双歧杆菌血凝特性的研究
郑跃杰 潘令嘉 王立生 周殿元
摘 要：观察3株双歧杆菌对人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠红细胞的凝集滴度，并对其血凝素进行了提取。结果表明，3株双歧杆菌均能凝集各种来源的红细胞，血凝滴度无明显差异；D-甘露糖不能抑制血凝。提取的脂磷壁酸(LTA)具有血凝活性。其血凝素受体为糖类。
关键词：血凝素 双歧杆菌
血凝试验已被广泛应用于研究细菌与宿主细胞之间的粘附[1，2] 。广义而言，血凝素也是一种粘附素，已证实一些细菌的血凝素和粘附素为同一物质，如肠 毒性大肠杆菌的菌毛既能粘附于人或动物的肠上皮细胞，又能凝集不同种的红细胞，呈现甘 露糖抵抗血凝(MRHA)。血凝试验已作为一些细菌的粘附能力的标志，并用作菌毛检测分型及 鉴别毒力的依据[3，4]。双歧杆菌是人体肠道最重要的生理性细菌，它的粘附与 定植对维持肠道正常菌群的稳定，抵御外来细菌的入侵起主导作用。但迄今为止，尚未见到 双歧杆菌血凝特性的研究报道，本研究系统地观察了双歧杆菌的血凝特性。
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1 材料与方法
1.1 血凝试验
1.1.1 菌株及生长条件 双歧杆菌1027及1124株为本所从健康婴儿粪便 分离，经多次生化鉴定为青春型双歧杆菌。日本青春型双歧杆菌标准株由深圳南山区医院曾 忠铭博士提供。将细菌分别接种于双歧杆菌选择性琼脂平板及硫乙醇酸盐液体培养基，37℃ ，厌氧培养48h后，固体生长的细菌用pH7.4PBS，液体生长的细菌分别用耗尽培养液上清、 新鲜培养液及PBS悬浮细菌，调整菌悬液浓度为1×108/ml。
1.1.2 血凝试验 采取人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠新鲜血(柠檬 酸盐抗凝)，红细胞经0.9%盐水洗涤3次后，悬浮于盐水内，制成2%(V/V)红细胞悬液。将等 量(150μl)对倍稀释的细菌悬液和红细胞悬液加入“U”形底的40孔酶联反应板内，振荡后 ，置37℃温育1h观察结果，并经显微镜下观察证实。能引起血凝反应的菌悬液最高稀释度为 血凝滴度。
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1.2 各种处理因素的影响
1.2.1 对耗尽培养液上清的处理 耗尽培养液上清分别经胰蛋白酶(37℃ 30min)，牛血清白蛋白(BSA)(37℃ 30min)，氢氧化钠(37℃ 30min)和高温(100℃ 10min )处理后，进行血凝试验。
1.2.2 对红细胞悬液的处理 红细胞悬液分别经不同浓度过磺酸钠(37℃ 30min)或胰蛋白酶(37℃ 30min)处理后，进行血凝试验。
1.2.3 各种糖抑制试验 于双歧杆菌耗尽培养液上清中分别加入葡萄糖,乳糖，蔗糖，D-果糖，L-山梨糖，棉子糖，麦芽糖，纤维二糖，D-木糖，鼠李糖及D-甘露糖 (终浓度1%)，进行试验，用pH7.4PBS作对照。
1.3 双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)的提取 将液体培养的双歧杆菌细菌悬液离心3000 rpm，10分钟，上清即为细菌耗尽培养液上清。参照文献[5～7]，于耗尽培养液 上清中加入等体积重蒸酚,在 65℃ 下振摇30min，冷却后，离心4000rpm 20min，收集 水相。重复酚提一次，终产物经蛋白酶K消化以去除残留蛋白。
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2 结 果
2.1 双歧杆菌的血凝活性 3株青春型双歧杆菌对6种红细胞的血凝滴度见 表1，3株细菌均能凝集6种红细胞，菌株间及各种红细胞间无显著差异。
表1 双歧杆菌血凝滴度
菌株
人O
人B
绵羊
兔
鸡
小鼠
标准株
1∶4
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1∶4
1∶4
1∶2
1∶4
1∶4
1027株
1∶4
1∶4
1∶4
1∶2
1∶4
1∶4
1124朱
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1∶4
1∶4
1∶4
1∶2
1∶4
1∶4
