg经右主支气管灌入，然后流出，再注入与前次流出量相等的0.9% NaCl，同法操作，共灌洗3次。灌洗液经双层纱布过滤后计算回收量，然后4 ℃离心(200×g)，留取上清液，分装7份后保存于-70 ℃超低温冰箱中，留待测定BALF中α1AT活性、NE样活性及总蛋白(TP)、白细胞介素8(IL8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、总磷脂(TPL)和饱和磷脂酰胆碱(DSPC)等的含量。
血浆中α1AT含量测定：采用速率散射比浊法(用美国BECKMAN公司的ARRAY 3.6型全自动特定蛋白药物分析系统进行测定)。
, 百拇医药
血浆和BALF中α1AT活性测定：BALF在-70 ℃冷冻抽干，浓缩10倍后再测定。按文献[7]方法进行测定，利用α1AT能抑制胰蛋白酶水解发色底物N苯甲酰DL精氨酸对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)的原理，建立测定α1AT生物活性的方法。
BALF中NE样活性按文献[8]方法测定：根据NE能分解底物Suc(Ala)3NA产生发光物质对硝基苯胺(pNA)的特点，用猪胰蛋白酶为标准参照，计算BALF中NE样活性。
BALF中IL8和TNFα含量测定：分别应用ELISA试剂盒采用双抗体夹心ABCELISA法测定(试剂盒购于上海森熊科技实业有限公司)。
BALF中TP测定：采用双缩脲法测定。
BALF中TPL和DSPC测定：BALF以2∶1的氯仿甲醇溶液分离，其中氯仿层含磷脂；饱和磷脂与其他磷脂的分离按文献[9]方法测定。经氮气吹干后，以四氧化锇氧化15分钟，然后氮气吹干，经20∶1的氯仿甲醇溶解后过中性铝柱，收集经氯仿甲醇氨水(70∶30∶2)洗脱后液体，便可得到已和其他磷脂分离的富含DSPC的液体。按文献[10]方法进行测定。
, http://www.100md.com
1.2.5 肺组织的病理观察：取左下肺数小块用石蜡包埋、切片、苏木紫伊红染色后光镜检查。
1.3 统计学方法：各组数据用general linear model procedure,Dunnett t方法处理；组间数据用studentnewmankeaultest方法处理。
2 结 果
2.1 实验过程中LPS组动脉血氧分压(PaO2)至5小时降为(10.05±3.15)kPa，氧合指数(PaO2/FiO2)<26.67 kPa，形成ARDS模型。同时Ppeak逐渐升高，TRC逐渐降低；外周血白细胞(WBC)0.5小时即明显下降，随后虽有所回升，但仍低于NS组。BP在0.5小时后开始下降(表1)。LPS组4小时和8小时的
s/t值均高于基础值和NS组(表2)。, http://www.100md.com
表1 2组动物生理指标的变化(X±s)
组别
基础值(0时)
0.5小时
1小时
2小时
3小时
PaO2(kPa)
LPS组
21.85±0.99
16.48±2.75＃*
15.73±3.49＃*
, http://www.100md.com
14.73±3.43＃*
11.32±1.93＃*
NS组
21.45±1.69
21.68±1.24
21.24±1.17
22.00±1.17
21.28±0.88
Ppeak(kPa)
LPS组
0.76±0.18
, http://www.100md.com
0.91±0.18
0.94±0.19＃*
1.07±0.17＃*
1.16±0.19＃*
NS组
0.76±0.08
0.75±0.08
0.79±0.06
0.80±0.05
0.77±0.03
TRC(ml/kPa)
, http://www.100md.com
LPS组
0.34±0.09
0.26±0.04＃*
0.25±0.04＃
0.21±0.03＃*
0.20±0.02＃*
NS组
0.29±0.06
0.29±0.05
0.29±0.04
0.29±0.04
, 百拇医药
0.29±0.03
WBC(×109/L)
LPS组
4.90±0.30
2.80±0.60＃*
2.00±0.40＃*
1.80±0.30＃*
2.10±0.50＃*
NS组
4.90±0.30
, 百拇医药 4.80±0.20
4.50±0.20
4.30±0.30
4.20±0.30
BP(kPa)
LPS组
12.40±0.97
9.44±0.84＃*
8.81±0.59＃*
8.72±0.49＃*
8.59±0.56＃*
, http://www.100md.com
NS组
12.27±0.93
12.39±0.91
12.33±1.03
12.31±0.92
12.72±0.85
组别
4小时
5小时
6小时
7小时
8小时
, 百拇医药 PaO2(kPa)
LPS组
11.08±3.96＃*
10.05±3.15＃*
9.21±2.73＃*
8.24±2.07＃*
7.32±1.63＃*
NS组
21.53±1.17
21.80±0.76
, 百拇医药
21.27±1.57
20.99±1.21
21.48±1.00
Ppeak(kPa)
LPS组
1.30±0.31＃*
1.41±0.42＃*
1.47±0.40＃*
1.50±0.36＃*
1.55±0.36＃*
, 百拇医药
NS组
0.80±0.04
0.78±0.03
