人-鼠抗CD4嵌合抗体的生物学效应研究
朱慧芬 杨道锋 王晓林 朱志刚 张悦 沈关心
摘 要 目的 探讨人-鼠抗CD4嵌合抗体的生物学效应。方法 观察CD4人-鼠嵌合抗体和鼠源性单抗对CD3、植物血凝素(PHA)、白细胞介素-2(IL-2)及同种异体细胞诱导增殖的影响，以及其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用。结果 提示CD4嵌合抗体和鼠源性CD4抗体对以上几种诱导剂诱导的增殖均有抑制作用，且抗体剂量越大，抑制作用越强。结论 CD4嵌合抗体和鼠源性抗体具有有效的免疫抑制作用。
关键词：CD4嵌合抗体 增殖抑制
CD4分子是辅助性T细胞和超敏反应性T细胞表面所表达的特有标志，亦是T细胞分化的一种标志，在T细胞识别抗原、激活、分化及功能表达中起重要作用。亦在器官移植排斥反应及自身免疫性疾病的发生中起关键作用。抗CD4抗体可通过干扰T细胞对抗原的识别，及通过补体介导的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)抑制CD4+细胞的生物学效应[1-3]，为其临床应用提供了理论依据和实验数据。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、抗CD4人-鼠嵌合抗体的构建
从CD4杂交瘤细胞株中提取RNA，通过逆转录合成cDNA，获得目的基因，采用基因工程技术构建抗CD4人-鼠嵌合抗体表达载体，然后转染到骨髓瘤细胞中获得分泌嵌合抗体的转染瘤细胞株，注射Ba1b/c至小鼠腹腔制备腹水，经饱和硫酸铵沉淀法纯化。抗CD3、CD4鼠源性单抗亦用硫酸铵沉淀法纯化。
二、细胞
抽取健康供者外周血，肝素抗凝，淋巴细胞分层液分离得到单个核细胞(PBMC)，用Hanks液洗2次，用质量浓度为10%的FCS-RPMI1640调成2×106/ml;Hut-78细胞，为人T细胞白血病细胞株，表达CD4分子；HL-60细胞，是人单核细胞白血病细胞株，不表达CD4分子，均培养于质量浓度为10%的FCS-RPMI1640中。
, 百拇医药
三、抗CD4人-鼠嵌合抗体和鼠源性抗体对PBMC增殖抑制试验
1.对PHA诱导PBMC的增殖抑制试验：取2×106/mlPBMC细胞悬液，加入PHA(终浓度为1mg/L)，于96孔板中每孔加100μl，然后加入浓度为40mg/L和80mg/L鼠CD4单抗，两株CD4嵌合抗体D4.9、10C11于上述细胞悬液中，并设不加抗体的对照组，每种做3孔。置37℃，体积浓度为5%CO2培养3d。去上清，用Hanks液洗1次，去上清加MTT(5g/L)10μl，继续培养4h后，每孔加入100μlDMSO测570nm测OD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
2.对IL-2诱导PBMC的增殖抑制试验：取2×106/mlPBMC细胞悬液，加入IL-2(终浓度为50万U/L)，于96孔培养板中每孔加100μl，同1，加入各种抗体，培养3d后，加MTT测570nmOD值。并根据公式计算增殖抑制率。
, http://www.100md.com
3.对CD3诱导PBMC的增殖抑制试验：将CD3腹水用生理盐水稀释100倍，加入96孔板中，每孔100μl，置37℃孵育2h，弃去上清，每孔加入PBMC(2×106/ml)100μl，同1，加入各种抗体，培养3d后，加MTT测570nmOD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
4.对同种细胞诱导PBMC增殖的抑制试验：随机将两个供血者的PBMC分别调成2×106/ml，等量混合后，加入96孔板中，每孔100μl，然后同1，加入各种抗体，经37℃，体积浓度为5%CO2培养箱培养3d。弃去上清，用Hanks液洗1次，加MTT继续培养4h，测570nmOD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
四、抗CD4人-鼠嵌合抗体介导PBMC对Hut-78的细胞毒试验
采用乳酸脱氢酶法。以PBMC为效应细胞，Hut-78，HL-60为靶细胞。效应细胞浓度2×106/ml，靶细胞浓度为2×105/ml，各取100μl加入96孔培养板中，效/靶比为10∶1，分别加入80mg/LCD4嵌合抗体或鼠源性抗体。以1640为自然释放孔，NP40为最大释放孔。37℃，体积浓度为5%CO2培养箱培养6h后，每孔取100μl上清到另一96孔板中，加乳酸脱氢酶的底物100μl，室温放15min，加0.1mol/L柠檬酸30μl，终止反应，酶标仪测490nmOD值。
, 百拇医药
结 果
