用原位杂交及免疫组化方法检测p53基因及ki-67蛋白在胆管癌中的表达
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中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
王欣 张建希 陈杰
摘 要：目的 研究胆管癌组织中p53基因表达、ki-67增殖指数高低及它们之间的关系，以深入探讨胆管 癌发生、发展的机制。方法 采用原位杂交及免疫组化方法对30例人胆管癌组织p53基因、P53蛋白表达及ki-67蛋白增殖 指数进行检测，探讨它们之间的关系，并进而分析它们与临床病理资料之间的相关性。 结果 原位杂交检测30例胆管癌组织中14例(46.7%)p53基因表达阳性，p53原位杂交结果与胆管癌 的临床病理资料无显著相关性。免疫组化检测30例胆管癌组织中16例(53.3%)有P53蛋白表 达，有局部淋巴结转移组P53蛋白表达阳性率明显高于无局部淋巴结转移组；临床Ⅲ期患者P 53蛋白表达阳性率明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期患者。有P53蛋白表达的患者生存期明显短于无P53 蛋白表达的患者。29例(96.7%)胆管癌患者的肿瘤细胞中有ki-67蛋白表达。在中、低分化 、有局部淋巴结转移、临床Ⅲ期肿瘤组织中，ki-67增殖指数显著高于高分化、无局部淋巴 结转移及临床Ⅰ、Ⅱ期患者。生存期长的肿瘤患者，ki-67增殖指数低于生存期短的患者。结论 ki-67增殖指数反映了胆管癌细胞的增殖活性，分化程度低的肿瘤细胞增殖活跃，局部淋巴 结转移的危险性较大，临床预后较差，提示ki-67增殖指数是用来判断胆管癌患者预后的一 个很有价值的指标。p53基因检测结果与ki-67增殖指数相一致，将两者结合判断胆管癌的 生长活性及临床预后可以提高检测的敏感性和准确性。
, 百拇医药
关键词：p53基因 ki-67蛋白 胆管癌
p53基因是一种抑癌基因，ki-67蛋白为细胞周期调控相关蛋白。p53基因突变致P53蛋白正 常生物学功 能丧失。编码ki-67蛋白的基因位于染色体10q25，在细胞周期的不同阶段，ki-67蛋白的 表达程度不同。本研究采用原位杂交法检测胆管癌组织p53基因的表达，以免疫组化法检测P 53蛋白、ki-67蛋白表达并计算ki-67增殖指数，结合临床病理资料及预后分析探讨胆管癌 发生、发展机制，以期为找到一种早期诊断及判断预后的方法提供依据。
材料和方法
材料 (1) 30例石蜡包埋胆管癌组织为本院病理科存档的1984～1996年外科 手术切除标本；(2) 30例胆管癌患者，年龄30～75岁，平均58.4岁；男∶女为2∶1(20∶10 )。30例患者中19例有周围组织浸润(指侵及肝脏、门静脉、神经、胰腺)，16例伴局部淋巴 结转移；1例鳞癌，29例腺癌；17例高分化癌，13例中、低分化癌；病变部位在胆管上段14例，中段7例，下段9例。临床分期(Ⅰ期指肿瘤局限在胆管内；Ⅱ期指肿瘤侵及肝脏或周围组织；Ⅲ期指有局部淋巴结转移)：Ⅰ期7例，Ⅱ期7例，Ⅲ期16例；(3) 以人乳腺癌石蜡包埋切片作为P53、ki-67免疫组化染色的阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。人乳腺癌组织切片作为p53原位杂交阳性对照，正常肝脏组织切片作为p53原位杂交阴性对照；(4) 30 例胆管癌的病理组织学分型：据WHO标准，分为腺癌和鳞癌；根据分化程度分为高分化、中分化和低分化癌；根据有无周围组织浸润(仅指侵及肝脏、门静脉、神经)分为有和无两组 ；根据有无局部淋巴结转移分为有和无两组；根据肿瘤发生部位分为高、中、低三组；(5) p53 cDNA购自军事医学科学院，p53 cDNA探针的制备按文献[1]方法进行；(6) 限制性内 切 酶XbaⅠ购于中国协和医科大学基础医学研究所；(7) 地高辛精标记及检测试剂盒为Boehrin ger Mannheim公司产品；(8) 抗P53蛋白，抗ki-67蛋白单克隆抗体为北京中山生物技术公司产品；(9) S-P免疫染色试剂盒(SP9000)为美国ZYMED公司产品。
, 百拇医药
原位杂交(ISH) (1) 杂交用探针的制备：质粒DNA酶切和酶切片段的回收按常规方法进行，其中质粒酶切片 段的回收用低熔点琼脂糖凝胶电泳法，p53 cDNA用随机引物法标记，标记探针的回收按常规 方法进行；(2) 载玻片和盖玻片的处理、组织切片的制作及组织原位杂交方法：按文献[2 ，3]进行。
免疫组织化学(IHC)染色 常规行免疫组化染色，以微波加热修复抗原(ki-67染色用高温高压法，组织切片置citrate buffer(pH6.0)溶液中，于高压锅中加热，126℃，0.142 MPa，维持1 min，停止加热， 冷水降压后取出，置于PBS中)。
ki-67增殖指数计算方法 随机选取5个视野，每个视野计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分数 即增殖指数。
统计学方法 用χ2检验进行统计学分析。
