帕金森病患者细胞色素P450 2E1基因5’侧翼区多态性的研究
王建 刘焯霖 陈彪 潘锡榜 卢锡林
摘 要：目的 探讨细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因5'侧翼区多态性与帕金森病(PD)遗传易患性的关系。方法 选择确诊的PD病人150例和正常人150例，利用聚合酶链式反应和RsaⅠ、PstⅠ限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测CYP2E1基因5'侧翼区多态性，并分析比较PD病人与正常人之间基因型和等位基因分布频率的差异。结果 发现PD病人和正常人之间CYP2E1基因基因型和等位基因的分布频率差异均无显著性。结论 CYP2E1基因5侧翼区多态性可能与PD的遗传易患性无关。
关键词：帕金森病 细胞色素P450 多态性 遗传易患性
帕金森病(Parkinsons disease,PD)病人黑质多巴胺神经元死亡的原因至今不明。但推测可能与自由基的生成和氧化应激有关[1]。细胞色素P450 2E1(CYP2E1)参与活性氧的生成，且与内源性毒素如异喹啉的代谢有关[2]。因此，从理论上讲，CYP2E1活性增加或者是中脑黑质多巴胺的蓄积均可造成异喹啉衍生物对黑质多巴胺细胞的慢性损伤。目前国内外尚未见到有关CYP2E1基因多态性与PD关系的报道。为此，我们探讨了能够影响CYP2E1转录活性的该基因5侧翼区PstⅠ和RsaⅠ位点多态性与PD遗传易患性的关系。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般资料 病例组：150例原发性PD病人来自我院神经科PD门诊，根据全国第一届锥体外系会议制订的PD诊断标准确诊为原发性PD。其中男85例，女65例，年龄41～79岁。平均65岁。对照组：150名正常人来自门诊健康查体的人员，排除锥体外系疾病、精神病、肿瘤等。其中男83例，女67例，年龄40～70岁，平均63岁。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取：抽静脉血10 mL，ACD抗凝，采用常规酚/氯仿抽提法提取DNA，采取紫外分光度法根据吸光度(A)值：260值将DNA稀释至0.5 μg/mL。
1.2.2 CYP2E1基因分析：利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，参照Hayashi等[3]报道的方法。引物序列J9 5-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3(位于-1372～-1352)，J8 5-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3(位于-960～-980)。PCR扩增片段长度为410 bp。若存在一个Rsal酶切位点(等位基因C1)，则PCR扩增产物被切成360 bp和50 bp两个片段；若存在一个PstⅠ酶切位点(等位基因C2)，则PCR扩增产物被切成290 bp和120 bp两个片段。
, 百拇医药
1.3 数据处理 计算比较PD组和对照组CYP2E1基因型和等位基因频率，确认其符合Hardy-Weinberg平衡。组间基因型和等位基因频率的比较用Fisher确切双侧P检验。统计学处理用SAS(6.11 for windows)计算机软件进行。
2 结果
正常人和PD病人CYP2E1基因型和等位基因分布频率的比较见表1，由表1可见，PD病人和正常人CYP2E1基因型和等位基因分布频率均无显著性差异。
表1 正常人和PD病人CYP2E1基因型和等位基因分布频率的比较
例数
基因型
染色
体数
, 百拇医药
等位基因
C1C1
C1C2
C2C2
C1
C2
对照组
150
109
(0.727)
38
(0.253)
3
, 百拇医药
(0.020)
300
256
(0.853)
44
(0.147
PD组
150
101
(0.673)
44
(0.293)
5
, http://www.100md.com
(0.034)
300
246
(0.82)
54
(0.18)
注：C1:PstI- RsaⅠ+. C2:PstⅠ+ RsaⅠ-
基因型比较：Fisher确切P=0.541
等位基因比较：Fisher确切P=0.320
3 讨论
CYP2E1是细胞色素P450家族的成员之一。过去的十几年，在对P450家族与PD遗传易患性关系的研究中，焦点集中在CYP2D6。但到目前为止，有关CYP2D6基因多态性与PD遗传易患性的关系仍有争论[4]。人们关注是否其他的P450家族的解毒酶基因多态性与PD的易患性有关。
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CYP2E1参与外源物(xenobiotics)的代谢和激活[5]，同时还与内源性毒素如异喹啉(isoquinolines)的生成有关。在体内，它可将乙醇代谢为乙醛，后者再与多巴胺缩合生成异喹啉衍生物[2]。四羟异喹啉衍生物具有与MPTP类似的神经化学特征，已证实它可直接造成黑质多巴胺能神经元的慢性损伤，是一种可能与PD发病有关的内源性毒素。Riedl等[6]采用免疫组化技术发现，在大鼠的黑质和纹状体内有CYP2E1表达，提示它可能与黑质多巴胺能神经元的功能有关。因此，CYP2E1活性改变可能决定黑质多巴胺能神经元对慢性自由基以及异喹啉衍生物损伤的易患性。