0.79±0.04
0.82±0.03
0.81±0.03
TRC(ml/kPa)
LPS组
0.18±0.03＃*
0.17±0.04＃*
0.15±0.03＃*
, http://www.100md.com
0.15±0.03＃*
0.14±0.02＃*
NS组
0.29±0.03
0.28±0.03
0.28±0.04
0.28±0.03
0.28±0.03
WBC(×109/L)
LPS组
2.40±0.70＃*
, 百拇医药
2.50±0.50＃*
2.70±0.60＃*
2.80±0.80＃*
3.20±1.00＃*
NS组
4.20±0.30
4.20±0.30
4.60±0.30
4.80±0.30
5.20±0.30
BP(kPa)
, 百拇医药
LPS组
8.01±0.79＃*
7.73±0.73＃*
7.40±0.93＃*
6.95±1.21＃*
7.05±1.09＃*
NS组
12.80±0.69
12.80±0.65
12.64±0.89
, 百拇医药
12.67±1.09
12.47±0.96
注：与基础值比较：＃P<0.05；与NS组比较：*P<0.05；1 kPa=10.20 cmH2O
表2 2组动物实验后不同时间点
s/t值(X±s)组别
基础值(0时)
, http://www.100md.com
4小时
8小时
LPS组
14.7±1.6
21.8±2.8＃**
26.2±1.3＃**
NS组
12.8±1.5
14.3±1.4
14.1±1.4
注：与基础值比较：＃P<0.05；与NS组比较：**P<0.01
, http://www.100md.com
2.2 2组动物实验后血浆α1AT含量、活性以及W/D的比较：NS组α1AT含量<100 mg/L(超出了测定的最低范围)。LPS组α1AT含量较NS组增高，但其活性却低于NS组。LPS组W/D明显高于NS组(表3)。
表3 2组动物实验8小时后血浆α1AT含量和活性以及W/D值(X±s)
组别
α1AT含量
(mg/L)
α1AT活性
(U/L)
W/D
, 百拇医药
LPS组
406.0±222.0*
210.0±80.0*
6.5±0.6*
NS组
<100
340.0±150.0
4.9±0.1
注：与NS组比较：*P<0.05
2.3 2组动物BALF中各指标的比较：LPS组BALF中α1AT活性明显低于NS组；NE样活性、IL8、TNFα和TP含量较NS组均明显增高，而TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP均明显低于NS组(表4)。
, 百拇医药
表4 2组动物BALF中α1AT活性、NE样活性、IL8、TNFα、TP、TPL、DSPC/TPL和DSPC/TP测值(X±s)
组别
α1AT活性
(U/L)
NE样活性
(μmol.L-1.h-1)
IL8
(ng/L)
TNFα
, http://www.100md.com
(ng/L)
TP
(mg/kg)
TPL
(mg/kg)
DSPC/TPL
DSPC/TP
(mg/g)
LPS组
18.0± 4.0
10.10±4.52*
1159.8±280.4*
, 百拇医药
74.0±33.6*
254±108*
8.6±3.2*
0.286±0.046*
9.7±5.5*
NS组
31.0±10.0
0.96±0.48
139.3±52.7
18.3±9.2
, http://www.100md.com 67±22
13.1±1.6
0.417±0.018
81.5±5.8
注：与NS组比较：*P<0.05
2.4 各组间病理形态观察的比较：LPS组肉眼见病变呈双侧性分布，肺脏表面见点状出血，肺脏肿胀。光镜下炎性粒细胞浸润，小血管淤血并有粒细胞扣押，弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡萎陷，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血(图1～3)。
图1 NS组正常肺组织形态结构(HE 10×10)
, 百拇医药
图2 LPS组弥漫性肺泡间隔增厚并有炎症细胞浸润，肺泡萎陷，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血，小血管内淤血并有粒细胞扣押(HE 10×10)
图3 LPS组高倍镜下见肺泡明显萎陷，肺间质和肺泡腔内见大量核呈分叶状的中性粒细胞浸润(HE 10×20)
3 讨 论
3.1 本实验给健康新西兰兔静注500 μg/kg LPS后，外周血WBC减少，动脉血氧分压下降，氧合指数<26.67 kPa，肺顺应性下降>50%，肺内动静脉分流增加>25%；BALF中蛋白浓度增加，肺湿重与干重比增加，提示肺毛细血管通透性增加。病理示弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡腔内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血。这些病理生理变化均符合临床ARDS的改变。
, http://www.100md.com
