端粒酶与前列腺癌及其生物学行为的关系
邓春华 郑克立 陈炜 丘少鹏 曾金云 陈巧伦 陈小君 梅骅
摘要 目的：探讨端粒酶(TE)与前列腺癌(PCa)及其生物 学行为的关系。方法：应用端粒重复片段扩增法(TRAP法)检测39例PC a组织、15例前列腺增生(BPH)组织及10例正常前列腺(NP)组织中的TE活性，并比较TE活性水 平与PCa病理分化程度、临床分期及转移情况的关系。结果：PCa组织 中TE活性阳性率(89.7%)明显高于BPH组织(6.7%)及NP组织(0.0%)；在PCa组织中，病理分 化程度低、晚期及合并淋巴或(和)血行转移者的TE活性水平明显高于病理分化程度高、早期 及未合并转移者。结论：PCa的发病与TE被激活有关，TE可能成为PCa 早期诊断及鉴别诊断的一项新的肿瘤标志物，并可能与PCa病理分化程度、临床分期及转移 情况等生物学行为相关。
关键词：前列腺肿瘤 癌 端粒酶
研究表明，端粒酶(TE)活性与肿瘤的发生发展密切相关[1]。Sommerfild等[2]于1996年首先报道前列腺癌(PCa)组织中可检出TE活性。我们应用端粒重复片段扩增法(TRAP法)研究国人PCa组织、前列腺增生(BPH)组织及正常前列腺(NP)组织的TE活性，探讨TE与PCa及其生物学行为的关系。
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材料与方法
一、标本来源
39例PCa组织均为经直肠前列腺B超引导下穿刺活检标本。年龄52～89岁，平均72岁。按Jewett-whitmore-prout方法进行临床分期，WHO方法进行病理分级[3]。B期4例，C期14例，D期21例；未分化、低分化、中分化及高分化腺癌分别为2、14、10及13例。根据B超、CT或MRI及同位素骨扫描检查结果，合并淋巴或(和)血行转移者21例，无转移者18例。15例BPH组织来源于经耻骨上前列腺摘除手术的标本。年龄56～79岁，平均68岁，经病理学证实均为良性前列腺增生组织。10例NP组织取自意外死亡尸体，年龄22～41岁，平均28岁。上述标本获取后，立即取液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱中保存。
二、TRAP法检测TE活性
1.组织提取液的制备：取上述组织，进行液氮研磨，然后加入冷冻洗脱缓冲液离心，沉淀物用裂解缓冲液重新悬浮、孵育裂解，离心后的上清液为提取液，放于-80℃低温冰箱中保存待用。每例提取液经考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以1mg/ml为标准反应浓度。
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2.TE活性测定用TRAP-eze(TM)kit端粒酶活性试剂盒(Gene公司)进行检测。每例标本检测体积为50μl反应液，其中包含2μl提取液、74kBq(α-32P)dCTP(杜邦公司)和2UTaqDNA多聚酶(Promega公司)；按94℃30s，50℃30s，72℃90s进行32周PCR循环，产物在15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、分离，电泳后凝胶与X线胶片置于-80℃低温冰箱中作放射自显影24h，胶片出现6bp或6bp整数倍为间隔的梯形条带为阳性结果。
为了对端粒酶的表达活性进行半定量分析，实验参照Kamata等[4]方法将原端粒酶提取液分别稀释10倍和100倍，再用同样方法分别进行端粒酶表达活性的检测。将原液中端粒酶表达活性阴性者定为-，稀释10倍后转为阴性为+，稀释100倍后转为阴性为++，稀释100倍后仍为阳性者为+++。
三、统计学分析
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采用χ2检验及Wilcoxon秩和检验。
结 果
一、PCa、BPH及NP组织中TE活性阳性率
39例PCa组织中检出TE活性35例(89.7%)，而15例BPH组织中仅1例(6.7%)测得TE活性，10例NP组织中均未测得TE活性。PCa组织中TE活性阳性率显者高于BPH组织及NP组织，P<0.01(图1)。
图1 前列腺癌组织中端粒酶活性表达H.Hela细胞株为阳性对照；L.裂解缓冲液为
阴性对照；1.正常前列腺组织端粒酶活性呈阴性；4.前列腺增生组织端粒酶活性
呈阴性；2、3、5前列腺癌组织端粒酶活性呈阳性
, 百拇医药
二、TE活性与PCa病理分级及临床分期的关系
39例PCa组织中，根据其病理分化程度分为低(未)分化、中分化、高分化三组(因未分化PCa仅2例，故合并至低分化组)，各组间的TE活性水平差异有显著性(P<0.01)，低分化与中、高分化组织相比差异有显著性和非常显著性(P<0.05，P<0.01)；中分化与高分化组之间差异有显著性(P<0.05)。根据PCa临床分期将其分为B、C、D期，各组间的TE活性水平差异有显著性(P<0.05)，其中D期与B、C期相比差异有非常显著性(P<0.01)；B、C期之间相比差异无显著性(P>0.05，表1)。
表1 端粒酶(TE)活性与PCa病理分级、临床分期及转移的关系
例数
TE活性
+++
, 百拇医药
++
+