Hayashi等[3]研究发现，CYP2E1基因5侧翼区的遗传多态性影响其转录活性，进而导致药物氧化活性的个体差异。本研究显示，我国正常人和PD病人之间CYP2E1基因型和等位基因分布频率的差异均无显著性，提示CYP2E1基因5侧翼区多态性可能与PD的遗传易患性无关。这只是在中国人群的初步研究，研究结果尚需在其他人群中进一步证实。
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王建(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
刘焯霖(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
陈彪(美国帕金森病研究所)
潘锡榜(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
卢锡林(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
参考文献
1.王 建. 帕金森病的生物学与病因学研究进展. 国外医学内科学分册，1998，25(9)：382
2.Kennedy NP, Tipton KF. Ethanol metabolism and alcoholic liver disease. Essay Biochem, 1990,25(1):137
, 百拇医药
3.Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K, et al. Genetic polymorphisms in 5-flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P450Ⅱ E Ⅰgene. J Biochem Tokyo, 1991,110(4):559
4.Riedl AG, Watts PM, Jenner P, et al. P450 enzymes and Parkinsons disease. the story so far. Mov Disord, 1998,13(2):212
5.Gonzalez FJ, Gelboin HV. Role of human cytochromes P450 in the metabolic activation of chemical carcinogens and toxins. Drug Metab Rev, 1994,26(1-2):165
6.Riedl AG, Watts PM, Edwards RJ, et al. Selective localization of P450 enzymes and NADPH-P450 oxidoreductase in rat basal ganglia using anti-peptide antisera. Brain Res, 1996,743(1-2):324, 百拇医药
摘 要：目的 探讨细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因5'侧翼区多态性与帕金森病(PD)遗传易患性的关系。方法 选择确诊的PD病人150例和正常人150例，利用聚合酶链式反应和RsaⅠ、PstⅠ限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测CYP2E1基因5'侧翼区多态性，并分析比较PD病人与正常人之间基因型和等位基因分布频率的差异。结果 发现PD病人和正常人之间CYP2E1基因基因型和等位基因的分布频率差异均无显著性。结论 CYP2E1基因5侧翼区多态性可能与PD的遗传易患性无关。
关键词：帕金森病 细胞色素P450 多态性 遗传易患性
帕金森病(Parkinsons disease,PD)病人黑质多巴胺神经元死亡的原因至今不明。但推测可能与自由基的生成和氧化应激有关[1]。细胞色素P450 2E1(CYP2E1)参与活性氧的生成，且与内源性毒素如异喹啉的代谢有关[2]。因此，从理论上讲，CYP2E1活性增加或者是中脑黑质多巴胺的蓄积均可造成异喹啉衍生物对黑质多巴胺细胞的慢性损伤。目前国内外尚未见到有关CYP2E1基因多态性与PD关系的报道。为此，我们探讨了能够影响CYP2E1转录活性的该基因5侧翼区PstⅠ和RsaⅠ位点多态性与PD遗传易患性的关系。
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1 资料与方法
1.1 一般资料 病例组：150例原发性PD病人来自我院神经科PD门诊，根据全国第一届锥体外系会议制订的PD诊断标准确诊为原发性PD。其中男85例，女65例，年龄41～79岁。平均65岁。对照组：150名正常人来自门诊健康查体的人员，排除锥体外系疾病、精神病、肿瘤等。其中男83例，女67例，年龄40～70岁，平均63岁。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取：抽静脉血10 mL，ACD抗凝，采用常规酚/氯仿抽提法提取DNA，采取紫外分光度法根据吸光度(A)值：260值将DNA稀释至0.5 μg/mL。
1.2.2 CYP2E1基因分析：利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，参照Hayashi等[3]报道的方法。引物序列J9 5-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3(位于-1372～-1352)，J8 5-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3(位于-960～-980)。PCR扩增片段长度为410 bp。若存在一个Rsal酶切位点(等位基因C1)，则PCR扩增产物被切成360 bp和50 bp两个片段；若存在一个PstⅠ酶切位点(等位基因C2)，则PCR扩增产物被切成290 bp和120 bp两个片段。