一、CD4嵌合抗体和鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3及同种异体细胞诱导PBMC增殖的抑制作用
两株CD4嵌合抗体D4.9、10C11和一株鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3、同种异体细胞诱导的增殖均有抑制作用，在抗体浓度为40mg/L时，已有抑制作用，当抗体浓度为80mg/L时，抑制作用明显增强，其中嵌合抗体D4.9对这几种刺激物诱导的增殖抑制作用均强于其他两种抗体。当抗体浓度低于20mg/L时，抑制作用不明显，结果见表1。
表1 CD4嵌合抗体及鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3及同种细胞诱导PBMC增殖的影响
抗体 类别
抗体浓度
(mg/L)
, http://www.100md.com
IL-2诱导
PHA诱导
CD3诱导
同种细胞诱导
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
D4.9
, http://www.100md.com
80
10
77.2±11.9
9
64.6±11.5
8
73.4±17.3
9
59.6±6.5
D4.9
40
10
56.8±11.3
, http://www.100md.com
9
44.8±16.7
8
52.2±18.2
9
45.4±11.0
10C11
80
4
45.9±23.0
4
33.6±13.0
3
, 百拇医药
33.7±7.2
-
-
10C11
40
4
22.8±9.9
4
17.0±9.5
3
23.4±7.4
-
-
, http://www.100md.com
CD4
80
8
38.8±12.8
8
35.5±13.9
8
35.3±12.4
9
33.9±12.7
CD4
40
8
, http://www.100md.com
19.1±8.5
8
13.8±7.4
8
19.4±14.4
9
15.6±7.8
二、CD4嵌合抗体和鼠源性抗体介导PBMC对肿瘤细胞的细胞毒作用
对于CD4阳性的Hut-78细胞，加有CD4嵌合抗体的鼠源性抗体组的细胞毒作用明显高于无抗体的对照组；而对于CD4阴性的HL-60细胞，PBMC对此细胞的细胞毒作用，加CD4抗体组和对照组比较差异无显著性，结果见表2。表2 CD4抗体介导的PBMC对培养
, 百拇医药
的肿瘤细胞的杀伤率(%)
组别
Hut-78细胞
HL-60细胞
杀伤率(%)
P值
杀伤率(%)
P值
对照组
15.9±5.9
16.2±5.2
D4.9组
, 百拇医药 35.5±10.9
<0.05
16.9±6.7
>0.05
CD4组
28.1±8.2
<0.05
15.9±6.8
>0.05
讨 论
器官移植后排斥反应和移植物抗宿主反应仍是移植研究中尚未得到解决的根本问题。诱导机体免疫耐受控制移植排斥反应，促进移植成功是移植领域研究的热点。移植前给受者输注供者的肝细胞、胚胎细胞、骨髓细胞、激活的淋巴细胞及应用抗体和免疫抑制药物治疗以诱导免疫耐受在动物体内已进行了大量研究，并获得成效[4-9]，但其诱导机理及人体内的诱导免疫耐受尚有诸多问题未有解决。在动物模型中，应用抗CD4抗体诱导移植耐受，预防排斥反应已获成功。但是在人类还没有将抗CD4用于移植排斥反应的预防。在移植后将CD4抗体应用于治疗上有成功的报道。CD4分子最主要的功能是与TCR/CD3识别的MHC-Ⅱ类分子相互作用，引起T细胞激活。应用抗CD4抗体主要可通过干扰抗原识别及其对T细胞的激活而抑制CD4+T细胞的功能，或者通过诱导ADCC、CDC、调理作用及清除循环中相应的细胞达到抗排斥反应的作用。但目前抗体抗排斥需多次应用，并多为鼠源性，可诱导人体抗鼠抗体(HAMA)的产生，影响其应用效果[10-11]。且其抗排斥反应的分子机理尚不完全清楚，更困难的是在人体内无法进行诱导免疫耐受作为预防排斥的机理研究。因此，体外研究抗CD4抗体的生物学效应，对其应用于诱导免疫耐受的研究具有重要意义。
, 百拇医药
本文研究了CD4人-鼠嵌合抗体介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用及对IL-2、PHA、CD3及同种抗原诱导PBMC增殖的影响。结果提示CD4抗体对以上几种诱导剂诱导的增殖均有抑制作用。杀伤试验证明CD4嵌合抗体亦具有ADCC作用。为如何选用CD4抗体和同种细胞联合有效地诱导长时间免疫耐受，达到预防排斥反应的目的提供了理论依据和实验数据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(393870628)
