潜生体定植的原位观察技术研
丛延广 刘俊康 袁泽涛 徐启旺
摘要 对小鼠结肠组织原位标本进行潜生体定植的实验研究。染色采用美蓝初染后，高锰酸钾复染的方法。方法简便、有效。
关键词：潜生体 定植 染色
细菌在组织表面的定植是其发挥生物学功能的基础[1]， 我们在研究潜生体定植的工作中，建立了组织铺片染色法，采用光学显微镜直接观察原位标本上的潜生体，能够较好地反映潜生体与组织之间的关系。现报导如下：
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠20只(第三军医大学实验动物中心提供)，雌雄各半。
1.2 抗生素 西力辛(Glaxo, England)， 用于诱导潜生体，经过预试确定剂量为0.2ml×1mg/ml，经腹腔注射。
, 百拇医药
1.3 染色液 0.1%美蓝水溶液，0.1%高锰酸钾水溶液。
1.4 方法 小鼠腹腔注射西力辛，剂量采用0.2ml×1mg/ml，每天1次，连续5天。停止注射后5天，处理如下：
将小鼠颈椎脱臼法处死，解剖后取回盲部肠段，剪为两段。一段依Costerton的方法染色观察，将肠段纵向剪开，在无菌PBS中充分漂洗6次，以洗去未定植菌，然后用锐匙轻刮组织内表面，涂片，经革兰染色，光镜观察。
另一段依新法处理，用尖嘴镊子小心地将肠段浆膜层撕去，然后将肠段纵向剖开，在无菌PBS缓冲液中漂洗6次，以除去未定植的细菌。然后将肠片粘膜面向上平铺于玻片上，于紫外灯下干燥4h左右。
取已干燥好的肠片标本，加适量0.1%美蓝水溶液浸没全部标本2min，再以PBS缓冲液洗去美蓝染料，此时标本被染成蓝色。加0.1%高酸钾水溶液刚好浸没全部标本，15sec后迅速以PBS缓冲液冲洗，此时标本呈黄绿色，如果颜色还偏蓝，则重复上一操作，直到颜色合适。于室温晾干，油镜下观察。
, 百拇医药
2 结果与讨论
同样采用光学显微镜观察，Costerton法处理标本刮下的组织细胞和细菌是杂乱无序的，完全不能体现二者关系，而且群集结构也因易被破坏而少见。新法则能较多地见到成团或成排有序排列的群集结构，群集细菌与组织细胞的关系亦表现的比较明显(见图1,图2)。
图1
图2
依据Costerton关于定植过程三阶段的观念[2]，即：①细菌表面的配体与组织细胞表面的受体发生特异性的结合；②细菌分泌糖包被使其与组织细胞紧密粘附；③经过分裂繁殖形成一个群落，胞外糖使其牢固地粘附在一起。因此散在的菌体并不能被认为是定植的。由此我们可以确定判断潜生体定植的标准：①潜生体以群集方式存在于组织细胞表面。②潜生体排列比较整齐有序。
由于对细菌定植重要性的充分认识，从70年代开始，这方面的研究广泛开展起来。早期对细菌定植的研究产生了一个重要的概念：在感染性疾病的诊断中培养出来的细菌是否是定植的细菌，在病因的确定上有重要的差异，只有定植的细菌才是真正的病原[3]。定植研究中常用的方法是细菌分离法，如将小鼠经口灌胃细菌停止后，连续做肠道细菌的分离培养来确定被研究的细菌是否定植。也采用肠组织漂洗匀浆并培养，对定植的细菌进行定量[4]。这些方法操作复杂，并缺乏定植的形态学指标。80年代初，JM.costerton把定植了细菌的组织经适当漂洗后，用锐匙轻刮组织表面，涂片并计数培养，较以前方法简便且有效[5]。但该法由于不是原位观察而不能够确定定植菌群之间 ，定植菌群与组织之间的关系。
, http://www.100md.com
组织铺片染色技术比Costerton法略复杂一些，特别之处在于美蓝染色后用0.1%的高锰酸钾处理，以使定植菌呈现黑褐色，而组织为黄绿色，对比度较好。但高锰酸钾溶液处理过程需比较慎重，时间长了短了效果都不好，需要一定的经验。该染色法的原理并不清楚，可能与高锰酸钾对组织和细菌的氧化作用存在差异有关。此方法的局限性是要求受检细菌有较特殊的形态，也可应用于细菌对无菌动物定植情况的检查。
基金项目：国家自然科学基金资助项目，批准号：39370008
作者简介：丛延广(1973-)，男，助教，硕士，研究方向为细菌潜生体的生物学意义。
作者单位：丛延广(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
刘俊康(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
, 百拇医药 袁泽涛(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
徐启旺(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
参考文献
[1]RAPHAEL CY, et al. Microbial colonization of human ileal conduits[J]. Appl Environ Microbiol, 1984,48:1159.
[2]COSTERTON JM. Bacterial biofilm in nature and diseases[J]. Ann Rev. Microbiol, 1987,41:435.
[3]COSTERTON JM, GEESEY GG， CHENG KJ. How bacteria stick[J]. Scientific American, 1978,238(1):86.
, http://www.100md.com
[4]BORRIELLO SP, et al. Mucosal association by Clostridium difficile in hamster gas trointestinal tract[J]. J Med Microbiol, 1988,25:191.
