几种重组干扰素单独及联用阿霉素对骨肉瘤细胞的毒性研究
吕海 马学军 金大地 史占军 景宗森
摘 要：目的 体外评价几种国产干扰素联合阿霉素的抗骨肉瘤活性及其协同效应。方法 采用MTT比色法，体外对比检测阿霉素及几种国内临床常用重组干扰素(rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ)的抗骨肉瘤细胞增殖活性。分别将几种干扰素与阿霉素联合用药，对比检测其抗骨肉瘤的协同作用。结果 rhIFNa 2a为5×104IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L 时，细胞生长抑制率均达到50%；rhIFNγ对0S732细胞生长无明显抑制作用；rhIFNa 1c与ADM合用时有明显的协同增强效应。结论 rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNb 、rhIFNa 1c对骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其中以rhIFNa 2a和rhIFNa 1c作用最为明显；上述4种IFNs与阿霉素合用均呈协同增强效应；rhIFNγ在体外对骨肉瘤细胞无明显抑制作用。
, 百拇医药
关键词：骨肉瘤 干扰素 MTT比色法
干扰素(Interferon，IFN)是目前临床用于治疗肿瘤效果最好的一种细胞因子，尤其是其对骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)疗效愈来愈得到人们的认可。近年来，大肠杆菌产生的重组IFN以其高纯度、低成本、易生产的特点，在临床的应用越来越广泛。目前国内常用的几种人重组IFN有：rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ。研究IFN的抗骨肉瘤生物学活性，对于其临床应用有着重要的意义，因此，我们将上述几种IFNs及常用抗OS化疗药阿霉素(adriamycin，ADM)应用于OS732细胞上，系统地比较了它们体外抑制OS细胞生长的活性。
1 材料与方法
1.1 材料 OS732细胞(中国人骨肉瘤细胞株)购于北京积水潭医院骨科实验室。人基因工程干扰素a 2a(rhIFNa 2a)购于长春生物制品研究所；人基因工程干扰素a 1b(rhIFNa 1b)购于深圳科兴生物制品公司；人基因工程γ干扰素(rhIFNγ)购于上海生物制品研究所；人基因工程b 干扰素(rhIFNb )、人基因工程干扰素a 1c/86D(rhIFNa 1c/86D)由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程室马学军博士惠赠。IFN滴度均用中国药品生物制品鉴定所提供的IFNa 标准品校正。ADM、MTT(四氮唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、EDTA购于天象人生物技术公司；1640培养基、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶、Hepes缓冲剂购于GIBCO-BRL公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养 OS732细胞正常增殖、传代时，用含10% FCS的RPMI 1640全培养液培养；为了消除内源激素的影响，优化MTT检测方法，我们在加入IFNs样品时，即将FCS浓度调整为5%，并有时用活性碳(DCC)预处理。
1.2.2 抑制骨肉瘤细胞增殖实验[1,2] 待OS732细胞在24cm2培养瓶中长满单层后，0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合液消化，用含5% FCS的RPMI 1640培养基重悬OS732细胞，调整终浓度为2.5×108个/L，接种于96孔培养板，200ml/孔；37℃ 5%CO2培养6 h，以便细胞及其表面受体恢复；分别加入上述IFNs样品，1/4倍比稀释，2×3孔/浓度/样品；37℃ 5%CO2培养84h(用ADM时只培养48h)，每隔24h换液，并加入相同浓度样品；加入MTT 40mg/孔，37℃ 5%CO2培养4h；去上清，加DMSO 100ml/孔，室温放置30min，酶标仪测OD570nm光吸收值。细胞生长抑制率的百分数用下述公式计算：
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细胞抑制率；A为正常细胞对照组的OD570值；B为上样细胞实验组的OD570值。
2 结果
2.1不同型别IFNs抗骨肉瘤活性比较 采用MTT比色分析法，对比检测上述干扰素体外抑制OS732细胞的分裂增殖活性。结果见图1。图中可见：当rhIFNa 2a为5×104 IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L时，其对OS732细胞生长抑制率达到50%；而对于rhIFNγ，即使浓度达到1×106 IU/L 时，也未产生明显的抑制0S732细胞生长的作用。为了排除血清内源激素对实验结果的影响，我们同时用经DCC预处理及未经DCC预处理的FCS进行同样实验，结果未发现有显著差异，说明血清中存在的微量激素对本实验没有明显影响。
, 百拇医药
图1 5种IFNs对OS732细胞增殖的影响
Fig.1 Cytotoxicity of 5 IFNs to OS732