2.2 生长条件对双歧杆菌血凝的影响 双歧杆菌分别于硫乙醇酸盐液体及 双歧杆菌选择性固体培养基生长后，分别与人O型及人B型红细胞进行血凝试验，结果见表2 ，固体培养的双歧杆菌的血凝滴度略低于液体生长者。液体生长的双歧杆菌用原耗尽培养液 上清悬浮后具有血凝活性，而用新鲜培养液或BPS悬浮则无血凝活性；单独耗尽培养液上清 也具有血凝活性。说明，耗尽培养液上清中含双歧杆菌血凝素。表2 液体及固体培养双歧杆菌血凝滴度的比较
菌株
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液体培养双歧杆菌
耗尽
上清
固体培养
PBS悬浮
悬 浮
新鲜培养液 悬浮
PBS悬浮
标准株
1∶4
-
-
1∶4
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1∶2
1027株
1∶4
-
-
1∶4
1∶2
1124株
1∶4
-
-
1∶4
1∶2
, http://www.100md.com 2.3 双歧杆菌血凝素的确定 为确定血凝素的性质，观察了耗尽培养液上 清经各种处理后对血凝的影响，结果见表3，血凝活性能被BSA及NaOH抑制；不受胰蛋白酶及 温度的影响。根据这一结果，对双歧杆菌血凝素进行了初步提取，证实其血凝素为LTA。表3 耗尽培养液上清经各种处理对血凝的影响
处理因素
耗 尽培养液上清
标准株
1027株
1124株
对照
+
+
+
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胰蛋白酶(25mg/ml)
+
+
+
胰蛋白酶(12.5mg/ml)
+
+
+
BSA(50mg/ml)
-
-
-
BSA(25mg/ml)
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-
-
-
BSA(12.5mg/ml)
-
-
-
NaOH(0.1N)
-
-
-
100℃ 10min
+
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+
+
注：*对照组及各处理因素均为37℃
2.4 血凝素受体的确定 为确定血凝素受体的成分，观察了人O型、人B型及 绵羊红细胞悬液经各种因素处理对血凝的影响，结果见表4，过碘酸钠能抑制血凝；胰蛋白 酶无此作用。
进一步观察了各种糖对血凝的影响，结果1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-果糖、L-山梨糖 、棉子糖、麦芽糖、纤维二糖、D-木糖、鼠李糖及D-甘露糖均不能抑制3株双歧杆菌对人O型 及人B型红细胞的凝集。
表4 红细胞悬液经各种因素处理对血凝的影响
处理因素
人O型
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人B型
绵羊
对照
+
+
+
胰蛋白酶(25mg/ml)
+
+
+
胰蛋白酶(12.5mg/ml)
+
+
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+
过碘酸钠(30mg/ml)
-
-
-
过碘酸钠(15mg/ml)
-
-
-
3 讨 论
通常根据细菌血凝能否被D-甘露糖抑制，将血凝分为甘露糖敏感(MSHA)和甘露糖抵抗血凝(M RHA)。由于许多细菌能凝集不同种的红细胞，细菌的血凝特性被认为是其一项重要的生物学 特征，已用于一些细菌的鉴定分型。例如根据对人及各种动物红细胞凝集的差异幽门螺杆菌 表现出多种血凝类型，并发现了多种幽门螺杆菌的血凝毒素及其受体[8，9]，这 对研究其粘附定植、致病机制起到了重要的作用。本研究表明，双歧杆菌能凝集人和多种动物的红细胞，表现为单一的血凝类型，为MRHA；已有报道细菌血凝活性的表达与细菌的生长 条件有密切关系。本研究观察了在硫乙醇酸盐液体培养和双歧杆菌选择性固体培养条件下双 歧杆菌的血凝活性，发现两者无明显差异。