作者单位：朱慧芬(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
王晓林(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
朱志刚(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
张悦(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
, 百拇医药
沈关心(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
杨道锋(同济医科大学附属同济医院传染科)
参考文献
[1]Peinke P, Volk HD, Miller H, et al. Anti-CD4 therapy of acute rejection inlong-term renal allograft recipient. Lancet, 1991, 338:702-703.
[2]Onodera K, Lehmann M, Volk HD. CD4-targeted therapy induces "infectious" tolerance to cardiac allografts in sensitized rat recipients. Transplant Proc, 1997, 29:1907-1908.
, 百拇医药
[3]Reinke P, Kerm F, Fietze E. Anti CD4 monoclonal antibody therapy of late acute rejection in renal allograft recipients-CD4 T cells play an essential role in the rejection process. Transplant Proc, 1995,27:859-862.
[4]朱志刚， 沈关心， 王晓林， 等. 抗CD4单抗可变区基因序列分析. 免疫学杂志， 1999， 15：142.
[5]Qin S, Cobbold SP, Tighe H, et al. CD4 monoclonal antibody pairs for immunosuppression and tolerence indution. Eur J Immunol, 1987, 17:1159-1165.
, http://www.100md.com
[6]Opelz G, Vanrenterghem Y, Kirste G, et al. Prospective evaluation of pretransplant blood transfusion in cadaver kidney recipients. Transplantation, 1997, 63:964-967.
[7]Inoue S, Aikawa M, Dobashi Y, et al. Donor-specific transfusion for kidney transplantation in the Csa Era. Transplant Proc, 1996, 28:1220-1221.
[8]Starzl TE, Demetris AJ, Murase N, et al. The lost chord:microchimerism and allograft survival. Immunology Today, 1996, 17:577-584.
, http://www.100md.com
[9]Wood K, Sachs DH. Chimerism and transplantant tolerance:cause and effect. Immunology Today, 1996, 17:584-587.
[10]Orloff SL, Hirose R, Lin Z, et al. Clonal deletion is one mechanism responsible for tolerance in mixed hematopietic chimeras. Transplant Proc, 1997, 29:1198-1200.
[11]Herbert J, Roser B. Strategies of monoclonal antibody therapy that induce permanent tolerance of organ transplants. Transplantation, 1988,46:128-134.
