半乳糖寡糖在体内和体外对双歧杆菌生长的影响
王筱兰 魏东芝 陈少欣 俞俊棠
摘 要：目的：利用固定化产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢 杆菌连续合成的产物。方法：经柱层析分离纯化得到了纯半乳糖三寡糖和 半乳糖四寡糖，用于体外双歧杆菌培养和动物试验。结果：证实了半乳糖寡糖能高效、专一地促进双歧杆菌的生长繁殖。结论：半乳糖寡糖具有改 善小鼠肠道内菌群分布，降低小鼠盲肠内pH值的生理功能。
关键词：半乳糖寡糠 双歧杆菌 动物试验
半乳糖寡糖(Galacto-oligosacchrides,GOS)是β-半乳糖苷酶在水解乳糖的过 程中通过转糖苷作用合成的低聚糖[1，2]，它是指在乳糖的半乳糖一侧又结合上 了1～4个分子的半乳糖的结合糖，分子式为(Gal)n，含单糖数2～6，半乳糖之间以β(1→ 3)、β(1→4)、β(1→6)键相联，其中以β(1→4)键为主[3，4]。半乳糖寡糖被 证明是母乳中的重要组分[5]，具有独特的天然属性。GOS作为第三代功能食品的 功能因子，在酸性和高温条件下具有极好的稳定性，在食品的加工过程中结构和性质不会改 变，是理想的食品配料。
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本文利用固定化细胞连续合成的产物，经柱层析分离纯化得到纯度为99.99%的半乳糖三寡 糖和半乳糖四寡糖纯品，用于添加到培养基中在体外培养双歧杆菌和喂食小白鼠，验证GOS 在体内、体外对双歧杆菌生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 双歧杆菌 本所保藏。
1.1.2 硫乙醇酸盐培养基 上海生物制品研究所。
1.1.3 试验动物 初生普通级昆明种雄性小白鼠，体重20g±1.5g，购于上海 医科大学动物房。普通鼠饲料，由上海医科大学动物房提供。
1.1.4 喂食的糖液 Group lactose:10%的乳糖溶液；Group GOS:10%半乳糖三 寡糖溶液。
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1.1.5 试剂 乳糖及其它试剂都为A.R.
1.1.6 HPLC色谱仪 型号：SCL-10AVP日本SHIMADZU公司。
1.2 试验方法
1.2.1 半乳糖寡糖分离纯化
1.2.1.1 分别称取80g的硅藻土和活性炭，以1∶1的比例混合，加水使其混成浆状，用 高径比为22∶1的玻璃柱装柱；
1.2.1.2 将固定化细胞连续合成的含半乳糖寡糖产物的溶液10ml(总糖浓度为10%)上柱 。上柱时注意要沿柱内壁缓慢加入；
1.2.1.3 各种糖组分的洗脱：
先用500ml的去离子水洗脱单糖，用自动部分收集器每隔28min收集一管。糖的检测：每管取 100μl至另一试管中用去离子水稀释至1ml；将稀释液滴加2滴～3滴0.2%α-萘酚作指示剂 ，再加入1ml浓硫酸，摇动后静置几分钟，如果出现紫红色色带，则表明有糖液洗出，直到不再出现紫红色带为止，则认为单糖已经洗脱完毕；
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再用500ml含5%的乙醇水溶液洗脱双糖，检测方法同上；
用600ml含10%的乙醇溶液洗脱三糖，800ml15%的乙醇溶液洗脱四糖；
将含有半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖溶液的洗脱液蒸发浓缩，然后真空冷冻干燥，得到糖的 纯品。HPLC分析其纯度为99.99%。
1.2.2 半乳糖寡糖的分析 采用HPLC分析。层析柱：Lichosorb RP18(25cm×1 5cm)。色谱条件为：流动相 乙腈：H2O=70∶30(V/V),流速为1.0ml/min,柱温为40℃，进 样量为10μl。
1.2.3 体外双歧杆菌培养方法 将半乳糖寡糖溶液加入配制好的液体硫乙酸盐 培养基中稀释成不同浓度，灭菌，接种双歧杆菌，38℃厌氧培养48h。将培养好的菌液取出 ，稀释10倍后在550nm下测其OD，并以OD值代表菌体浓度。
, 百拇医药
1.2.4 试验动物准备及饲养 将购买回的试验用15只昆明种小白鼠称重，记录 ，分为3组，每组5只，分开饲养。每天称量每只小白鼠的体重，摄食量，水量随意；2天后 ，开始饲喂试验用的糖类，GOS组：喂食10%的半乳糖寡糖溶液；乳糖组：喂食10%乳糖溶液 ；对照组：只喂食普通鼠饲料和去离子水。前7天按0.15ml(该量是根据人对GOS的有效吸收 剂量为3g～6g而来)的糖量用微量注射器进行灌喂，从第8天开始，剂量加到0.2ml。第16天 解剖小白鼠取盲肠用于测定盲肠内含物、pH、菌数。