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结果
原位杂交检测p53基因在胆管癌中的表达 30例胆管癌组织中，14例p53基因呈阳性表达，阳性率为46.7%；而癌旁组织有12例(40%)p53基因呈阳性表达。p53基因表达阳性者，胞浆及胞核内可见紫蓝色浓缩的斑点或弥散的颗粒(图1)。将p53基因检测结果与临床病理资料相对照，发现p53基因表达阳性率与患者性别、年龄、分化程度、临床分期、部位、有无周围组织浸润、浸润深度、有无淋巴结转移、预后均无明显关系(P>0.05)。
图1 原位杂交检测p53基因在胆管癌细胞中的表达
Fig 1 p53 gene expression with in situ hybridization in cholangiocarcinoma
, 百拇医药
Arrows point to the positive cells with purple-blue nucleus ×200
免疫组化方法检测P53、ki-67蛋白在胆管癌中的表达
P53蛋白表达免疫组化检测结果：乳腺癌阳性对照组织切片细胞核内可见阳性的棕黄色颗粒；30例 胆管癌组织中16例P53蛋白呈阳性表达，细胞核内亦可见棕黄色颗粒；阴性对照未见P53蛋白 表达(图2)。
图2 免疫组化检测p53蛋白胆管癌中的表达
Fig 2 p53 protein expression with immunohistochemistry in cholangiocarcinoma
, 百拇医药
Arrows point to the positive cells with brown-yellow nucleus ×200
P53蛋白表达阳性与临床病理资料的关系：P53蛋白表达与临床分期、淋巴结转移、生存期长短有关(P<0.05)(表1)。
表 1 P53蛋白表达与胆管癌临床病理资料之间的关系
Table 1 Relation between expression of P53 protein and the clinical pathological data of cholangiocarcinoma
Cases
No.of P53 protein expression
, 百拇医药
P value
Clinical stage
Ⅰ
7
2
Ⅱ
7
2
<0.05
Ⅲ
16
12
Lymph node metastasis
, 百拇医药
Yes
16
12
<0.05
No
14
4
Survival time
<16 months
10
8
<0.05
>16 months
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11
2
ki-67蛋白表达的免疫组化检测结果：30例胆管癌组织中29例ki-67蛋白表达阳性，阳性率 96.7%。其增殖指数为4.6%～65.8%，平均30.76%(以中位数将其分为两组：小于30%组和 大于30%组)(图3)。
图3 免疫组化检测 ki-67蛋白胆管癌中的表达
Fig 3 ki-67 protein expression with immunohistochemistry in cholangiocarcinoma
Arrows point to the positive cells with brown-yellow nucleus
, 百拇医药
ki-67蛋白表达与临床病理资料的关系：χ2检验结果表明，ki-67蛋白表达与年龄、性别 、肿瘤部位、浸润深度、有无周围组织浸润无关。但ki-67蛋白表达与肿瘤分化程度、局部淋巴 结转移、临床分期、生存期均明显有关(表2)。
表 2 ki-67蛋白表达与胆管癌临床病理资料之间的关系
Table 2 Relation between ki-67 expression and the clinical pathological data of cholang iocarcinoma
Cases
ki-67 index
P value
<30%
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>30%
Degree of differentiation
Well
17
12
3
<0.01
Moderate(including poor)
13
3
10
Clinical stage
, 百拇医药
Ⅰ
7
4
3
Ⅱ
7
6
1
<0.05
Ⅲ
16
5
11
Lymph node metastasis
, 百拇医药
Yes
16
5
11
<0.05
No
14
10
4
Survival time
<16 months
10
2
, 百拇医药
8
<0.05
>16 months
11
8
3
p53基因表达与P53蛋白表达与ki-67增殖指数的关系
P53蛋白免疫组化结果与ki-67增殖指数的关系：ki-67增殖指数大于30%的15例胆管癌组织 中，12例P53蛋白表达阳性；而ki-67增殖指数小于30%的15例胆管癌组织中，仅4例P53蛋白 表达阳性。P53蛋白表达阳性组，其ki-67增殖指数明显高于无P53蛋白表达阳性组(P<0 .01)。