[12]Winter G, Harris Wj. Hummanized antibodies. Immunology Today, 1993, 14:243-246., 百拇医药
摘 要 目的 探讨人-鼠抗CD4嵌合抗体的生物学效应。方法 观察CD4人-鼠嵌合抗体和鼠源性单抗对CD3、植物血凝素(PHA)、白细胞介素-2(IL-2)及同种异体细胞诱导增殖的影响，以及其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用。结果 提示CD4嵌合抗体和鼠源性CD4抗体对以上几种诱导剂诱导的增殖均有抑制作用，且抗体剂量越大，抑制作用越强。结论 CD4嵌合抗体和鼠源性抗体具有有效的免疫抑制作用。
关键词：CD4嵌合抗体 增殖抑制
CD4分子是辅助性T细胞和超敏反应性T细胞表面所表达的特有标志，亦是T细胞分化的一种标志，在T细胞识别抗原、激活、分化及功能表达中起重要作用。亦在器官移植排斥反应及自身免疫性疾病的发生中起关键作用。抗CD4抗体可通过干扰T细胞对抗原的识别，及通过补体介导的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)抑制CD4+细胞的生物学效应[1-3]，为其临床应用提供了理论依据和实验数据。
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材料和方法
一、抗CD4人-鼠嵌合抗体的构建
从CD4杂交瘤细胞株中提取RNA，通过逆转录合成cDNA，获得目的基因，采用基因工程技术构建抗CD4人-鼠嵌合抗体表达载体，然后转染到骨髓瘤细胞中获得分泌嵌合抗体的转染瘤细胞株，注射Ba1b/c至小鼠腹腔制备腹水，经饱和硫酸铵沉淀法纯化。抗CD3、CD4鼠源性单抗亦用硫酸铵沉淀法纯化。
二、细胞
抽取健康供者外周血，肝素抗凝，淋巴细胞分层液分离得到单个核细胞(PBMC)，用Hanks液洗2次，用质量浓度为10%的FCS-RPMI1640调成2×106/ml;Hut-78细胞，为人T细胞白血病细胞株，表达CD4分子；HL-60细胞，是人单核细胞白血病细胞株，不表达CD4分子，均培养于质量浓度为10%的FCS-RPMI1640中。
, 百拇医药
三、抗CD4人-鼠嵌合抗体和鼠源性抗体对PBMC增殖抑制试验
1.对PHA诱导PBMC的增殖抑制试验：取2×106/mlPBMC细胞悬液，加入PHA(终浓度为1mg/L)，于96孔板中每孔加100μl，然后加入浓度为40mg/L和80mg/L鼠CD4单抗，两株CD4嵌合抗体D4.9、10C11于上述细胞悬液中，并设不加抗体的对照组，每种做3孔。置37℃，体积浓度为5%CO2培养3d。去上清，用Hanks液洗1次，去上清加MTT(5g/L)10μl，继续培养4h后，每孔加入100μlDMSO测570nm测OD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
2.对IL-2诱导PBMC的增殖抑制试验：取2×106/mlPBMC细胞悬液，加入IL-2(终浓度为50万U/L)，于96孔培养板中每孔加100μl，同1，加入各种抗体，培养3d后，加MTT测570nmOD值。并根据公式计算增殖抑制率。
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3.对CD3诱导PBMC的增殖抑制试验：将CD3腹水用生理盐水稀释100倍，加入96孔板中，每孔100μl，置37℃孵育2h，弃去上清，每孔加入PBMC(2×106/ml)100μl，同1，加入各种抗体，培养3d后，加MTT测570nmOD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
4.对同种细胞诱导PBMC增殖的抑制试验：随机将两个供血者的PBMC分别调成2×106/ml，等量混合后，加入96孔板中，每孔100μl，然后同1，加入各种抗体，经37℃，体积浓度为5%CO2培养箱培养3d。弃去上清，用Hanks液洗1次，加MTT继续培养4h，测570nmOD值。然后根据公式计算增殖抑制率。
四、抗CD4人-鼠嵌合抗体介导PBMC对Hut-78的细胞毒试验
采用乳酸脱氢酶法。以PBMC为效应细胞，Hut-78，HL-60为靶细胞。效应细胞浓度2×106/ml，靶细胞浓度为2×105/ml，各取100μl加入96孔培养板中，效/靶比为10∶1，分别加入80mg/LCD4嵌合抗体或鼠源性抗体。以1640为自然释放孔，NP40为最大释放孔。37℃，体积浓度为5%CO2培养箱培养6h后，每孔取100μl上清到另一96孔板中，加乳酸脱氢酶的底物100μl，室温放15min，加0.1mol/L柠檬酸30μl，终止反应，酶标仪测490nmOD值。
, 百拇医药
结 果