1.2.5 小白鼠盲肠数据测定 将盲肠内含物取出称重。将已称重的盲肠内含物 置于试管用3ml无菌水浸泡，振荡10min，离心15min，取上清液测定pH值及菌落数。采用稀 释到平板的方法，将上清液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10 -4、10-5，吸取0.1ml10-3、10-4、10-5的稀释液涂布 于硫乙酸盐培养基平板上，再置于厌气罐中，38℃厌氧培养48h。0.1ml10-3、10 -4、10-5的稀释液涂布于EMB培养基平板上，置于37℃培养箱中培养24h，数菌 落数分别计算盲肠内含物中双歧杆菌和大肠杆菌数。
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2 结 果
2.1 HPLC检测10%乙醇洗脱液及15%乙醇洗脱液
由图1可看出用10%乙醇洗脱得到的糖液，在12.50min出峰为半乳糖三寡糖，纯度为99.99% 。由图2可看出用15%乙醇洗脱得到的糖液，在20.77min出峰为半乳糖四寡糖，纯度为99.9 9%。
图1 10%乙醇洗脱液HPLC图谱
图2 15%乙醇洗脱液HPLC图谱
2.2 半乳糖寡糖对双歧杆菌生长的影响
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半乳糖寡糖浓度在1g/L～5g/L内都能促进双歧杆菌生长，半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖浓度 为5g/L时对双歧杆菌生长的促进作用最大，分别比对照高出3.5倍和4.0倍。当半乳糖寡糖浓度大于5g/L时对双歧杆菌生长有一定抑制作用。半乳糖四寡糖对双歧杆菌生长的促进作用 大于半乳糖三寡糖，这可能是由于双歧杆菌内的β-半乳糖甘酶优先分解利用半乳糖四寡糖。
图3 半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖对双歧杆 菌菌浓度的影响
○-半乳糖四寡糖；△-半乳糖三寡糖
2.3 灌喂半乳糖寡糖对小鼠盲肠内含物及pH值的影响
盲肠是动物体内双歧杆菌定殖的主要部位，盲肠内含物的重量在一定程度上能够反应双歧杆 菌在肠道内生长状况。由表1可看出：喂食半乳糖三寡糖的小鼠盲肠内含物质量比对照组有 明显的增加。由于小鼠盲肠内的双歧杆菌在生长繁殖的过程中，利用半乳糖三寡糖作为基质 发酵，产生挥发性有机酸，从而大大降低了盲肠内pH值。
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表1 半乳糖三寡糖对小鼠盲肠内含物及pH值的影响
组 别
对照组
乳糖组
半乳糖三寡糖组
盲肠内含物
9.9±0.6
10.1±064
12.5±0.5
盲肠内pH
7.2±0.2
7.1±0.3
, 百拇医药
6.4±0.2
注：*表中数值是5只小鼠的平均值和标准偏差
2.4 灌喂半乳糖寡糖对小白鼠肠道菌群的影响
表2 半乳糖三寡糖对小鼠盲肠内菌群的影响
组 别
对照组
乳糖组
半乳糖三寡糖组
双歧杆菌
(4.5±0.3)×105
(3.8±0.1)×105
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(1.6±0.2 )×107
大肠杆菌
(5.0±0.8)×105
(9.2±0.4)×104
(1.8±0.7)×104)
注：*表中数值为5只小鼠的平均值和标准偏差
喂食半乳糖三寡糖的小鼠的盲肠内双歧杆菌数比对照组高出35倍，而大肠杆菌数比对照组降 低了28倍。半乳糖寡糖能促进有益菌在小鼠肠道内的定殖，抑制有害菌在肠道内的生长繁殖 。
3 讨 论
, 百拇医药 在体外直接把半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖添加到硫乙酸盐液体培养基中，能使菌体浓度比 对照组分别提高3.5倍和4.0倍。在体内试验中，喂食了半乳糖三寡糖的小鼠，盲肠内双歧 杆菌数比对照组高出了35倍。因此，通过体内、体外试验都验证了半乳糖寡糖是一种双歧因 子，能高效专一地促进双歧杆菌的生长繁殖。
半乳糖寡糖不被口腔和胃中消化液的酶利用，只有大肠和盲肠中的双歧杆菌具有β-半乳糖 苷酶，能分解利用半乳糖寡糖，产生挥发性有机酸主要是乙酸和乳酸，增加肠内酸池浓度， 降低肠道内pH值，抑制有害菌的生长，改善肠道菌群分布。