-
病理分级
低分化
16
11
5
0
0
中分化
10
2
1
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6
1
高分化
13
1
3
6
3
临床分期
B
4
1
1
2
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0
C
14
4
2
5
3
D
21
9
6
5
1
转移
, 百拇医药
有
21
10
6
3
2
无
18
2
3
8
2
三、PCa组织中TE活性与肿瘤转移的关系
, http://www.100md.com 39例PCa组织，21例合并淋巴或(和)血行转移者的TE活性水平显著高于18例未合并转移者(P<0.05，表1)。讨 论
TE是一种包含RNA模板的逆转录酶，与一般蛋白酶不同，它是一种核糖核蛋白复合体，需在RNA和蛋白质同时存在才具有活性[1，2]。在激活状态下，TE能发挥逆转录酶活性，特异地延长染色体末端DNA的重复序列，从而抵销或延缓端粒在正常情况下随细胞分裂的不断缩短。因此，TE被认为很可能在肿瘤的发生发展过程中起极为重要的作用[1，5]。人类TE活性首次由Morin[6]于1989年自Hela细胞系中分离出来。其后，大量的研究表明几乎所有的永生细胞和绝大部分的恶性肿瘤组织均有明显的TE活性，而正常人体细胞、部分良性肿瘤组织和非永生细胞系中则无或仅有极低的TE活性[1，6]。1994年Kim等[7]建立了以PCR技术为基础的TE活性检测方法--端粒重复片段扩增法(TRAP法)，由于TRAP法灵敏度极高，能检测到微量组织(如穿刺活检标本)的TE活性，使TE与人类肿瘤关系研究得到广泛开展。
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PCa与高龄、基因不稳定(肿瘤基因及肿瘤抑制基因突变)有密切关系[2]；PCa细胞能无限制地生长、分化，属于永生细胞；这些特征都可能与TE被激活有关。有学者发现PCa组织中具有TE活性[2]。Lin等[8]进一步发现PCa组织中的TE活性与PCa病理分化程度、临床分期及转移情况呈正相关。但Zhang等[9]的研究则认为TE活性与PCa患者血清前列腺特异抗原(PSA)水平、Gleason评分无相关关系。因此，有关PCa组织中TE活性与其生物学行为的关系尚未完全阐明。
本研究结果发现89.7%的PCa组织存在TE活性，而BPH及NP组织的TE活性检出率分别为6.7%和0.0%，PCa组织中的TE活性明显高于BPH及NP组织，与文献报告吻合，表明国人PCa发病也可能与TE被激活有关。应用高灵敏的TRAP法检测TE活性有助于PCa的早期诊断及鉴别诊断；并可能有助于PCa合并淋巴或远处转移灶的早期诊断。提示TE可能成为PCa早期诊断及鉴别诊断的一项新的肿瘤标志物。
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在分析TE活性与PCa生物学行为关系时，我们发现不同病理分化程度及不同临床分期的PCa组织中的TE活性水平存在显著的统计学差异，即分化不良的PCa组织的TE活性水平明显高于分化良好者，D期PCa组织的TE活性水平B、C期。我们还发现有淋巴或(和)血行转移的PCa患者其TE活性水平显著高于无转移者，与Lin等[8]的报告相似。表明PCa组织中的TE活性与浸润性肿瘤的发生、发展及肿瘤转移有关，TE活性表达高的PCa具有更大的恶性潜能，即PCa组织中的TE活性可能与其生物学行为有关。有人发现PCa转移灶(淋巴结或骨转移灶)的TE活性水平呈现异常高水平[8]。关于TE活性与PCa治疗效果、预期生存时间等的关系，有待进一步随访。对TE活性阳性的BPH，在施行前列腺切除术后，有必要进一步严密随访。
本课题受卫生部默沙东科学基金资助(97-007)
作者单位：邓春华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
, 百拇医药
郑克立(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
陈 炜(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
丘少鹏(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
曾金云(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
梅 骅(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
陈巧伦(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肿瘤研究所)
陈小君(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肿瘤研究所)
参考文献
, 百拇医药
1 De Lange T.Activation of telomerase in a human tumor.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91∶2882-2889.