p53基因杂交结果与ki-67增殖指数的关系：ki-67增殖指数小于30%的15例胆管癌组织中，10例p53基因表达阳性；而ki-67增殖指数大于30%的15例胆管癌组织中，只有4例有p53基因表达阳性。p53基因表达阳性组的肿瘤ki-67增殖指数明显低于p53基因表达阴性组(P<0 .05)，即p53基因表达阳性的病例肿瘤细胞增殖活性低。 讨论
, 百拇医药
野生型p53基因突变后，细胞易出现恶性表型。免疫组化检测的主要是突变型p53基因表达产物[4]。p53基因原位杂交阳性信号可位于肿瘤细胞核及细胞浆内。本实验结果显示细胞核内p53基因原位杂交信号强于细胞浆，这可能是由于常规石蜡切片使细胞浆内mRNA较易降解的缘故。ki-67作为增生相关性抗原于1983年首次被鉴定。 ki-67蛋白的合成开始于G1期，在细胞不同周期，ki-67的表达情况不同，从而决定细胞进入不同分化阶段。免疫组化方法检 测ki-67抗原表达研究表明，在淋巴瘤、乳腺癌、肾癌等组织中均可见ki-67基因产物的过度表达[5]。本实验结果显示96.7%的肿瘤组织呈ki-67蛋白阳性表达。但未见ki-67 增殖指数与患者年龄、性别、肿瘤部位有关，这与Gaspurini等[8]研究结果一致。本研究结果还显示高分化肿瘤ki-67增殖指数均小于30%，而中、低分化的肿瘤ki-67增殖 指数大于30%(P<0.05)，提示分化程度越低，细胞增殖活性越高。而且ki-67增殖指 数亦与局部淋巴结转移及临床分期有关。69%有局部淋巴结转移的肿瘤，增殖指数均大于30% ；而71%无淋巴结转移的肿瘤，增殖指数均小于30%(P<0.05)。临床Ⅲ期患者ki- 67增 殖指数亦明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)。此外，80%增殖指数大于30%的患者，生存期均短于16个月；而73%增殖指数小于30%的患者，生存期均大于16个月，两者相比差异有显著性意义(P<0.05)，这与Rijken等[7]的研究结果一致。综上，胆管癌组织中ki-67蛋白的表达不仅能客观地反映胆管癌组织的增殖活性，并能提示胆管癌局部转移的危险性，还可通过对增殖指数的分析对患者的预后作出预测。
, 百拇医药
分析P53蛋白阳性表达与ki-67增殖指数的关系显示有P53蛋白阳性表达的肿瘤组织ki-67增 殖指数多大于30%，无P53蛋白阳性表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多小于30%。这可能是因 为p53突变导致p53基因功能丧失，从而失去抑制肿瘤细胞生长的功能，细胞呈恶性增长，生 长活跃，使肿瘤的增殖活性升高。同样将p53原位杂交检测结果与ki-67增殖指数做一比较 ，可以看到有p53基因表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多小于30%，无p53基因表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多大于30%，由于原位杂交检测的主要是野生型p53基因，有p53基因表达说明肿瘤组织中p53基因在抑制肿瘤细胞生长方面起到一定作用，肿瘤细胞的增殖活性相应较低，故ki-67增殖指数较低。从本实验结果也可以看出有p53基因突变，则胆管癌局部淋 巴结转移发生率较高，临床分期较晚，而且生存期相对较短，这与ki-67的检测结果相符，Arora等[8]也得出相同的结论。综合P53蛋白免疫组化与p53基因原位杂交检测结 果与ki-67增殖指数的关系，可以看出ki-67增殖指数和p53基因表达在检测胆管癌细胞的 增殖活跃程度上是一致的，将两者结合起来判断胆管癌细胞的生长活性以及胆管癌患者的预 后可以提高检测的敏感性和准确性。
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(本文图1～3见插图第2页)
基金项目：国家杰出青年基金(39625012) Supported by the National Natural Sciences
Foundation of China(39625012)；
作者简介：陈杰 Department o f Pathology,PUMC Hospital,CAMS and PUMC;
王欣 Corresponding author Tel:010-65296002,Fax:010-65256546,E-mail:wx314@263.net
作者单位：王欣(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
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张建希(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
陈杰(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