一、CD4嵌合抗体和鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3及同种异体细胞诱导PBMC增殖的抑制作用
两株CD4嵌合抗体D4.9、10C11和一株鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3、同种异体细胞诱导的增殖均有抑制作用，在抗体浓度为40mg/L时，已有抑制作用，当抗体浓度为80mg/L时，抑制作用明显增强，其中嵌合抗体D4.9对这几种刺激物诱导的增殖抑制作用均强于其他两种抗体。当抗体浓度低于20mg/L时，抑制作用不明显，结果见表1。
表1 CD4嵌合抗体及鼠源性抗体对IL-2、PHA、CD3及同种细胞诱导PBMC增殖的影响
抗体 类别
抗体浓度
(mg/L)
, http://www.100md.com
IL-2诱导
PHA诱导
CD3诱导
同种细胞诱导
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
例数
抑制率(%)
D4.9
, http://www.100md.com
80
10
77.2±11.9
9
64.6±11.5
8
73.4±17.3
9
59.6±6.5
D4.9
40
10
56.8±11.3
, http://www.100md.com
9
44.8±16.7
8
52.2±18.2
9
45.4±11.0
10C11
80
4
45.9±23.0
4
33.6±13.0
3
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33.7±7.2
-
-
10C11
40
4
22.8±9.9
4
17.0±9.5
3
23.4±7.4
-
-
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CD4
80
8
38.8±12.8
8
35.5±13.9
8
35.3±12.4
9
33.9±12.7
CD4
40
8
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19.1±8.5
8
13.8±7.4
8
19.4±14.4
9
15.6±7.8
二、CD4嵌合抗体和鼠源性抗体介导PBMC对肿瘤细胞的细胞毒作用
对于CD4阳性的Hut-78细胞，加有CD4嵌合抗体的鼠源性抗体组的细胞毒作用明显高于无抗体的对照组；而对于CD4阴性的HL-60细胞，PBMC对此细胞的细胞毒作用，加CD4抗体组和对照组比较差异无显著性，结果见表2。表2 CD4抗体介导的PBMC对培养
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的肿瘤细胞的杀伤率(%)
组别
Hut-78细胞
HL-60细胞
杀伤率(%)
P值
杀伤率(%)
P值
对照组
15.9±5.9
16.2±5.2
D4.9组
, 百拇医药 35.5±10.9
<0.05
16.9±6.7
>0.05
CD4组
28.1±8.2
<0.05
15.9±6.8
>0.05
讨 论
器官移植后排斥反应和移植物抗宿主反应仍是移植研究中尚未得到解决的根本问题。诱导机体免疫耐受控制移植排斥反应，促进移植成功是移植领域研究的热点。移植前给受者输注供者的肝细胞、胚胎细胞、骨髓细胞、激活的淋巴细胞及应用抗体和免疫抑制药物治疗以诱导免疫耐受在动物体内已进行了大量研究，并获得成效[4-9]，但其诱导机理及人体内的诱导免疫耐受尚有诸多问题未有解决。在动物模型中，应用抗CD4抗体诱导移植耐受，预防排斥反应已获成功。但是在人类还没有将抗CD4用于移植排斥反应的预防。在移植后将CD4抗体应用于治疗上有成功的报道。CD4分子最主要的功能是与TCR/CD3识别的MHC-Ⅱ类分子相互作用，引起T细胞激活。应用抗CD4抗体主要可通过干扰抗原识别及其对T细胞的激活而抑制CD4+T细胞的功能，或者通过诱导ADCC、CDC、调理作用及清除循环中相应的细胞达到抗排斥反应的作用。但目前抗体抗排斥需多次应用，并多为鼠源性，可诱导人体抗鼠抗体(HAMA)的产生，影响其应用效果[10-11]。且其抗排斥反应的分子机理尚不完全清楚，更困难的是在人体内无法进行诱导免疫耐受作为预防排斥的机理研究。因此，体外研究抗CD4抗体的生物学效应，对其应用于诱导免疫耐受的研究具有重要意义。
, 百拇医药
本文研究了CD4人-鼠嵌合抗体介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用及对IL-2、PHA、CD3及同种抗原诱导PBMC增殖的影响。结果提示CD4抗体对以上几种诱导剂诱导的增殖均有抑制作用。杀伤试验证明CD4嵌合抗体亦具有ADCC作用。为如何选用CD4抗体和同种细胞联合有效地诱导长时间免疫耐受，达到预防排斥反应的目的提供了理论依据和实验数据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(393870628)