2 Sommerfild HJ,Meeker AK,Piatyszek,et al.Telomerase activity:a prevalent mar ker of malignant human prostate tissue.Cancer Res,1996,56∶218-222.
3 孔祥田,郭应禄.前列腺癌的病理诊断.见:郭应禄主编.前列腺增生及前列腺癌.第1版. 北京:人民卫生出版社.1998,194-202.
4 Kamata S,Kageyama Y,Yonese J,et al.Significant telomere reduction in human superficial transitional cell carcinoma.Br J Urol,1996,78∶704-708.
, http://www.100md.com
5 Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase in human cancer.Eur J Cancer，19 97,33∶787-792.
6 Morin GB.The human telomere teminal transferase enzyme is a ribonucleo-pro tein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59∶521-525.
7 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomeras e activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266∶2011-2014.
8 Lin Y,Uemura H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in primary prostate can cer.J Urol,1997,157∶1161-1165.
9 Zhang W,Kapusta LR,Slingerland JM,et al.Telomerase activity in prostate can cer,prostatic intraepithelial neoplasia,and benign prostatic epithelium.Cancer R es,1998,58∶619-621., 百拇医药
摘要 目的：探讨端粒酶(TE)与前列腺癌(PCa)及其生物 学行为的关系。方法：应用端粒重复片段扩增法(TRAP法)检测39例PC a组织、15例前列腺增生(BPH)组织及10例正常前列腺(NP)组织中的TE活性，并比较TE活性水 平与PCa病理分化程度、临床分期及转移情况的关系。结果：PCa组织 中TE活性阳性率(89.7%)明显高于BPH组织(6.7%)及NP组织(0.0%)；在PCa组织中，病理分 化程度低、晚期及合并淋巴或(和)血行转移者的TE活性水平明显高于病理分化程度高、早期 及未合并转移者。结论：PCa的发病与TE被激活有关，TE可能成为PCa 早期诊断及鉴别诊断的一项新的肿瘤标志物，并可能与PCa病理分化程度、临床分期及转移 情况等生物学行为相关。
关键词：前列腺肿瘤 癌 端粒酶
研究表明，端粒酶(TE)活性与肿瘤的发生发展密切相关[1]。Sommerfild等[2]于1996年首先报道前列腺癌(PCa)组织中可检出TE活性。我们应用端粒重复片段扩增法(TRAP法)研究国人PCa组织、前列腺增生(BPH)组织及正常前列腺(NP)组织的TE活性，探讨TE与PCa及其生物学行为的关系。
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材料与方法
一、标本来源
39例PCa组织均为经直肠前列腺B超引导下穿刺活检标本。年龄52～89岁，平均72岁。按Jewett-whitmore-prout方法进行临床分期，WHO方法进行病理分级[3]。B期4例，C期14例，D期21例；未分化、低分化、中分化及高分化腺癌分别为2、14、10及13例。根据B超、CT或MRI及同位素骨扫描检查结果，合并淋巴或(和)血行转移者21例，无转移者18例。15例BPH组织来源于经耻骨上前列腺摘除手术的标本。年龄56～79岁，平均68岁，经病理学证实均为良性前列腺增生组织。10例NP组织取自意外死亡尸体，年龄22～41岁，平均28岁。上述标本获取后，立即取液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱中保存。
二、TRAP法检测TE活性
1.组织提取液的制备：取上述组织，进行液氮研磨，然后加入冷冻洗脱缓冲液离心，沉淀物用裂解缓冲液重新悬浮、孵育裂解，离心后的上清液为提取液，放于-80℃低温冰箱中保存待用。每例提取液经考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以1mg/ml为标准反应浓度。