参考文献：
[1] Zakut-houri R.Human p53 cellular tumour antigen cDNA seq uence and expression in COS cells.EMBO J,1985,4:1281-1285
[2] Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual.New York:Cold Sp ring Harbor Laboratory Press,1988.30-37
[3] Kristiansen H,Jenkins A,Holm R.Coexistence of episomal and interg rate d HPV16 DNA in squamous cell carcinoma of the cervix. J Clin Pathol,1994,47:253 -256
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[4] Hall PA,Lane DP.p53 in tumor pathology:can we trust immunohistoch emistry?J Pathol,1994,172:1-4
[5] Duchrow M,Schluter C,Kubbutat MHG.Cell proliferation-associated nucl ear antigen defined by antibody ki-67:a new kind of cell cycle-maintaining pro tein.Arch Immunol Ther Exp (Warsz),1995,43:117-121
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, 百拇医药
[7] Rijken AM,Umezawa A,van Gulik TM,et al.Prognostic value of ce ll p roliferation (Ki-67 antigen) and nuclear DNA content in clinically resectable d istal bile duct carcinoma.Ann Surg Oncol,1998,5:699-705
[8] Arora DS,Ramsdale J,Lodge JP,et al.p53 but not bc1-2 is e xpressed by most cholangiocarcinomas:a study of 28 cases.Histopathology,1999,34:497-501, http://www.100md.com
摘 要：目的 研究胆管癌组织中p53基因表达、ki-67增殖指数高低及它们之间的关系，以深入探讨胆管 癌发生、发展的机制。方法 采用原位杂交及免疫组化方法对30例人胆管癌组织p53基因、P53蛋白表达及ki-67蛋白增殖 指数进行检测，探讨它们之间的关系，并进而分析它们与临床病理资料之间的相关性。 结果 原位杂交检测30例胆管癌组织中14例(46.7%)p53基因表达阳性，p53原位杂交结果与胆管癌 的临床病理资料无显著相关性。免疫组化检测30例胆管癌组织中16例(53.3%)有P53蛋白表 达，有局部淋巴结转移组P53蛋白表达阳性率明显高于无局部淋巴结转移组；临床Ⅲ期患者P 53蛋白表达阳性率明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期患者。有P53蛋白表达的患者生存期明显短于无P53 蛋白表达的患者。29例(96.7%)胆管癌患者的肿瘤细胞中有ki-67蛋白表达。在中、低分化 、有局部淋巴结转移、临床Ⅲ期肿瘤组织中，ki-67增殖指数显著高于高分化、无局部淋巴 结转移及临床Ⅰ、Ⅱ期患者。生存期长的肿瘤患者，ki-67增殖指数低于生存期短的患者。结论 ki-67增殖指数反映了胆管癌细胞的增殖活性，分化程度低的肿瘤细胞增殖活跃，局部淋巴 结转移的危险性较大，临床预后较差，提示ki-67增殖指数是用来判断胆管癌患者预后的一 个很有价值的指标。p53基因检测结果与ki-67增殖指数相一致，将两者结合判断胆管癌的 生长活性及临床预后可以提高检测的敏感性和准确性。
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关键词：p53基因 ki-67蛋白 胆管癌
p53基因是一种抑癌基因，ki-67蛋白为细胞周期调控相关蛋白。p53基因突变致P53蛋白正 常生物学功 能丧失。编码ki-67蛋白的基因位于染色体10q25，在细胞周期的不同阶段，ki-67蛋白的 表达程度不同。本研究采用原位杂交法检测胆管癌组织p53基因的表达，以免疫组化法检测P 53蛋白、ki-67蛋白表达并计算ki-67增殖指数，结合临床病理资料及预后分析探讨胆管癌 发生、发展机制，以期为找到一种早期诊断及判断预后的方法提供依据。