2.2 不同型别IFNs与阿霉素联合的抗骨肉瘤活性 联合用药时，我们选择5×104 IU/L 的5种IFNs分别与62.5mg/L的ADM联合使用。可以看出，并非所有的IFNs与ADM合用均有协同抗OS效应。其中rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 与ADM合用时有协同增强抗OS效应；尤其是当rhIFNa 1c与ADM联合使用时，其细胞抑制率由单独使用ADM时的(53.1±6.3)%提高到(87.5±4.0)%，呈明显的协同增强效应。
表1 ADM及其与不同IFNs的协同细胞毒性
Tab.1 Synergistic cytotoxicity of interferons and adriamycin to osteosarcoma cells
, 百拇医药
ADM
rhIFNa 2a
rhIFNa 1b
rhIFNa 1c
rhIFNb
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
, 百拇医药
With ADM
Cytostatic rate
(%)
53.1± 6.3
51.3± 3.7
63.5± 4.2
24.4± 4.7
69.4± 3.6
37.1± 5.1
87.5± 4.0
18.1± 3.2
58.2± 3.7
, 百拇医药
3 讨论
骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，大多数患者在明确诊断时即已发生了转移。手术治疗的2年存活率是20%，即使再辅以化疗，存活率也只提高到66%[2]。生物治疗是继手术(截肢或保肢)、化疗、放疗三大治疗手段之后，又一种治疗骨肉瘤的重要手段，而IFNs是骨肉瘤生物治疗中最为常用且疗效肯定的一种细胞因子。大量体内、体外实验表明：IFNs对体外培养或裸鼠体内移植的多种骨肉瘤细胞的分裂、增殖，都有明显的抑制作用；同时也发现[3~5]，不同型或亚型的IFNs对不同骨肉瘤细胞的抑制效果也不尽相同；另外，在临床应用中，现在国内常用的IFNs种类繁多，各种IFNs之间的疗效尚无对比。同时，IFNs应用后的副作用限制了其剂量的提高，从而影响了疗效。
为了提高IFNs的临床应用价值，我们采用多个剂量梯度，对比研究了不同干扰素的抗骨肉瘤活性。结果表明，不同型IFNs的抗OS活性并不相同。其中以rhIFN-a 2a和rhIFNa 1c单独应用时的抗骨肉瘤活性较高；而rhIFNγ即使在很高的浓度下，也不能抑制OS732细胞的增殖。结合临床治疗方案，我们还对不同型IFNs与化疗药物ADM的协同作用进行了对比研究，以提高IFNs的临床应用价值。在联合用药时，也并非所有IFNs与ADM合用都呈协同增强效应，其中以rhIFNa 1c的协同增强作用最为明显。不同IFNs及其与ADM联合使用时所显示的不同结果，反映了OS732细胞对不同IFNs的敏感性的差别，这与文献报道相符[4,5]。临床上对每一实体瘤进行个体药敏评估，也许是解决这一问题的有效方法。另外，有文献报道[3]，rhIFNγ的生物活性主要是免疫调节作用，这可能是rhIFNγ体外直接抑制OS732细胞生长活性较低的原因。目前IFNs剂量的常用参照单位为U(IFN抗病毒活性效价)，这一单位是根据IFNs抗肿瘤活性的大小根据细胞病变抑制法而测定的，其大小与IFNs的质量基本成正比。尤为重要的是，现在临床上都是以这一单位来衡量IFNs的用量多少。因此，本实验中，我们仍以此为IFNs用量大小的参照单位。
, 百拇医药
作者简介：吕海，男，1969年出生，1998年毕业于第一军医大学；医学硕士，医师，助教；电话：85141888-87190
作者单位：吕 海 金大地 史占军 景宗森(第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)
马学军(中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室，北京，100054)
参考文献
1 Song LN. Effects of EB1089, a novel 1,25-dihydroxyvitamin D analogue, on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells. Chin J Physiol Sci,1993,14(4):337
, http://www.100md.com 2 Jia SF, Kleinerman ES. Antitumor activity of TNF-alpha, IL-1, and IFN-gamma against three human osteosarcoma cell lines. Lymphokine Cytokine Res, 1991, 10(4): 281
3 范中善，杜 平，屠 瑞等.干扰素的临床应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996.1～24
4 Harju VT, Alitalo R, Andersson LC .Divergent in vitro effects of recombinant interferons on human osteosarcoma cells.Bone, 1990, 11(4): 247
5 Brosjo O, Bauer HC, Nilsson OS et al. Effect of human interferon-alpha and interferon-gamma on growth, histology, and DNA content of human osteosarcomas in nude mice. J Interferon Res, 1989, 9(4): 475, 百拇医药