3.2 研究表明NE在ALI的发病机制中起重要作用[25]。Donnelly等[2]通过放射免疫荧光法测定血浆NE水平，发现正常人NE血浓度为18.6 μg/L，多器官损伤但无ARDS者为117 μg/L，而多器官损伤并发生ARDS患者高达217 μg/L。而且血浆NE水平与氧合指数呈负相关，与机械通气的天数呈正相关。因此认为NE水平的高低可以预测ARDS发生的可能性。另外，ARDS患者BALF中除蛋白浓度、中性粒细胞和IL8增高外，NE也增高[5]。国外在内毒素致ALI大鼠模型和油酸致ALI豚鼠模型中，也发现BALF和血浆NE活性明显增高[11，12]。国内谢尔凡等[13]发现在烟雾吸入后，兔BALF中NE活性增高 ，并与血管外肺水量增加相关。本实验发现LPS组BALF中NE样活性为(10.10±4.52)μmol.L-1.h-1，明显高于NS组。说明在注射LPS后，肺泡腔内存在着大量激活的、游离的NE。
, 百拇医药
3.3 非心源性肺水肿是ALI的特征之一。在本实验中，LPS组BALF中的蛋白含量为(254±108)mg/kg，W/D为6.5±0.6，明显高于NS组，说明有大量血浆蛋白外渗，引起非心源性肺水肿。这可能与NE对血管屏障的破坏使血管通透性增加有关。NE的最适底物是弹性蛋白，此外，NE还能降解胶原蛋白、纤维连接蛋白等(这些物质都是构成肺泡细胞外基质的主要成分)。另外，Carden等[14]通过动物实验发现NE能分解钙粘连素(属钙依赖性细胞粘连分子家族，是细胞骨架之间相互连接的膜蛋白，它能在连接细胞之间形成同型带而限制溶质的外渗)，从而对肺微血管产生损伤。因此，在ALI时由于NE的大量释放，对血管屏障产生破坏，使血管通透性增加，大量血浆蛋白和活性物质渗透至肺间质和肺泡腔，造成非心源性肺水肿。
另外，NE还能分解补体；活化激肽、缓激肽、凝血纤溶系统和花生四烯酸等[15，16]；诱导细胞因子、生长因子及内皮素等[17]，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的NE。因此，这些多重效应构成了一个级联放大的网络，从而形成恶性循环。
, 百拇医药
3.4 α1AT是体内最主要的抗蛋白酶，血循环中90%的NE与α1AT结合形成NEα1AT复合物使NE失去活性，然后被网状内皮系统清除[18]。急性肺损伤时，中性粒细胞在肺毛细血管内趋化、粘附、聚集、激活，然后脱颗粒，释放出NE和氧自由基等对肺组织产生损伤。NE能分解细胞外基质和血管屏障，增加血管通透性；而氧自由基除引起肺实质细胞的死亡，还能氧化α1AT的活性中心蛋氨酸358，使α1AT失去对NE的抑制作用，从而使蛋白酶抗蛋白酶失衡[6]。本实验发现LPS组血浆α1AT含量也明显高于NS组，但由于NE样活性增高得更多，且α1AT的活性中心蛋氨酸残基容易被氧自由基氧化而失活[19]，因此，LPS组血浆α1AT活性却低于NS组。可见α1AT含量不足以抑制NE的活性，可能是肺组织损伤的重要原因。
, 百拇医药
3.5 中性粒细胞是参与肺损伤发病机制的主要炎症细胞。LPS组在静脉注射LPS后0.5小时外周血WBC就下降，并一直维持在很低的水平，这可能与中性粒细胞在肺组织内扣押有关。
肺泡表面活性物质(PS)是由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成和分泌的磷脂蛋白复合物。目前认为各种因素造成的PS继发性缺乏和活性下降是ARDS的重要发病机制之一[20]。实验发现LPS组总磷脂特别是饱和磷脂含量下降，这可能与NE对PS的降解有关，使PS功能发生改变[21]。
由此可见，在急性肺损伤时，中性粒细胞过度激活，释放出大量的NE，使蛋白酶抗蛋白酶失衡。而NE对肺血管屏障和其他生物活性物质具有破坏和激活作用，促进了肺损伤的发生。
基金项目：卫生部科技基金资助项目(981150)上海医科大学硕士研究生课题
, 百拇医药 注释：本文曾在香港第20届世界防痨联盟东亚区学术会议上交流
作者简介：揭志军(1973-)，男，江西贵溪人，硕士，医师。
作者单位：揭志军(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
杨文兰(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
蔡映云(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
金美玲(上海医科大学附属中山医院肺科，上海 200032)
朱威(上海生物制品研究所，上海 200052；揭志军现在上海第二医科大学附属新华医院呼吸内科，上海 200092)
祝慈芳(上海生物制品研究所，上海 200052；揭志军现在上海第二医科大学附属新华医院呼吸内科，上海 200092)
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Vogelmeier C,Hubbard R C,Fells G A,et al.Anti-neutrophil elastase defense of the normal human respiratory epithelial surface provided by the secretory leukoprotease inhibitor.J Clin Invest,1991,87:482-488.
