一氧化氮对人培养血管内膜增生的抑制作用
李超 李桂媛 张强 段志泉
摘 要 目的 研究一氧化氮(NO)对体外培养人正常大隐静脉片内膜增生的影响。方法 取来自同一条正常大隐静脉的3段长5 mm血管，随机分入3组，共用6条大隐静脉。体外培养2组大隐静脉片，其中1组加入NO供体亚硝基乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillaminne, SNAP)。免疫组织化学染色后观察内膜增生及细胞增殖。结果 培养静脉片可见明显内膜增生和平滑肌细胞增殖。与对照组相比，加入SNAP组培养血管片内膜增生及平滑肌细胞增殖明显减低。对照组内膜厚度为(29.00±1.40) μm，SNAP组为(14.00±1.34) μm，差异有非常显著性(P<0.01)。对照组平滑肌细胞增殖指数为(30.00±2.13)%，SNAP组为(12.00±1.43)%，差异有非常显著性( P<0.01)。结论 NO可抑制培养血管内膜增生及平滑肌细胞增殖。
关键词：血管片培养 内膜增生 平滑肌细胞增殖 一氧化氮
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本研究旨在通过体外培养人大隐静脉模拟移植静脉病理生理改变，研究一氧化氮(NO)对移植血管内膜增生的影响，现报道如下。
材料与方法
1.实验材料：所用生物试剂均购自福建迈新生物试剂公司。亚硝基乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillamine, SNAP)购自美国Sigma公司。
2.实验方法：(1)大隐静脉片培养：在血管移植手术中取正常大隐静脉置磷酸盐缓冲液(PBS液)中。于室温下，PBS液中用利刀切去钳夹损伤的两端，仔细除去血管外脂肪及结缔组织。将每条大隐静脉以利刀分成长5 mm血管段后，纵行剖开，取其中一半以0.2% Trypan Blue染色30 s，内皮覆盖大于75%者取另一半进行下步实验。将静脉片置于培养板中，以细针使其展开，内膜向上固定于特制培养板上。每孔加入体积分数为30%小牛血清培养液5 ml，使静脉片浸入其中。取来自同一大隐静脉3段长5 mm血管，随机取其中之一以中性福马林固定作为空白对照。另一血管段不加任何因素培养14 d，为培养对照组。最后1段加入含SNAP的培养液中。共用6条静脉每天更换培养液1次。SNAP每天换液前溶于培养液中，浓度为1×10-3 mol/L，4 ℃保存。在培养的最后4 d加入5-溴脱氧尿核苷(5-BrdU)1 g/L以标计增殖细胞。(2)组织学处理：培养第15 d取出以中性福马林固定5 h、脱水、透明、石蜡包埋、切片。常规苏木素-伊红(HE)染色。以抗平滑肌细胞α-肌动蛋白(α-actin)单抗行ABC法免疫组织化学染色。然后根据Verhoeff氏法配制铁苏木精染液进行弹力纤维染色，以区分平滑肌细胞及内弹力膜。以4 mol/L HCl及0.1%胰酶处理后5-BrdU单抗行ABC法染色显示增殖细胞核。(3)观察指标：以内弹力膜为界，应用计算机图像分析仪测量内膜厚度，显微镜计数5-BrdU标记细胞数。计算标记指数，由2人分别计数10次，每次10个视野，取平均值。
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3.统计学处理：t检验。
结 果
1.常规HE染色可见对照组培养大隐静脉片内膜显著增厚，内膜中有梭形细胞，并有大量细胞外基质存在。
2.抗平滑肌细胞α-肌动蛋白ABC法染色及Verhoeff氏法弹力纤维染色联合应用后，内弹力膜呈蓝黑色，内膜、中膜分界明显，内膜和中膜内存在大量α-actin呈阳性反应细胞，胞浆呈现棕黄色，核呈浅蓝色，为平滑肌细胞。形态、位置与HE染色中的梭形细胞相符。以ABC法行抗5-BrdU单克隆抗体染色，内膜及中膜均可见阳性平滑肌细胞。
3.计算机图像分析仪测量结果，显微镜计数增殖平滑肌细胞结果，统计分析如下：空白组内膜厚度为(3.00±0.80) μm，对照组(29.00±1.40) μm，SNAP组为(14.00±1.34) μm。空白组平滑肌细胞增殖指数为0，对照组为(30.00±2.13)%，SNAP组为(12.00±1.43)%。与空白组相比对照组内膜显著增生(P<0.01)。与对照组相比SNAP组内膜增厚显著减轻(P<0.01)。5-BrdU着色细胞数减少，平滑肌细胞增殖指数显著降低(P<0.01)。