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有关血凝素及其受体的性质与结构，在肠道病原菌方面研究较为深入。如众所周知的Ⅰ型菌 毛表达甘露糖敏感血凝(MSHA)，能够识别红细胞膜上的α-D-甘露吡喃糖基受体；而Ⅳ型菌 毛引起MRHA，识别人类P血型系统红细胞膜上糖苷脂的半乳糖-1-4/α-半乳糖受体[4 ]。幽门螺杆菌既能表达细菌表面血凝素，又能表达可溶性血凝素[8，9]。本 研究发现，液体培养的双歧杆菌的血凝素存在于耗尽培养液上清中，说明双歧杆菌也存在着 表面和可溶性血凝素。LTA是Gram阳性菌的特征性膜相关多聚体，它是由线性的磷酸甘油多 聚体经1，3磷酸二脂键交联组成的两性分子，其疏水端与细胞膜上的脂类相联；亲水端则穿 过细胞壁肽聚糖层，到达菌体表面。LTA不仅能致敏红细胞，而且是一些Gram阳性菌的粘附 素，大量研究发现，LTA存在着能与BSA结合的位点，LTA与BSA结合或经碱水解脱脂后，其致 敏红细胞及粘附力丧失，进一步证实了LTA中的脂质部分为其活性部分[7，10，1 1]。本研究结果表明，双歧杆菌的LTA粗提物能凝集人O及人B型红细胞，其血凝活性能 被BSA和NaOH抑制，提示LTA是双歧杆菌的血凝素。本结果还证实双歧杆菌血凝素的受体为糖类，因为过碘酸钠能裂解糖的羟基基团间的C-C键，破坏糖的结构。
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由于血凝试验简便易行，结果直观容易判断，已用作研究细菌与细胞相互粘附的一个模型。 但本研究发现，双歧杆菌的血凝与粘附是由不同物质所介导的，其血凝素为LTA，而粘附素 则为一种蛋白质[12]。
作者简介：郑跃杰(1963～)，男，副教授，副主任医师，博士，从事双歧杆菌粘附机制的研究。
作者单位：郑跃杰 第四军医大学西京医院小儿科，西安 710032
潘令嘉 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
王立生 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
周殿元 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
参考文献
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[1]Armstrong JA,Cooper M,Goodwin CS,et al.Influence of soluble haem agglutins on adherence of Helicobacter pylori to Hep-2 cells.J Med Microbiol,1991,34:181～187.
[2]Oyston PCF and Handley PS.Surface components of Bacteroides fragilis involved in adhesion and haemagglutination.J Med Microbiol,1991,34: 51～55.
[3]林万明.医学分子微生物学进展(上册).北京：中国科学技术出版社，1991,1～16.
[4]童善庆.致尿路感染性大肠杆菌的主要毒力因子.国外医学(微生物学分册),1987，10(3)：112～114.
, 百拇医药
[5]Op den Camp HJM,Veerkamp JH,Oosterhof A,et al.Structure of the lipoteichoic acids from Bifidobacteriom bifidum spp.pennsylvanicum.Biochim Biophys Acta,1984,795:301～313.
[6]Ofek I,Beachey EH,Jeffersin W,et al.Cell membrane-binding properties of group A streptococcal lipoteichoic acid.J Exp Med,1975,144:990～1003.
[7]Teti G,Tomasello F,Chiofalo MS,et al.Adherence of group B Strept ococci to adult and neonatal epithelial cells mediated by lipoteichoic acid.Inf ect Immun,1987,55(12):3057～3064.
, 百拇医药
[8]Robinson J,Goodwin CS,Cooper M,et al.Soluble and cell-associated haemagglutinins of Helicobater (Campylobater) pylori.J Med Microbiol,1990,33:277～284.