材料和方法
材料 (1) 30例石蜡包埋胆管癌组织为本院病理科存档的1984～1996年外科 手术切除标本；(2) 30例胆管癌患者，年龄30～75岁，平均58.4岁；男∶女为2∶1(20∶10 )。30例患者中19例有周围组织浸润(指侵及肝脏、门静脉、神经、胰腺)，16例伴局部淋巴 结转移；1例鳞癌，29例腺癌；17例高分化癌，13例中、低分化癌；病变部位在胆管上段14例，中段7例，下段9例。临床分期(Ⅰ期指肿瘤局限在胆管内；Ⅱ期指肿瘤侵及肝脏或周围组织；Ⅲ期指有局部淋巴结转移)：Ⅰ期7例，Ⅱ期7例，Ⅲ期16例；(3) 以人乳腺癌石蜡包埋切片作为P53、ki-67免疫组化染色的阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。人乳腺癌组织切片作为p53原位杂交阳性对照，正常肝脏组织切片作为p53原位杂交阴性对照；(4) 30 例胆管癌的病理组织学分型：据WHO标准，分为腺癌和鳞癌；根据分化程度分为高分化、中分化和低分化癌；根据有无周围组织浸润(仅指侵及肝脏、门静脉、神经)分为有和无两组 ；根据有无局部淋巴结转移分为有和无两组；根据肿瘤发生部位分为高、中、低三组；(5) p53 cDNA购自军事医学科学院，p53 cDNA探针的制备按文献[1]方法进行；(6) 限制性内 切 酶XbaⅠ购于中国协和医科大学基础医学研究所；(7) 地高辛精标记及检测试剂盒为Boehrin ger Mannheim公司产品；(8) 抗P53蛋白，抗ki-67蛋白单克隆抗体为北京中山生物技术公司产品；(9) S-P免疫染色试剂盒(SP9000)为美国ZYMED公司产品。
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原位杂交(ISH) (1) 杂交用探针的制备：质粒DNA酶切和酶切片段的回收按常规方法进行，其中质粒酶切片 段的回收用低熔点琼脂糖凝胶电泳法，p53 cDNA用随机引物法标记，标记探针的回收按常规 方法进行；(2) 载玻片和盖玻片的处理、组织切片的制作及组织原位杂交方法：按文献[2 ，3]进行。
免疫组织化学(IHC)染色 常规行免疫组化染色，以微波加热修复抗原(ki-67染色用高温高压法，组织切片置citrate buffer(pH6.0)溶液中，于高压锅中加热，126℃，0.142 MPa，维持1 min，停止加热， 冷水降压后取出，置于PBS中)。
ki-67增殖指数计算方法 随机选取5个视野，每个视野计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分数 即增殖指数。
统计学方法 用χ2检验进行统计学分析。
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结果
原位杂交检测p53基因在胆管癌中的表达 30例胆管癌组织中，14例p53基因呈阳性表达，阳性率为46.7%；而癌旁组织有12例(40%)p53基因呈阳性表达。p53基因表达阳性者，胞浆及胞核内可见紫蓝色浓缩的斑点或弥散的颗粒(图1)。将p53基因检测结果与临床病理资料相对照，发现p53基因表达阳性率与患者性别、年龄、分化程度、临床分期、部位、有无周围组织浸润、浸润深度、有无淋巴结转移、预后均无明显关系(P>0.05)。
图1 原位杂交检测p53基因在胆管癌细胞中的表达
Fig 1 p53 gene expression with in situ hybridization in cholangiocarcinoma
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Arrows point to the positive cells with purple-blue nucleus ×200
免疫组化方法检测P53、ki-67蛋白在胆管癌中的表达
P53蛋白表达免疫组化检测结果：乳腺癌阳性对照组织切片细胞核内可见阳性的棕黄色颗粒；30例 胆管癌组织中16例P53蛋白呈阳性表达，细胞核内亦可见棕黄色颗粒；阴性对照未见P53蛋白 表达(图2)。
图2 免疫组化检测p53蛋白胆管癌中的表达
Fig 2 p53 protein expression with immunohistochemistry in cholangiocarcinoma
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Arrows point to the positive cells with brown-yellow nucleus ×200
P53蛋白表达阳性与临床病理资料的关系：P53蛋白表达与临床分期、淋巴结转移、生存期长短有关(P<0.05)(表1)。
表 1 P53蛋白表达与胆管癌临床病理资料之间的关系
Table 1 Relation between expression of P53 protein and the clinical pathological data of cholangiocarcinoma