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讨 论
Karen等[1]于1996年通过将培养人大隐静脉段与人体移植静脉的内膜增生标本相比较发现二者之间的病理变化存在很大相似之处，故认为体外大隐静脉培养是一种研究血管内膜增生较有价值的实验模型。血管移植术后多种细胞及细胞因子作用下发生表型改变的平滑肌细胞迁移至内膜，增殖并分泌大量细胞外基质，导致移植静脉内膜局部或弥漫性增厚。大隐静脉片培养保持了静脉壁完整性及细胞之间的相互作用，达到与体内相近的效果。
在本实验中，SNAP为一种公认的NO供体，可在培养液中释放NO。每天更换培养液保持了NO供给的连续性。本实验结果显示，加入SNAP后培养血管的内膜增生及平滑肌细胞增殖受到明显抑制。
Chello等[2]经体外实验证明，受激的中性粒细胞对静脉内皮的粘附作用增强，加入NO供体可以抑制这种粘附作用。另外，NO对血小板凝聚的抑制作用已经被许多实验证实。中性粒细胞粘附，血小板的凝聚及其释放的许多血管活性因子在移植血管内膜增生中起重要作用。体外培养静脉的培养液中并无白细胞及血小板，故NO抑制培养静脉的内膜增生可能主要是抑制血管壁内皮及平滑肌细胞的相互作用。已有实验证明，NO能抑制培养平滑肌细胞的增殖，并可抑制成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素生长因子(IGF)等多种生长因子的作用[3]。这些生长因子在移植血管内膜增生中是十分必要的[4]。本实验中NO对培养静脉中的平滑肌细胞增殖也有明显的抑制作用。
, 百拇医药
Dattilo等[5]在动物实验中证明，NO可以明显抑制移植静脉壁中透明质酸酶-1(HAS-1)的表达，HAS-1在细胞外基质的合成中起重要作用。故NO可能尚有抑制移植血管内膜细胞外基质形成的作用，并通过此作用来抑制内膜增生。本实验结果表明，NO可以抑制培养人大隐静脉的内膜增生及平滑肌细胞增殖，其作用可能通过多种机制完成。这些机制有待于进一步研究加以揭示。
作者单位：李超(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
张强(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
段志泉(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
李桂媛(中国医科大学基础医学院病理教研组)
参考文献
, 百拇医药
[1]Karen EP, Kevin V, Louise J, et al. Human saphenous vein organ culture: a useful model of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996, 11:48-58.
[2]Chello M, Mastroroberto P, Perticone F, et al. Nitric oxide modulation of neutrophil-endothelium interaction: difference between arterial and venous coronary bypass grafts. J Am Coll Cardiol, 1998,31:823-826.
[3]Chaux A, Ruan XM, Fishbein MC, et al. Perivascular delivery of a nitric oxide donor inhibits neointimal hyperplasia in vein grafts implanted in the arterial circulation. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 115:604-612.
[4]Cercek B, Shaifi B, Barath P, et al. Growth factors in pathogenesis of coronary arterial restenosis. Am J Cardiol, 1991,68:24-33.