[9]Goodwin CS,and Worsley BW.Helicobater pylor: Biology and clinical practice.CRC Press,1993.210～219.
[10]Chugh TD,Burns GJ,Shuhaiber HJ,et al.Adherence of staphylococcus epidermidis to fibrin-platelet clots In vitro mediated by lipoteichoic acid.Infect Immun,1990,58(2):315～319.
[11]Simpson WA,Ofek I,and Beachey EH.Binding of streptococcal lipote ichoic acid to the fatty acid binding sites on serum albumin.J Biological Chemistry,1980,255(13):6092～6097.
[12]郑跃杰，潘令嘉，叶桂安，等.双歧杆菌对肠上皮细胞粘附的研究.中华微生物和免疫学杂志，1997，17(2)：85～87., 百拇医药
摘 要：观察3株双歧杆菌对人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠红细胞的凝集滴度，并对其血凝素进行了提取。结果表明，3株双歧杆菌均能凝集各种来源的红细胞，血凝滴度无明显差异；D-甘露糖不能抑制血凝。提取的脂磷壁酸(LTA)具有血凝活性。其血凝素受体为糖类。
关键词：血凝素 双歧杆菌
血凝试验已被广泛应用于研究细菌与宿主细胞之间的粘附[1，2] 。广义而言，血凝素也是一种粘附素，已证实一些细菌的血凝素和粘附素为同一物质，如肠 毒性大肠杆菌的菌毛既能粘附于人或动物的肠上皮细胞，又能凝集不同种的红细胞，呈现甘 露糖抵抗血凝(MRHA)。血凝试验已作为一些细菌的粘附能力的标志，并用作菌毛检测分型及 鉴别毒力的依据[3，4]。双歧杆菌是人体肠道最重要的生理性细菌，它的粘附与 定植对维持肠道正常菌群的稳定，抵御外来细菌的入侵起主导作用。但迄今为止，尚未见到 双歧杆菌血凝特性的研究报道，本研究系统地观察了双歧杆菌的血凝特性。
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1 材料与方法
1.1 血凝试验
1.1.1 菌株及生长条件 双歧杆菌1027及1124株为本所从健康婴儿粪便 分离，经多次生化鉴定为青春型双歧杆菌。日本青春型双歧杆菌标准株由深圳南山区医院曾 忠铭博士提供。将细菌分别接种于双歧杆菌选择性琼脂平板及硫乙醇酸盐液体培养基，37℃ ，厌氧培养48h后，固体生长的细菌用pH7.4PBS，液体生长的细菌分别用耗尽培养液上清、 新鲜培养液及PBS悬浮细菌，调整菌悬液浓度为1×108/ml。
1.1.2 血凝试验 采取人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠新鲜血(柠檬 酸盐抗凝)，红细胞经0.9%盐水洗涤3次后，悬浮于盐水内，制成2%(V/V)红细胞悬液。将等 量(150μl)对倍稀释的细菌悬液和红细胞悬液加入“U”形底的40孔酶联反应板内，振荡后 ，置37℃温育1h观察结果，并经显微镜下观察证实。能引起血凝反应的菌悬液最高稀释度为 血凝滴度。
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1.2 各种处理因素的影响
1.2.1 对耗尽培养液上清的处理 耗尽培养液上清分别经胰蛋白酶(37℃ 30min)，牛血清白蛋白(BSA)(37℃ 30min)，氢氧化钠(37℃ 30min)和高温(100℃ 10min )处理后，进行血凝试验。
1.2.2 对红细胞悬液的处理 红细胞悬液分别经不同浓度过磺酸钠(37℃ 30min)或胰蛋白酶(37℃ 30min)处理后，进行血凝试验。
1.2.3 各种糖抑制试验 于双歧杆菌耗尽培养液上清中分别加入葡萄糖,乳糖，蔗糖，D-果糖，L-山梨糖，棉子糖，麦芽糖，纤维二糖，D-木糖，鼠李糖及D-甘露糖 (终浓度1%)，进行试验，用pH7.4PBS作对照。
1.3 双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)的提取 将液体培养的双歧杆菌细菌悬液离心3000 rpm，10分钟，上清即为细菌耗尽培养液上清。参照文献[5～7]，于耗尽培养液 上清中加入等体积重蒸酚,在 65℃ 下振摇30min，冷却后，离心4000rpm 20min，收集 水相。重复酚提一次，终产物经蛋白酶K消化以去除残留蛋白。
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2 结 果
2.1 双歧杆菌的血凝活性 3株青春型双歧杆菌对6种红细胞的血凝滴度见 表1，3株细菌均能凝集6种红细胞，菌株间及各种红细胞间无显著差异。