[2]Donnelly S C,MacGregor I,Zamani A,et al.Plasma elastase levels and the development of the adult respiratory distress syndrome.Am J Respir Crit Care Med,1995,151:1428-1433.
[3]Diaz J,Tornel P L,Jara P,et al.The value of polymorphonuclear elastase in adult respiratory distress syndrome.Clin Chim Acta,1995,236:119-127.
, 百拇医药
[4]Groeneveld A B,Raijmakers P G,Haik C E,et al.Interleukin 8related neutrophil elastase and the severity of the adult respiratory distress syndrome.Cytokine,1995,7(7):746-752.
[5]Taniguchi H,Koncloh Y,Ikuta N,et al.Diagnosis of acute respiratory distress syndrome:analysis of bronchoalveolar lavage fluid.Nippon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi,1995,33(Suppl):251-254.
[6]Gadek J E,Pacht E R.The interdependence of lung antioxdants and antiprotease defense in ARDS.Chest,1996,110:273s-277s.
, 百拇医药
[7]Dietz A A,Metais P,Johnson D,et al.Measurement of alphalantitrypsin in serum by immunodiffusion and by enzymatic assay.Clin Chem,1974,20(3):396-401.
[8]Bieth J,Spiss B,Wermuth C G.The synthesis and analytical use of a highly sensitive and convenient substrate of elastase.Biochem Med,1974,11:350-357.
[9]Mason R J,Nellenbogen J,Clements J A.Isolation of disaturated phosphatidylcholine with osmium tetroxide.J Lipid Res,1976,17:281-284.
, 百拇医药
[10]Bartlett G B.Phosphorus assay in column chromatography.J Biol Chem,1959,23:466468.
[11]Yasui S,Nagai A,Aoshiba K,et al.A specific neutrophil elastase inhibitor (ONO-5046.Na)attenuates LPS-induced acute lung inflammation in the hamster.Eur Respir J,1995,8:1293-1299.
[12]Moriuchi H,Zaha M,Fukumoto T,et al.Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury.Intensive Care Med,1998,24(7):709-715.
, http://www.100md.com
[13]谢尔凡，杨宗城，安静，等.中性粒细胞及其释放产物在烟雾吸入伤发病机制中的作用.中国病理生理杂志，1995，11(1)：37-41.
[14]Carden D,Xiao F,Moak C,et al.Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins.Am J Physiol,1998,275:H385-H392.
[15]Lasson A,Ohlsson K.Acute pancreatitis：the correlation between clinical course,protease inhibitors and complement and kinin activation.Scand J Gastroenterol,1984,19:707-710.
, http://www.100md.com
[16]Rivkind A I,Siegel J H,Guadalupi P,et al.Sequential patterns of eicosanoid,platelet,and neutrophils interactions in the evolution of fulminant post-traumatic adult respiratory distress syndrome.Ann Surg,1989,210:355-373.
[17]Pedard M,McClure C D,Schiller N L.Release of interleukin-8,interleukin-6 and colony stimulating factors by upper airway epithelial cells:implications for cystic fibrosis.Am J Respir Cell Mol Biol,1993,9:141-145.
, http://www.100md.com
[18]Ohlsson K,Laurell C B.The disappearance of enzyme-inhibitor complexes from the circulation of man.Clin Sic Mol Med,1976,51:87-92.
[19]Buhl R,Meyer A,Vogelmeier C.Oxidant-protease interaction in the lung:prospects for antioxidant therapy.Chest,1996,110:267s-272s.
[20]Lewis J F,Jobe A H.Surfactant and the adult respiratory distress syndrome.Am J Respir Crit Care Med,1993,147:218-233.
[21]Lian P F,Yin N X,Huang J,et al.Effects of human polymorphonuclear leukocyte elastase upon surfactant proteins in vitro.Biochim Biophys Acta,1996,1302(2):117-128., http://www.100md.com