Cases
No.of P53 protein expression
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P value
Clinical stage
Ⅰ
7
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Ⅱ
7
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<0.05
Ⅲ
16
12
Lymph node metastasis
, 百拇医药
Yes
16
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No
14
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Survival time
<16 months
10
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<0.05
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2
ki-67蛋白表达的免疫组化检测结果：30例胆管癌组织中29例ki-67蛋白表达阳性，阳性率 96.7%。其增殖指数为4.6%～65.8%，平均30.76%(以中位数将其分为两组：小于30%组和 大于30%组)(图3)。
图3 免疫组化检测 ki-67蛋白胆管癌中的表达
Fig 3 ki-67 protein expression with immunohistochemistry in cholangiocarcinoma
Arrows point to the positive cells with brown-yellow nucleus
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ki-67蛋白表达与临床病理资料的关系：χ2检验结果表明，ki-67蛋白表达与年龄、性别 、肿瘤部位、浸润深度、有无周围组织浸润无关。但ki-67蛋白表达与肿瘤分化程度、局部淋巴 结转移、临床分期、生存期均明显有关(表2)。
表 2 ki-67蛋白表达与胆管癌临床病理资料之间的关系
Table 2 Relation between ki-67 expression and the clinical pathological data of cholang iocarcinoma
Cases
ki-67 index
P value
<30%
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>30%
Degree of differentiation
Well
17
12
3
<0.01
Moderate(including poor)
13
3
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Clinical stage
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Ⅰ
7
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Ⅱ
7
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Ⅲ
16
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Lymph node metastasis
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Yes
16
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No
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Survival time
<16 months
10
2
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8
<0.05
>16 months
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p53基因表达与P53蛋白表达与ki-67增殖指数的关系
P53蛋白免疫组化结果与ki-67增殖指数的关系：ki-67增殖指数大于30%的15例胆管癌组织 中，12例P53蛋白表达阳性；而ki-67增殖指数小于30%的15例胆管癌组织中，仅4例P53蛋白 表达阳性。P53蛋白表达阳性组，其ki-67增殖指数明显高于无P53蛋白表达阳性组(P<0 .01)。
p53基因杂交结果与ki-67增殖指数的关系：ki-67增殖指数小于30%的15例胆管癌组织中，10例p53基因表达阳性；而ki-67增殖指数大于30%的15例胆管癌组织中，只有4例有p53基因表达阳性。p53基因表达阳性组的肿瘤ki-67增殖指数明显低于p53基因表达阴性组(P<0 .05)，即p53基因表达阳性的病例肿瘤细胞增殖活性低。 讨论