作者单位：王筱兰 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
魏东芝 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
陈少欣 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
, http://www.100md.com
俞俊棠 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
参考文献
[1]Prenosil J E,Stuker E,Bourne J R.Formation of oligoosaccharides during enzymatic lactose.Biotechnology and Bioengineering,1987,30(PtⅠ): 1019～1025.
[2]Prenosil J E,Stuker E,Bourne J R.Formation of oligoosaccharides during enzymatic lactose.Biotechnology and Bioengineering,1987,30(PtⅡ): 1026～1031.
[3]Toba T,Yokota A,Adachi S.Oligosccharide structures formed during the hydrolysis of lactose by Aspergillus orzyme β-galactosidase.Food Chemistry,1985,16:147～162.
, 百拇医药
[4]Kazumasa K,Keisuke M,Chiyoko I,et al.Structure determintion of galacto-oligosaccharides by pyridylamination and NMR spectroscopy.Carbohydrate Rese arch,1995,270:33～42.
[5]Yamashit K,Kobata A.Oligosaccharide of human milk.Isolation and characterization of a new trisaccharide,6'-galactooligosaccharide.Arch Biochem Biophs,1974,161:164～170., 百拇医药
摘 要：目的：利用固定化产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢 杆菌连续合成的产物。方法：经柱层析分离纯化得到了纯半乳糖三寡糖和 半乳糖四寡糖，用于体外双歧杆菌培养和动物试验。结果：证实了半乳糖寡糖能高效、专一地促进双歧杆菌的生长繁殖。结论：半乳糖寡糖具有改 善小鼠肠道内菌群分布，降低小鼠盲肠内pH值的生理功能。
关键词：半乳糖寡糠 双歧杆菌 动物试验
半乳糖寡糖(Galacto-oligosacchrides,GOS)是β-半乳糖苷酶在水解乳糖的过 程中通过转糖苷作用合成的低聚糖[1，2]，它是指在乳糖的半乳糖一侧又结合上 了1～4个分子的半乳糖的结合糖，分子式为(Gal)n，含单糖数2～6，半乳糖之间以β(1→ 3)、β(1→4)、β(1→6)键相联，其中以β(1→4)键为主[3，4]。半乳糖寡糖被 证明是母乳中的重要组分[5]，具有独特的天然属性。GOS作为第三代功能食品的 功能因子，在酸性和高温条件下具有极好的稳定性，在食品的加工过程中结构和性质不会改 变，是理想的食品配料。
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本文利用固定化细胞连续合成的产物，经柱层析分离纯化得到纯度为99.99%的半乳糖三寡 糖和半乳糖四寡糖纯品，用于添加到培养基中在体外培养双歧杆菌和喂食小白鼠，验证GOS 在体内、体外对双歧杆菌生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 双歧杆菌 本所保藏。
1.1.2 硫乙醇酸盐培养基 上海生物制品研究所。
1.1.3 试验动物 初生普通级昆明种雄性小白鼠，体重20g±1.5g，购于上海 医科大学动物房。普通鼠饲料，由上海医科大学动物房提供。
1.1.4 喂食的糖液 Group lactose:10%的乳糖溶液；Group GOS:10%半乳糖三 寡糖溶液。
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1.1.5 试剂 乳糖及其它试剂都为A.R.