表1 双歧杆菌血凝滴度
菌株
人O
人B
绵羊
兔
鸡
小鼠
标准株
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1027株
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1124朱
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2.2 生长条件对双歧杆菌血凝的影响 双歧杆菌分别于硫乙醇酸盐液体及 双歧杆菌选择性固体培养基生长后，分别与人O型及人B型红细胞进行血凝试验，结果见表2 ，固体培养的双歧杆菌的血凝滴度略低于液体生长者。液体生长的双歧杆菌用原耗尽培养液 上清悬浮后具有血凝活性，而用新鲜培养液或BPS悬浮则无血凝活性；单独耗尽培养液上清 也具有血凝活性。说明，耗尽培养液上清中含双歧杆菌血凝素。表2 液体及固体培养双歧杆菌血凝滴度的比较
菌株
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液体培养双歧杆菌
耗尽
上清
固体培养
PBS悬浮
悬 浮
新鲜培养液 悬浮
PBS悬浮
标准株
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处理因素
耗 尽培养液上清
标准株
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胰蛋白酶(25mg/ml)
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注：*对照组及各处理因素均为37℃
2.4 血凝素受体的确定 为确定血凝素受体的成分，观察了人O型、人B型及 绵羊红细胞悬液经各种因素处理对血凝的影响，结果见表4，过碘酸钠能抑制血凝；胰蛋白 酶无此作用。
进一步观察了各种糖对血凝的影响，结果1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-果糖、L-山梨糖 、棉子糖、麦芽糖、纤维二糖、D-木糖、鼠李糖及D-甘露糖均不能抑制3株双歧杆菌对人O型 及人B型红细胞的凝集。
表4 红细胞悬液经各种因素处理对血凝的影响
处理因素
人O型
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人B型
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胰蛋白酶(25mg/ml)
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过碘酸钠(30mg/ml)
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3 讨 论
通常根据细菌血凝能否被D-甘露糖抑制，将血凝分为甘露糖敏感(MSHA)和甘露糖抵抗血凝(M RHA)。由于许多细菌能凝集不同种的红细胞，细菌的血凝特性被认为是其一项重要的生物学 特征，已用于一些细菌的鉴定分型。例如根据对人及各种动物红细胞凝集的差异幽门螺杆菌 表现出多种血凝类型，并发现了多种幽门螺杆菌的血凝毒素及其受体[8，9]，这 对研究其粘附定植、致病机制起到了重要的作用。本研究表明，双歧杆菌能凝集人和多种动物的红细胞，表现为单一的血凝类型，为MRHA；已有报道细菌血凝活性的表达与细菌的生长 条件有密切关系。本研究观察了在硫乙醇酸盐液体培养和双歧杆菌选择性固体培养条件下双 歧杆菌的血凝活性，发现两者无明显差异。
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有关血凝素及其受体的性质与结构，在肠道病原菌方面研究较为深入。如众所周知的Ⅰ型菌 毛表达甘露糖敏感血凝(MSHA)，能够识别红细胞膜上的α-D-甘露吡喃糖基受体；而Ⅳ型菌 毛引起MRHA，识别人类P血型系统红细胞膜上糖苷脂的半乳糖-1-4/α-半乳糖受体[4 ]。幽门螺杆菌既能表达细菌表面血凝素，又能表达可溶性血凝素[8，9]。本 研究发现，液体培养的双歧杆菌的血凝素存在于耗尽培养液上清中，说明双歧杆菌也存在着 表面和可溶性血凝素。LTA是Gram阳性菌的特征性膜相关多聚体，它是由线性的磷酸甘油多 聚体经1，3磷酸二脂键交联组成的两性分子，其疏水端与细胞膜上的脂类相联；亲水端则穿 过细胞壁肽聚糖层，到达菌体表面。LTA不仅能致敏红细胞，而且是一些Gram阳性菌的粘附 素，大量研究发现，LTA存在着能与BSA结合的位点，LTA与BSA结合或经碱水解脱脂后，其致 敏红细胞及粘附力丧失，进一步证实了LTA中的脂质部分为其活性部分[7，10，1 1]。本研究结果表明，双歧杆菌的LTA粗提物能凝集人O及人B型红细胞，其血凝活性能 被BSA和NaOH抑制，提示LTA是双歧杆菌的血凝素。本结果还证实双歧杆菌血凝素的受体为糖类，因为过碘酸钠能裂解糖的羟基基团间的C-C键，破坏糖的结构。