[5]COSTERTON JM, NICKEL JC， LADD TI. Suitable methods for the comparative study of freeliving and surface-associated bacterial populations[C]. From， Poindexter JS and Leadbetter ER. (ed.) Bacteria in nature. vol.2, Plenum Publishing Corp.1986., http://www.100md.com
摘要 对小鼠结肠组织原位标本进行潜生体定植的实验研究。染色采用美蓝初染后，高锰酸钾复染的方法。方法简便、有效。
关键词：潜生体 定植 染色
细菌在组织表面的定植是其发挥生物学功能的基础[1]， 我们在研究潜生体定植的工作中，建立了组织铺片染色法，采用光学显微镜直接观察原位标本上的潜生体，能够较好地反映潜生体与组织之间的关系。现报导如下：
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠20只(第三军医大学实验动物中心提供)，雌雄各半。
1.2 抗生素 西力辛(Glaxo, England)， 用于诱导潜生体，经过预试确定剂量为0.2ml×1mg/ml，经腹腔注射。
, 百拇医药
1.3 染色液 0.1%美蓝水溶液，0.1%高锰酸钾水溶液。
1.4 方法 小鼠腹腔注射西力辛，剂量采用0.2ml×1mg/ml，每天1次，连续5天。停止注射后5天，处理如下：
将小鼠颈椎脱臼法处死，解剖后取回盲部肠段，剪为两段。一段依Costerton的方法染色观察，将肠段纵向剪开，在无菌PBS中充分漂洗6次，以洗去未定植菌，然后用锐匙轻刮组织内表面，涂片，经革兰染色，光镜观察。
另一段依新法处理，用尖嘴镊子小心地将肠段浆膜层撕去，然后将肠段纵向剖开，在无菌PBS缓冲液中漂洗6次，以除去未定植的细菌。然后将肠片粘膜面向上平铺于玻片上，于紫外灯下干燥4h左右。
取已干燥好的肠片标本，加适量0.1%美蓝水溶液浸没全部标本2min，再以PBS缓冲液洗去美蓝染料，此时标本被染成蓝色。加0.1%高酸钾水溶液刚好浸没全部标本，15sec后迅速以PBS缓冲液冲洗，此时标本呈黄绿色，如果颜色还偏蓝，则重复上一操作，直到颜色合适。于室温晾干，油镜下观察。
, 百拇医药
2 结果与讨论
同样采用光学显微镜观察，Costerton法处理标本刮下的组织细胞和细菌是杂乱无序的，完全不能体现二者关系，而且群集结构也因易被破坏而少见。新法则能较多地见到成团或成排有序排列的群集结构，群集细菌与组织细胞的关系亦表现的比较明显(见图1,图2)。
图1
图2
依据Costerton关于定植过程三阶段的观念[2]，即：①细菌表面的配体与组织细胞表面的受体发生特异性的结合；②细菌分泌糖包被使其与组织细胞紧密粘附；③经过分裂繁殖形成一个群落，胞外糖使其牢固地粘附在一起。因此散在的菌体并不能被认为是定植的。由此我们可以确定判断潜生体定植的标准：①潜生体以群集方式存在于组织细胞表面。②潜生体排列比较整齐有序。
由于对细菌定植重要性的充分认识，从70年代开始，这方面的研究广泛开展起来。早期对细菌定植的研究产生了一个重要的概念：在感染性疾病的诊断中培养出来的细菌是否是定植的细菌，在病因的确定上有重要的差异，只有定植的细菌才是真正的病原[3]。定植研究中常用的方法是细菌分离法，如将小鼠经口灌胃细菌停止后，连续做肠道细菌的分离培养来确定被研究的细菌是否定植。也采用肠组织漂洗匀浆并培养，对定植的细菌进行定量[4]。这些方法操作复杂，并缺乏定植的形态学指标。80年代初，JM.costerton把定植了细菌的组织经适当漂洗后，用锐匙轻刮组织表面，涂片并计数培养，较以前方法简便且有效[5]。但该法由于不是原位观察而不能够确定定植菌群之间 ，定植菌群与组织之间的关系。
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组织铺片染色技术比Costerton法略复杂一些，特别之处在于美蓝染色后用0.1%的高锰酸钾处理，以使定植菌呈现黑褐色，而组织为黄绿色，对比度较好。但高锰酸钾溶液处理过程需比较慎重，时间长了短了效果都不好，需要一定的经验。该染色法的原理并不清楚，可能与高锰酸钾对组织和细菌的氧化作用存在差异有关。此方法的局限性是要求受检细菌有较特殊的形态，也可应用于细菌对无菌动物定植情况的检查。
基金项目：国家自然科学基金资助项目，批准号：39370008
作者简介：丛延广(1973-)，男，助教，硕士，研究方向为细菌潜生体的生物学意义。
作者单位：丛延广(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
刘俊康(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
, 百拇医药 袁泽涛(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
徐启旺(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
参考文献
[1]RAPHAEL CY, et al. Microbial colonization of human ileal conduits[J]. Appl Environ Microbiol, 1984,48:1159.
[2]COSTERTON JM. Bacterial biofilm in nature and diseases[J]. Ann Rev. Microbiol, 1987,41:435.
[3]COSTERTON JM, GEESEY GG， CHENG KJ. How bacteria stick[J]. Scientific American, 1978,238(1):86.
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[4]BORRIELLO SP, et al. Mucosal association by Clostridium difficile in hamster gas trointestinal tract[J]. J Med Microbiol, 1988,25:191.
[5]COSTERTON JM, NICKEL JC， LADD TI. Suitable methods for the comparative study of freeliving and surface-associated bacterial populations[C]. From， Poindexter JS and Leadbetter ER. (ed.) Bacteria in nature. vol.2, Plenum Publishing Corp.1986., http://www.100md.com