1.1.6 HPLC色谱仪 型号：SCL-10AVP日本SHIMADZU公司。
1.2 试验方法
1.2.1 半乳糖寡糖分离纯化
1.2.1.1 分别称取80g的硅藻土和活性炭，以1∶1的比例混合，加水使其混成浆状，用 高径比为22∶1的玻璃柱装柱；
1.2.1.2 将固定化细胞连续合成的含半乳糖寡糖产物的溶液10ml(总糖浓度为10%)上柱 。上柱时注意要沿柱内壁缓慢加入；
1.2.1.3 各种糖组分的洗脱：
先用500ml的去离子水洗脱单糖，用自动部分收集器每隔28min收集一管。糖的检测：每管取 100μl至另一试管中用去离子水稀释至1ml；将稀释液滴加2滴～3滴0.2%α-萘酚作指示剂 ，再加入1ml浓硫酸，摇动后静置几分钟，如果出现紫红色色带，则表明有糖液洗出，直到不再出现紫红色带为止，则认为单糖已经洗脱完毕；
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再用500ml含5%的乙醇水溶液洗脱双糖，检测方法同上；
用600ml含10%的乙醇溶液洗脱三糖，800ml15%的乙醇溶液洗脱四糖；
将含有半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖溶液的洗脱液蒸发浓缩，然后真空冷冻干燥，得到糖的 纯品。HPLC分析其纯度为99.99%。
1.2.2 半乳糖寡糖的分析 采用HPLC分析。层析柱：Lichosorb RP18(25cm×1 5cm)。色谱条件为：流动相 乙腈：H2O=70∶30(V/V),流速为1.0ml/min,柱温为40℃，进 样量为10μl。
1.2.3 体外双歧杆菌培养方法 将半乳糖寡糖溶液加入配制好的液体硫乙酸盐 培养基中稀释成不同浓度，灭菌，接种双歧杆菌，38℃厌氧培养48h。将培养好的菌液取出 ，稀释10倍后在550nm下测其OD，并以OD值代表菌体浓度。
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1.2.4 试验动物准备及饲养 将购买回的试验用15只昆明种小白鼠称重，记录 ，分为3组，每组5只，分开饲养。每天称量每只小白鼠的体重，摄食量，水量随意；2天后 ，开始饲喂试验用的糖类，GOS组：喂食10%的半乳糖寡糖溶液；乳糖组：喂食10%乳糖溶液 ；对照组：只喂食普通鼠饲料和去离子水。前7天按0.15ml(该量是根据人对GOS的有效吸收 剂量为3g～6g而来)的糖量用微量注射器进行灌喂，从第8天开始，剂量加到0.2ml。第16天 解剖小白鼠取盲肠用于测定盲肠内含物、pH、菌数。
1.2.5 小白鼠盲肠数据测定 将盲肠内含物取出称重。将已称重的盲肠内含物 置于试管用3ml无菌水浸泡，振荡10min，离心15min，取上清液测定pH值及菌落数。采用稀 释到平板的方法，将上清液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10 -4、10-5，吸取0.1ml10-3、10-4、10-5的稀释液涂布 于硫乙酸盐培养基平板上，再置于厌气罐中，38℃厌氧培养48h。0.1ml10-3、10 -4、10-5的稀释液涂布于EMB培养基平板上，置于37℃培养箱中培养24h，数菌 落数分别计算盲肠内含物中双歧杆菌和大肠杆菌数。
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2 结 果
2.1 HPLC检测10%乙醇洗脱液及15%乙醇洗脱液
由图1可看出用10%乙醇洗脱得到的糖液，在12.50min出峰为半乳糖三寡糖，纯度为99.99% 。由图2可看出用15%乙醇洗脱得到的糖液，在20.77min出峰为半乳糖四寡糖，纯度为99.9 9%。
图1 10%乙醇洗脱液HPLC图谱
图2 15%乙醇洗脱液HPLC图谱
2.2 半乳糖寡糖对双歧杆菌生长的影响
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半乳糖寡糖浓度在1g/L～5g/L内都能促进双歧杆菌生长，半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖浓度 为5g/L时对双歧杆菌生长的促进作用最大，分别比对照高出3.5倍和4.0倍。当半乳糖寡糖浓度大于5g/L时对双歧杆菌生长有一定抑制作用。半乳糖四寡糖对双歧杆菌生长的促进作用 大于半乳糖三寡糖，这可能是由于双歧杆菌内的β-半乳糖甘酶优先分解利用半乳糖四寡糖。
图3 半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖对双歧杆 菌菌浓度的影响
○-半乳糖四寡糖；△-半乳糖三寡糖
2.3 灌喂半乳糖寡糖对小鼠盲肠内含物及pH值的影响