摘 要：目的 体外评价几种国产干扰素联合阿霉素的抗骨肉瘤活性及其协同效应。方法 采用MTT比色法，体外对比检测阿霉素及几种国内临床常用重组干扰素(rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ)的抗骨肉瘤细胞增殖活性。分别将几种干扰素与阿霉素联合用药，对比检测其抗骨肉瘤的协同作用。结果 rhIFNa 2a为5×104IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L 时，细胞生长抑制率均达到50%；rhIFNγ对0S732细胞生长无明显抑制作用；rhIFNa 1c与ADM合用时有明显的协同增强效应。结论 rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNb 、rhIFNa 1c对骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其中以rhIFNa 2a和rhIFNa 1c作用最为明显；上述4种IFNs与阿霉素合用均呈协同增强效应；rhIFNγ在体外对骨肉瘤细胞无明显抑制作用。
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关键词：骨肉瘤 干扰素 MTT比色法
干扰素(Interferon，IFN)是目前临床用于治疗肿瘤效果最好的一种细胞因子，尤其是其对骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)疗效愈来愈得到人们的认可。近年来，大肠杆菌产生的重组IFN以其高纯度、低成本、易生产的特点，在临床的应用越来越广泛。目前国内常用的几种人重组IFN有：rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ。研究IFN的抗骨肉瘤生物学活性，对于其临床应用有着重要的意义，因此，我们将上述几种IFNs及常用抗OS化疗药阿霉素(adriamycin，ADM)应用于OS732细胞上，系统地比较了它们体外抑制OS细胞生长的活性。
1 材料与方法
1.1 材料 OS732细胞(中国人骨肉瘤细胞株)购于北京积水潭医院骨科实验室。人基因工程干扰素a 2a(rhIFNa 2a)购于长春生物制品研究所；人基因工程干扰素a 1b(rhIFNa 1b)购于深圳科兴生物制品公司；人基因工程γ干扰素(rhIFNγ)购于上海生物制品研究所；人基因工程b 干扰素(rhIFNb )、人基因工程干扰素a 1c/86D(rhIFNa 1c/86D)由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程室马学军博士惠赠。IFN滴度均用中国药品生物制品鉴定所提供的IFNa 标准品校正。ADM、MTT(四氮唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、EDTA购于天象人生物技术公司；1640培养基、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶、Hepes缓冲剂购于GIBCO-BRL公司。
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1.2 方法
1.2.1 细胞的培养 OS732细胞正常增殖、传代时，用含10% FCS的RPMI 1640全培养液培养；为了消除内源激素的影响，优化MTT检测方法，我们在加入IFNs样品时，即将FCS浓度调整为5%，并有时用活性碳(DCC)预处理。
1.2.2 抑制骨肉瘤细胞增殖实验[1,2] 待OS732细胞在24cm2培养瓶中长满单层后，0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合液消化，用含5% FCS的RPMI 1640培养基重悬OS732细胞，调整终浓度为2.5×108个/L，接种于96孔培养板，200ml/孔；37℃ 5%CO2培养6 h，以便细胞及其表面受体恢复；分别加入上述IFNs样品，1/4倍比稀释，2×3孔/浓度/样品；37℃ 5%CO2培养84h(用ADM时只培养48h)，每隔24h换液，并加入相同浓度样品；加入MTT 40mg/孔，37℃ 5%CO2培养4h；去上清，加DMSO 100ml/孔，室温放置30min，酶标仪测OD570nm光吸收值。细胞生长抑制率的百分数用下述公式计算：
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细胞抑制率；A为正常细胞对照组的OD570值；B为上样细胞实验组的OD570值。
2 结果
2.1不同型别IFNs抗骨肉瘤活性比较 采用MTT比色分析法，对比检测上述干扰素体外抑制OS732细胞的分裂增殖活性。结果见图1。图中可见：当rhIFNa 2a为5×104 IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L时，其对OS732细胞生长抑制率达到50%；而对于rhIFNγ，即使浓度达到1×106 IU/L 时，也未产生明显的抑制0S732细胞生长的作用。为了排除血清内源激素对实验结果的影响，我们同时用经DCC预处理及未经DCC预处理的FCS进行同样实验，结果未发现有显著差异，说明血清中存在的微量激素对本实验没有明显影响。
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图1 5种IFNs对OS732细胞增殖的影响
Fig.1 Cytotoxicity of 5 IFNs to OS732