[5]Dattilo JB, Dattilo MP, Crane JT, et al. The nitric oxide precursor L-arginine reduces expression of hyaluronan synthase in experimental vein bypass grafts. J Surg Res, 1998,74:39-42., 百拇医药
摘 要 目的 研究一氧化氮(NO)对体外培养人正常大隐静脉片内膜增生的影响。方法 取来自同一条正常大隐静脉的3段长5 mm血管，随机分入3组，共用6条大隐静脉。体外培养2组大隐静脉片，其中1组加入NO供体亚硝基乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillaminne, SNAP)。免疫组织化学染色后观察内膜增生及细胞增殖。结果 培养静脉片可见明显内膜增生和平滑肌细胞增殖。与对照组相比，加入SNAP组培养血管片内膜增生及平滑肌细胞增殖明显减低。对照组内膜厚度为(29.00±1.40) μm，SNAP组为(14.00±1.34) μm，差异有非常显著性(P<0.01)。对照组平滑肌细胞增殖指数为(30.00±2.13)%，SNAP组为(12.00±1.43)%，差异有非常显著性( P<0.01)。结论 NO可抑制培养血管内膜增生及平滑肌细胞增殖。
关键词：血管片培养 内膜增生 平滑肌细胞增殖 一氧化氮
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本研究旨在通过体外培养人大隐静脉模拟移植静脉病理生理改变，研究一氧化氮(NO)对移植血管内膜增生的影响，现报道如下。
材料与方法
1.实验材料：所用生物试剂均购自福建迈新生物试剂公司。亚硝基乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillamine, SNAP)购自美国Sigma公司。
2.实验方法：(1)大隐静脉片培养：在血管移植手术中取正常大隐静脉置磷酸盐缓冲液(PBS液)中。于室温下，PBS液中用利刀切去钳夹损伤的两端，仔细除去血管外脂肪及结缔组织。将每条大隐静脉以利刀分成长5 mm血管段后，纵行剖开，取其中一半以0.2% Trypan Blue染色30 s，内皮覆盖大于75%者取另一半进行下步实验。将静脉片置于培养板中，以细针使其展开，内膜向上固定于特制培养板上。每孔加入体积分数为30%小牛血清培养液5 ml，使静脉片浸入其中。取来自同一大隐静脉3段长5 mm血管，随机取其中之一以中性福马林固定作为空白对照。另一血管段不加任何因素培养14 d，为培养对照组。最后1段加入含SNAP的培养液中。共用6条静脉每天更换培养液1次。SNAP每天换液前溶于培养液中，浓度为1×10-3 mol/L，4 ℃保存。在培养的最后4 d加入5-溴脱氧尿核苷(5-BrdU)1 g/L以标计增殖细胞。(2)组织学处理：培养第15 d取出以中性福马林固定5 h、脱水、透明、石蜡包埋、切片。常规苏木素-伊红(HE)染色。以抗平滑肌细胞α-肌动蛋白(α-actin)单抗行ABC法免疫组织化学染色。然后根据Verhoeff氏法配制铁苏木精染液进行弹力纤维染色，以区分平滑肌细胞及内弹力膜。以4 mol/L HCl及0.1%胰酶处理后5-BrdU单抗行ABC法染色显示增殖细胞核。(3)观察指标：以内弹力膜为界，应用计算机图像分析仪测量内膜厚度，显微镜计数5-BrdU标记细胞数。计算标记指数，由2人分别计数10次，每次10个视野，取平均值。
, http://www.100md.com
3.统计学处理：t检验。
结 果
1.常规HE染色可见对照组培养大隐静脉片内膜显著增厚，内膜中有梭形细胞，并有大量细胞外基质存在。
2.抗平滑肌细胞α-肌动蛋白ABC法染色及Verhoeff氏法弹力纤维染色联合应用后，内弹力膜呈蓝黑色，内膜、中膜分界明显，内膜和中膜内存在大量α-actin呈阳性反应细胞，胞浆呈现棕黄色，核呈浅蓝色，为平滑肌细胞。形态、位置与HE染色中的梭形细胞相符。以ABC法行抗5-BrdU单克隆抗体染色，内膜及中膜均可见阳性平滑肌细胞。
3.计算机图像分析仪测量结果，显微镜计数增殖平滑肌细胞结果，统计分析如下：空白组内膜厚度为(3.00±0.80) μm，对照组(29.00±1.40) μm，SNAP组为(14.00±1.34) μm。空白组平滑肌细胞增殖指数为0，对照组为(30.00±2.13)%，SNAP组为(12.00±1.43)%。与空白组相比对照组内膜显著增生(P<0.01)。与对照组相比SNAP组内膜增厚显著减轻(P<0.01)。5-BrdU着色细胞数减少，平滑肌细胞增殖指数显著降低(P<0.01)。