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2.TE活性测定用TRAP-eze(TM)kit端粒酶活性试剂盒(Gene公司)进行检测。每例标本检测体积为50μl反应液，其中包含2μl提取液、74kBq(α-32P)dCTP(杜邦公司)和2UTaqDNA多聚酶(Promega公司)；按94℃30s，50℃30s，72℃90s进行32周PCR循环，产物在15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、分离，电泳后凝胶与X线胶片置于-80℃低温冰箱中作放射自显影24h，胶片出现6bp或6bp整数倍为间隔的梯形条带为阳性结果。
为了对端粒酶的表达活性进行半定量分析，实验参照Kamata等[4]方法将原端粒酶提取液分别稀释10倍和100倍，再用同样方法分别进行端粒酶表达活性的检测。将原液中端粒酶表达活性阴性者定为-，稀释10倍后转为阴性为+，稀释100倍后转为阴性为++，稀释100倍后仍为阳性者为+++。
三、统计学分析
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采用χ2检验及Wilcoxon秩和检验。
结 果
一、PCa、BPH及NP组织中TE活性阳性率
39例PCa组织中检出TE活性35例(89.7%)，而15例BPH组织中仅1例(6.7%)测得TE活性，10例NP组织中均未测得TE活性。PCa组织中TE活性阳性率显者高于BPH组织及NP组织，P<0.01(图1)。
图1 前列腺癌组织中端粒酶活性表达H.Hela细胞株为阳性对照；L.裂解缓冲液为
阴性对照；1.正常前列腺组织端粒酶活性呈阴性；4.前列腺增生组织端粒酶活性
呈阴性；2、3、5前列腺癌组织端粒酶活性呈阳性
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二、TE活性与PCa病理分级及临床分期的关系
39例PCa组织中，根据其病理分化程度分为低(未)分化、中分化、高分化三组(因未分化PCa仅2例，故合并至低分化组)，各组间的TE活性水平差异有显著性(P<0.01)，低分化与中、高分化组织相比差异有显著性和非常显著性(P<0.05，P<0.01)；中分化与高分化组之间差异有显著性(P<0.05)。根据PCa临床分期将其分为B、C、D期，各组间的TE活性水平差异有显著性(P<0.05)，其中D期与B、C期相比差异有非常显著性(P<0.01)；B、C期之间相比差异无显著性(P>0.05，表1)。
表1 端粒酶(TE)活性与PCa病理分级、临床分期及转移的关系
例数
TE活性
+++
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+
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病理分级
低分化
16
11
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中分化
10
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高分化
13
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临床分期
B
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有
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三、PCa组织中TE活性与肿瘤转移的关系
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TE是一种包含RNA模板的逆转录酶，与一般蛋白酶不同，它是一种核糖核蛋白复合体，需在RNA和蛋白质同时存在才具有活性[1，2]。在激活状态下，TE能发挥逆转录酶活性，特异地延长染色体末端DNA的重复序列，从而抵销或延缓端粒在正常情况下随细胞分裂的不断缩短。因此，TE被认为很可能在肿瘤的发生发展过程中起极为重要的作用[1，5]。人类TE活性首次由Morin[6]于1989年自Hela细胞系中分离出来。其后，大量的研究表明几乎所有的永生细胞和绝大部分的恶性肿瘤组织均有明显的TE活性，而正常人体细胞、部分良性肿瘤组织和非永生细胞系中则无或仅有极低的TE活性[1，6]。1994年Kim等[7]建立了以PCR技术为基础的TE活性检测方法--端粒重复片段扩增法(TRAP法)，由于TRAP法灵敏度极高，能检测到微量组织(如穿刺活检标本)的TE活性，使TE与人类肿瘤关系研究得到广泛开展。
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PCa与高龄、基因不稳定(肿瘤基因及肿瘤抑制基因突变)有密切关系[2]；PCa细胞能无限制地生长、分化，属于永生细胞；这些特征都可能与TE被激活有关。有学者发现PCa组织中具有TE活性[2]。Lin等[8]进一步发现PCa组织中的TE活性与PCa病理分化程度、临床分期及转移情况呈正相关。但Zhang等[9]的研究则认为TE活性与PCa患者血清前列腺特异抗原(PSA)水平、Gleason评分无相关关系。因此，有关PCa组织中TE活性与其生物学行为的关系尚未完全阐明。