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由于血凝试验简便易行，结果直观容易判断，已用作研究细菌与细胞相互粘附的一个模型。 但本研究发现，双歧杆菌的血凝与粘附是由不同物质所介导的，其血凝素为LTA，而粘附素 则为一种蛋白质[12]。
作者简介：郑跃杰(1963～)，男，副教授，副主任医师，博士，从事双歧杆菌粘附机制的研究。
作者单位：郑跃杰 第四军医大学西京医院小儿科，西安 710032
潘令嘉 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
王立生 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
周殿元 第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所
参考文献
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[1]Armstrong JA,Cooper M,Goodwin CS,et al.Influence of soluble haem agglutins on adherence of Helicobacter pylori to Hep-2 cells.J Med Microbiol,1991,34:181～187.
[2]Oyston PCF and Handley PS.Surface components of Bacteroides fragilis involved in adhesion and haemagglutination.J Med Microbiol,1991,34: 51～55.
[3]林万明.医学分子微生物学进展(上册).北京：中国科学技术出版社，1991,1～16.
[4]童善庆.致尿路感染性大肠杆菌的主要毒力因子.国外医学(微生物学分册),1987，10(3)：112～114.
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[5]Op den Camp HJM,Veerkamp JH,Oosterhof A,et al.Structure of the lipoteichoic acids from Bifidobacteriom bifidum spp.pennsylvanicum.Biochim Biophys Acta,1984,795:301～313.
[6]Ofek I,Beachey EH,Jeffersin W,et al.Cell membrane-binding properties of group A streptococcal lipoteichoic acid.J Exp Med,1975,144:990～1003.
[7]Teti G,Tomasello F,Chiofalo MS,et al.Adherence of group B Strept ococci to adult and neonatal epithelial cells mediated by lipoteichoic acid.Inf ect Immun,1987,55(12):3057～3064.
, 百拇医药
[8]Robinson J,Goodwin CS,Cooper M,et al.Soluble and cell-associated haemagglutinins of Helicobater (Campylobater) pylori.J Med Microbiol,1990,33:277～284.
[9]Goodwin CS,and Worsley BW.Helicobater pylor: Biology and clinical practice.CRC Press,1993.210～219.
[10]Chugh TD,Burns GJ,Shuhaiber HJ,et al.Adherence of staphylococcus epidermidis to fibrin-platelet clots In vitro mediated by lipoteichoic acid.Infect Immun,1990,58(2):315～319.
[11]Simpson WA,Ofek I,and Beachey EH.Binding of streptococcal lipote ichoic acid to the fatty acid binding sites on serum albumin.J Biological Chemistry,1980,255(13):6092～6097.
[12]郑跃杰，潘令嘉，叶桂安，等.双歧杆菌对肠上皮细胞粘附的研究.中华微生物和免疫学杂志，1997，17(2)：85～87., 百拇医药