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讨 论
Karen等[1]于1996年通过将培养人大隐静脉段与人体移植静脉的内膜增生标本相比较发现二者之间的病理变化存在很大相似之处，故认为体外大隐静脉培养是一种研究血管内膜增生较有价值的实验模型。血管移植术后多种细胞及细胞因子作用下发生表型改变的平滑肌细胞迁移至内膜，增殖并分泌大量细胞外基质，导致移植静脉内膜局部或弥漫性增厚。大隐静脉片培养保持了静脉壁完整性及细胞之间的相互作用，达到与体内相近的效果。
在本实验中，SNAP为一种公认的NO供体，可在培养液中释放NO。每天更换培养液保持了NO供给的连续性。本实验结果显示，加入SNAP后培养血管的内膜增生及平滑肌细胞增殖受到明显抑制。
Chello等[2]经体外实验证明，受激的中性粒细胞对静脉内皮的粘附作用增强，加入NO供体可以抑制这种粘附作用。另外，NO对血小板凝聚的抑制作用已经被许多实验证实。中性粒细胞粘附，血小板的凝聚及其释放的许多血管活性因子在移植血管内膜增生中起重要作用。体外培养静脉的培养液中并无白细胞及血小板，故NO抑制培养静脉的内膜增生可能主要是抑制血管壁内皮及平滑肌细胞的相互作用。已有实验证明，NO能抑制培养平滑肌细胞的增殖，并可抑制成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素生长因子(IGF)等多种生长因子的作用[3]。这些生长因子在移植血管内膜增生中是十分必要的[4]。本实验中NO对培养静脉中的平滑肌细胞增殖也有明显的抑制作用。
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Dattilo等[5]在动物实验中证明，NO可以明显抑制移植静脉壁中透明质酸酶-1(HAS-1)的表达，HAS-1在细胞外基质的合成中起重要作用。故NO可能尚有抑制移植血管内膜细胞外基质形成的作用，并通过此作用来抑制内膜增生。本实验结果表明，NO可以抑制培养人大隐静脉的内膜增生及平滑肌细胞增殖，其作用可能通过多种机制完成。这些机制有待于进一步研究加以揭示。
作者单位：李超(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
张强(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
段志泉(110001沈阳，中国医科大学第一临床学院普外三科)
李桂媛(中国医科大学基础医学院病理教研组)
参考文献
, 百拇医药
[1]Karen EP, Kevin V, Louise J, et al. Human saphenous vein organ culture: a useful model of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996, 11:48-58.
[2]Chello M, Mastroroberto P, Perticone F, et al. Nitric oxide modulation of neutrophil-endothelium interaction: difference between arterial and venous coronary bypass grafts. J Am Coll Cardiol, 1998,31:823-826.
[3]Chaux A, Ruan XM, Fishbein MC, et al. Perivascular delivery of a nitric oxide donor inhibits neointimal hyperplasia in vein grafts implanted in the arterial circulation. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 115:604-612.
[4]Cercek B, Shaifi B, Barath P, et al. Growth factors in pathogenesis of coronary arterial restenosis. Am J Cardiol, 1991,68:24-33.
[5]Dattilo JB, Dattilo MP, Crane JT, et al. The nitric oxide precursor L-arginine reduces expression of hyaluronan synthase in experimental vein bypass grafts. J Surg Res, 1998,74:39-42., 百拇医药