2.2 不同型别IFNs与阿霉素联合的抗骨肉瘤活性 联合用药时，我们选择5×104 IU/L 的5种IFNs分别与62.5mg/L的ADM联合使用。可以看出，并非所有的IFNs与ADM合用均有协同抗OS效应。其中rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 与ADM合用时有协同增强抗OS效应；尤其是当rhIFNa 1c与ADM联合使用时，其细胞抑制率由单独使用ADM时的(53.1±6.3)%提高到(87.5±4.0)%，呈明显的协同增强效应。
表1 ADM及其与不同IFNs的协同细胞毒性
Tab.1 Synergistic cytotoxicity of interferons and adriamycin to osteosarcoma cells
, 百拇医药
ADM
rhIFNa 2a
rhIFNa 1b
rhIFNa 1c
rhIFNb
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
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With ADM
Cytostatic rate
(%)
53.1± 6.3
51.3± 3.7
63.5± 4.2
24.4± 4.7
69.4± 3.6
37.1± 5.1
87.5± 4.0
18.1± 3.2
58.2± 3.7
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3 讨论
骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，大多数患者在明确诊断时即已发生了转移。手术治疗的2年存活率是20%，即使再辅以化疗，存活率也只提高到66%[2]。生物治疗是继手术(截肢或保肢)、化疗、放疗三大治疗手段之后，又一种治疗骨肉瘤的重要手段，而IFNs是骨肉瘤生物治疗中最为常用且疗效肯定的一种细胞因子。大量体内、体外实验表明：IFNs对体外培养或裸鼠体内移植的多种骨肉瘤细胞的分裂、增殖，都有明显的抑制作用；同时也发现[3~5]，不同型或亚型的IFNs对不同骨肉瘤细胞的抑制效果也不尽相同；另外，在临床应用中，现在国内常用的IFNs种类繁多，各种IFNs之间的疗效尚无对比。同时，IFNs应用后的副作用限制了其剂量的提高，从而影响了疗效。
为了提高IFNs的临床应用价值，我们采用多个剂量梯度，对比研究了不同干扰素的抗骨肉瘤活性。结果表明，不同型IFNs的抗OS活性并不相同。其中以rhIFN-a 2a和rhIFNa 1c单独应用时的抗骨肉瘤活性较高；而rhIFNγ即使在很高的浓度下，也不能抑制OS732细胞的增殖。结合临床治疗方案，我们还对不同型IFNs与化疗药物ADM的协同作用进行了对比研究，以提高IFNs的临床应用价值。在联合用药时，也并非所有IFNs与ADM合用都呈协同增强效应，其中以rhIFNa 1c的协同增强作用最为明显。不同IFNs及其与ADM联合使用时所显示的不同结果，反映了OS732细胞对不同IFNs的敏感性的差别，这与文献报道相符[4,5]。临床上对每一实体瘤进行个体药敏评估，也许是解决这一问题的有效方法。另外，有文献报道[3]，rhIFNγ的生物活性主要是免疫调节作用，这可能是rhIFNγ体外直接抑制OS732细胞生长活性较低的原因。目前IFNs剂量的常用参照单位为U(IFN抗病毒活性效价)，这一单位是根据IFNs抗肿瘤活性的大小根据细胞病变抑制法而测定的，其大小与IFNs的质量基本成正比。尤为重要的是，现在临床上都是以这一单位来衡量IFNs的用量多少。因此，本实验中，我们仍以此为IFNs用量大小的参照单位。
, 百拇医药
作者简介：吕海，男，1969年出生，1998年毕业于第一军医大学；医学硕士，医师，助教；电话：85141888-87190
作者单位：吕 海 金大地 史占军 景宗森(第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)
马学军(中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室，北京，100054)
参考文献
1 Song LN. Effects of EB1089, a novel 1,25-dihydroxyvitamin D analogue, on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells. Chin J Physiol Sci,1993,14(4):337
, http://www.100md.com 2 Jia SF, Kleinerman ES. Antitumor activity of TNF-alpha, IL-1, and IFN-gamma against three human osteosarcoma cell lines. Lymphokine Cytokine Res, 1991, 10(4): 281
3 范中善，杜 平，屠 瑞等.干扰素的临床应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996.1～24
4 Harju VT, Alitalo R, Andersson LC .Divergent in vitro effects of recombinant interferons on human osteosarcoma cells.Bone, 1990, 11(4): 247
5 Brosjo O, Bauer HC, Nilsson OS et al. Effect of human interferon-alpha and interferon-gamma on growth, histology, and DNA content of human osteosarcomas in nude mice. J Interferon Res, 1989, 9(4): 475, 百拇医药