盲肠是动物体内双歧杆菌定殖的主要部位，盲肠内含物的重量在一定程度上能够反应双歧杆 菌在肠道内生长状况。由表1可看出：喂食半乳糖三寡糖的小鼠盲肠内含物质量比对照组有 明显的增加。由于小鼠盲肠内的双歧杆菌在生长繁殖的过程中，利用半乳糖三寡糖作为基质 发酵，产生挥发性有机酸，从而大大降低了盲肠内pH值。
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表1 半乳糖三寡糖对小鼠盲肠内含物及pH值的影响
组 别
对照组
乳糖组
半乳糖三寡糖组
盲肠内含物
9.9±0.6
10.1±064
12.5±0.5
盲肠内pH
7.2±0.2
7.1±0.3
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6.4±0.2
注：*表中数值是5只小鼠的平均值和标准偏差
2.4 灌喂半乳糖寡糖对小白鼠肠道菌群的影响
表2 半乳糖三寡糖对小鼠盲肠内菌群的影响
组 别
对照组
乳糖组
半乳糖三寡糖组
双歧杆菌
(4.5±0.3)×105
(3.8±0.1)×105
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(1.6±0.2 )×107
大肠杆菌
(5.0±0.8)×105
(9.2±0.4)×104
(1.8±0.7)×104)
注：*表中数值为5只小鼠的平均值和标准偏差
喂食半乳糖三寡糖的小鼠的盲肠内双歧杆菌数比对照组高出35倍，而大肠杆菌数比对照组降 低了28倍。半乳糖寡糖能促进有益菌在小鼠肠道内的定殖，抑制有害菌在肠道内的生长繁殖 。
3 讨 论
, 百拇医药 在体外直接把半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖添加到硫乙酸盐液体培养基中，能使菌体浓度比 对照组分别提高3.5倍和4.0倍。在体内试验中，喂食了半乳糖三寡糖的小鼠，盲肠内双歧 杆菌数比对照组高出了35倍。因此，通过体内、体外试验都验证了半乳糖寡糖是一种双歧因 子，能高效专一地促进双歧杆菌的生长繁殖。
半乳糖寡糖不被口腔和胃中消化液的酶利用，只有大肠和盲肠中的双歧杆菌具有β-半乳糖 苷酶，能分解利用半乳糖寡糖，产生挥发性有机酸主要是乙酸和乳酸，增加肠内酸池浓度， 降低肠道内pH值，抑制有害菌的生长，改善肠道菌群分布。
作者单位：王筱兰 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
魏东芝 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
陈少欣 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
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俞俊棠 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237
参考文献
[1]Prenosil J E,Stuker E,Bourne J R.Formation of oligoosaccharides during enzymatic lactose.Biotechnology and Bioengineering,1987,30(PtⅠ): 1019～1025.
[2]Prenosil J E,Stuker E,Bourne J R.Formation of oligoosaccharides during enzymatic lactose.Biotechnology and Bioengineering,1987,30(PtⅡ): 1026～1031.
[3]Toba T,Yokota A,Adachi S.Oligosccharide structures formed during the hydrolysis of lactose by Aspergillus orzyme β-galactosidase.Food Chemistry,1985,16:147～162.
, 百拇医药
[4]Kazumasa K,Keisuke M,Chiyoko I,et al.Structure determintion of galacto-oligosaccharides by pyridylamination and NMR spectroscopy.Carbohydrate Rese arch,1995,270:33～42.
[5]Yamashit K,Kobata A.Oligosaccharide of human milk.Isolation and characterization of a new trisaccharide,6'-galactooligosaccharide.Arch Biochem Biophs,1974,161:164～170., 百拇医药