本研究结果发现89.7%的PCa组织存在TE活性，而BPH及NP组织的TE活性检出率分别为6.7%和0.0%，PCa组织中的TE活性明显高于BPH及NP组织，与文献报告吻合，表明国人PCa发病也可能与TE被激活有关。应用高灵敏的TRAP法检测TE活性有助于PCa的早期诊断及鉴别诊断；并可能有助于PCa合并淋巴或远处转移灶的早期诊断。提示TE可能成为PCa早期诊断及鉴别诊断的一项新的肿瘤标志物。
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在分析TE活性与PCa生物学行为关系时，我们发现不同病理分化程度及不同临床分期的PCa组织中的TE活性水平存在显著的统计学差异，即分化不良的PCa组织的TE活性水平明显高于分化良好者，D期PCa组织的TE活性水平B、C期。我们还发现有淋巴或(和)血行转移的PCa患者其TE活性水平显著高于无转移者，与Lin等[8]的报告相似。表明PCa组织中的TE活性与浸润性肿瘤的发生、发展及肿瘤转移有关，TE活性表达高的PCa具有更大的恶性潜能，即PCa组织中的TE活性可能与其生物学行为有关。有人发现PCa转移灶(淋巴结或骨转移灶)的TE活性水平呈现异常高水平[8]。关于TE活性与PCa治疗效果、预期生存时间等的关系，有待进一步随访。对TE活性阳性的BPH，在施行前列腺切除术后，有必要进一步严密随访。
本课题受卫生部默沙东科学基金资助(97-007)
作者单位：邓春华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
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陈 炜(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
丘少鹏(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
曾金云(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
梅 骅(510080 广州，中山医科大学附属第一医院泌尿外科)
陈巧伦(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肿瘤研究所)
陈小君(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肿瘤研究所)
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1 De Lange T.Activation of telomerase in a human tumor.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91∶2882-2889.
2 Sommerfild HJ,Meeker AK,Piatyszek,et al.Telomerase activity:a prevalent mar ker of malignant human prostate tissue.Cancer Res,1996,56∶218-222.
3 孔祥田,郭应禄.前列腺癌的病理诊断.见:郭应禄主编.前列腺增生及前列腺癌.第1版. 北京:人民卫生出版社.1998,194-202.
4 Kamata S,Kageyama Y,Yonese J,et al.Significant telomere reduction in human superficial transitional cell carcinoma.Br J Urol,1996,78∶704-708.
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5 Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase in human cancer.Eur J Cancer，19 97,33∶787-792.
6 Morin GB.The human telomere teminal transferase enzyme is a ribonucleo-pro tein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59∶521-525.
7 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomeras e activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266∶2011-2014.
8 Lin Y,Uemura H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in primary prostate can cer.J Urol,1997,157∶1161-1165.
9 Zhang W,Kapusta LR,Slingerland JM,et al.Telomerase activity in prostate can cer,prostatic intraepithelial neoplasia,and benign prostatic epithelium.Cancer R es,1998,58∶619-621., 百拇医药