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野生型p53基因突变后，细胞易出现恶性表型。免疫组化检测的主要是突变型p53基因表达产物[4]。p53基因原位杂交阳性信号可位于肿瘤细胞核及细胞浆内。本实验结果显示细胞核内p53基因原位杂交信号强于细胞浆，这可能是由于常规石蜡切片使细胞浆内mRNA较易降解的缘故。ki-67作为增生相关性抗原于1983年首次被鉴定。 ki-67蛋白的合成开始于G1期，在细胞不同周期，ki-67的表达情况不同，从而决定细胞进入不同分化阶段。免疫组化方法检 测ki-67抗原表达研究表明，在淋巴瘤、乳腺癌、肾癌等组织中均可见ki-67基因产物的过度表达[5]。本实验结果显示96.7%的肿瘤组织呈ki-67蛋白阳性表达。但未见ki-67 增殖指数与患者年龄、性别、肿瘤部位有关，这与Gaspurini等[8]研究结果一致。本研究结果还显示高分化肿瘤ki-67增殖指数均小于30%，而中、低分化的肿瘤ki-67增殖 指数大于30%(P<0.05)，提示分化程度越低，细胞增殖活性越高。而且ki-67增殖指 数亦与局部淋巴结转移及临床分期有关。69%有局部淋巴结转移的肿瘤，增殖指数均大于30% ；而71%无淋巴结转移的肿瘤，增殖指数均小于30%(P<0.05)。临床Ⅲ期患者ki- 67增 殖指数亦明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)。此外，80%增殖指数大于30%的患者，生存期均短于16个月；而73%增殖指数小于30%的患者，生存期均大于16个月，两者相比差异有显著性意义(P<0.05)，这与Rijken等[7]的研究结果一致。综上，胆管癌组织中ki-67蛋白的表达不仅能客观地反映胆管癌组织的增殖活性，并能提示胆管癌局部转移的危险性，还可通过对增殖指数的分析对患者的预后作出预测。
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分析P53蛋白阳性表达与ki-67增殖指数的关系显示有P53蛋白阳性表达的肿瘤组织ki-67增 殖指数多大于30%，无P53蛋白阳性表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多小于30%。这可能是因 为p53突变导致p53基因功能丧失，从而失去抑制肿瘤细胞生长的功能，细胞呈恶性增长，生 长活跃，使肿瘤的增殖活性升高。同样将p53原位杂交检测结果与ki-67增殖指数做一比较 ，可以看到有p53基因表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多小于30%，无p53基因表达的肿瘤组织ki-67增殖指数多大于30%，由于原位杂交检测的主要是野生型p53基因，有p53基因表达说明肿瘤组织中p53基因在抑制肿瘤细胞生长方面起到一定作用，肿瘤细胞的增殖活性相应较低，故ki-67增殖指数较低。从本实验结果也可以看出有p53基因突变，则胆管癌局部淋 巴结转移发生率较高，临床分期较晚，而且生存期相对较短，这与ki-67的检测结果相符，Arora等[8]也得出相同的结论。综合P53蛋白免疫组化与p53基因原位杂交检测结 果与ki-67增殖指数的关系，可以看出ki-67增殖指数和p53基因表达在检测胆管癌细胞的 增殖活跃程度上是一致的，将两者结合起来判断胆管癌细胞的生长活性以及胆管癌患者的预 后可以提高检测的敏感性和准确性。
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(本文图1～3见插图第2页)
基金项目：国家杰出青年基金(39625012) Supported by the National Natural Sciences
Foundation of China(39625012)；
作者简介：陈杰 Department o f Pathology,PUMC Hospital,CAMS and PUMC;
王欣 Corresponding author Tel:010-65296002,Fax:010-65256546,E-mail:wx314@263.net
作者单位：王欣(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
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张建希(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
陈杰(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院基本外科，北京 100730)
参考文献：
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