, 百拇医药
1.3 数据处理 计算比较PD组和对照组CYP2E1基因型和等位基因频率，确认其符合Hardy-Weinberg平衡。组间基因型和等位基因频率的比较用Fisher确切双侧P检验。统计学处理用SAS(6.11 for windows)计算机软件进行。
2 结果
正常人和PD病人CYP2E1基因型和等位基因分布频率的比较见表1，由表1可见，PD病人和正常人CYP2E1基因型和等位基因分布频率均无显著性差异。
表1 正常人和PD病人CYP2E1基因型和等位基因分布频率的比较
例数
基因型
染色
体数
, 百拇医药
等位基因
C1C1
C1C2
C2C2
C1
C2
对照组
150
109
(0.727)
38
(0.253)
3
, 百拇医药
(0.020)
300
256
(0.853)
44
(0.147
PD组
150
101
(0.673)
44
(0.293)
5
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(0.034)
300
246
(0.82)
54
(0.18)
注：C1:PstI- RsaⅠ+. C2:PstⅠ+ RsaⅠ-
基因型比较：Fisher确切P=0.541
等位基因比较：Fisher确切P=0.320
3 讨论
CYP2E1是细胞色素P450家族的成员之一。过去的十几年，在对P450家族与PD遗传易患性关系的研究中，焦点集中在CYP2D6。但到目前为止，有关CYP2D6基因多态性与PD遗传易患性的关系仍有争论[4]。人们关注是否其他的P450家族的解毒酶基因多态性与PD的易患性有关。
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CYP2E1参与外源物(xenobiotics)的代谢和激活[5]，同时还与内源性毒素如异喹啉(isoquinolines)的生成有关。在体内，它可将乙醇代谢为乙醛，后者再与多巴胺缩合生成异喹啉衍生物[2]。四羟异喹啉衍生物具有与MPTP类似的神经化学特征，已证实它可直接造成黑质多巴胺能神经元的慢性损伤，是一种可能与PD发病有关的内源性毒素。Riedl等[6]采用免疫组化技术发现，在大鼠的黑质和纹状体内有CYP2E1表达，提示它可能与黑质多巴胺能神经元的功能有关。因此，CYP2E1活性改变可能决定黑质多巴胺能神经元对慢性自由基以及异喹啉衍生物损伤的易患性。
Hayashi等[3]研究发现，CYP2E1基因5侧翼区的遗传多态性影响其转录活性，进而导致药物氧化活性的个体差异。本研究显示，我国正常人和PD病人之间CYP2E1基因型和等位基因分布频率的差异均无显著性，提示CYP2E1基因5侧翼区多态性可能与PD的遗传易患性无关。这只是在中国人群的初步研究，研究结果尚需在其他人群中进一步证实。
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王建(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
刘焯霖(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
陈彪(美国帕金森病研究所)
潘锡榜(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
卢锡林(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
参考文献
1.王 建. 帕金森病的生物学与病因学研究进展. 国外医学内科学分册，1998，25(9)：382
2.Kennedy NP, Tipton KF. Ethanol metabolism and alcoholic liver disease. Essay Biochem, 1990,25(1):137
, 百拇医药
3.Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K, et al. Genetic polymorphisms in 5-flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P450Ⅱ E Ⅰgene. J Biochem Tokyo, 1991,110(4):559
4.Riedl AG, Watts PM, Jenner P, et al. P450 enzymes and Parkinsons disease. the story so far. Mov Disord, 1998,13(2):212
5.Gonzalez FJ, Gelboin HV. Role of human cytochromes P450 in the metabolic activation of chemical carcinogens and toxins. Drug Metab Rev, 1994,26(1-2):165
6.Riedl AG, Watts PM, Edwards RJ, et al. Selective localization of P450 enzymes and NADPH-P450 oxidoreductase in rat basal ganglia using anti-peptide antisera. Brain Res, 1996,743(1-2):324, 百拇医药