作者单位：朱慧芬(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
王晓林(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
朱志刚(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
张悦(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
, 百拇医药
沈关心(430030 武汉，同济医科大学免疫学教研室)
杨道锋(同济医科大学附属同济医院传染科)
参考文献
[1]Peinke P, Volk HD, Miller H, et al. Anti-CD4 therapy of acute rejection inlong-term renal allograft recipient. Lancet, 1991, 338:702-703.
[2]Onodera K, Lehmann M, Volk HD. CD4-targeted therapy induces "infectious" tolerance to cardiac allografts in sensitized rat recipients. Transplant Proc, 1997, 29:1907-1908.
, 百拇医药
[3]Reinke P, Kerm F, Fietze E. Anti CD4 monoclonal antibody therapy of late acute rejection in renal allograft recipients-CD4 T cells play an essential role in the rejection process. Transplant Proc, 1995,27:859-862.
[4]朱志刚， 沈关心， 王晓林， 等. 抗CD4单抗可变区基因序列分析. 免疫学杂志， 1999， 15：142.
[5]Qin S, Cobbold SP, Tighe H, et al. CD4 monoclonal antibody pairs for immunosuppression and tolerence indution. Eur J Immunol, 1987, 17:1159-1165.
, http://www.100md.com
[6]Opelz G, Vanrenterghem Y, Kirste G, et al. Prospective evaluation of pretransplant blood transfusion in cadaver kidney recipients. Transplantation, 1997, 63:964-967.
[7]Inoue S, Aikawa M, Dobashi Y, et al. Donor-specific transfusion for kidney transplantation in the Csa Era. Transplant Proc, 1996, 28:1220-1221.
[8]Starzl TE, Demetris AJ, Murase N, et al. The lost chord:microchimerism and allograft survival. Immunology Today, 1996, 17:577-584.
, http://www.100md.com
[9]Wood K, Sachs DH. Chimerism and transplantant tolerance:cause and effect. Immunology Today, 1996, 17:584-587.
[10]Orloff SL, Hirose R, Lin Z, et al. Clonal deletion is one mechanism responsible for tolerance in mixed hematopietic chimeras. Transplant Proc, 1997, 29:1198-1200.
[11]Herbert J, Roser B. Strategies of monoclonal antibody therapy that induce permanent tolerance of organ transplants. Transplantation, 1988,46:128-134.
[12]Winter G, Harris Wj. Hummanized antibodies. Immunology Today, 1993, 14:243-246., 百拇医药