大鼠移植心脏的细胞凋亡及其与急性排斥反应的关系
钟红兴 韩辉 章咏裳
摘 要 目的 观察移植心脏的细胞凋亡现象及其与急性排斥反应的关系。方法 建立大鼠异位心脏移植模型，用HE染色和原位末端标记(TUNEL)技术检测移植心脏切片，进行排斥反应的病理分级，计算凋亡指数(AI)。 结果 发生凋亡的细胞主要是心肌细胞，在各级排斥反应中均可见凋亡细胞存在，且AI与急性排斥反应的分级成正相关；各级的AI与0级(无排斥反应)比较，差异均有显著性。结论 细胞凋亡与移植心脏急性排斥反应的严重程度显著相关，凋亡指数可作为判断移植物损伤程度的指标，对急性排斥反应的诊断有一定参考价值。
关键词：脱噬作用 心脏移植 移植物排斥 原位缺口末端标记
细胞凋亡是近20年来生命科学领域中最重要的进展之一，细胞凋亡的研究具有普遍的生物学意义，也是器官移植领域的一个重要课题[1，2]。我们通过大鼠心脏移植模型，用原位末端标记(TUNEL)技术[3]检测排斥反应时的细胞凋亡情况，现报告如下。
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材料与方法
一、 大鼠心脏移植及取材
1. 动物：采用健康清洁级、近交系封闭群Wistar大鼠96只，SD大鼠32只，均系雄性，体重200～280g，购自同济医科大学实验动物中心。
2. 实验分组： (1)同基因移植组：将Wistar大鼠的心脏移植给Wistar大鼠；(2)异基因移植组：将SD大鼠的心脏移植给Wistar大鼠。根据移植后观察时间的不同，上述两组又各分为4个亚组，即1d、3d、5d和7d亚组，每个亚组8只大鼠。
3. 移植方法：按照陈忠华等[4]报道的术式进行腹部异位心脏移植，供心肺动脉与受者的下腔静脉端侧吻合，供心主动脉与受者的腹主动脉端侧吻合。术后正常饲养，不给任何免疫抑制剂，并每天进行腹部触诊，观察移植心的搏动情况，心跳停止为排斥反应终点。
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4. 取材：术后各组按预定观察时间处死动物，切取移植心左室壁组织，用质量浓度为100g/L的中性甲醛固定，常规石腊包埋，切片备用。
二、急性排斥反应的诊断
每例切片均取一张行HE染色，显微镜观察，根据Stanford标准[5]进行病理学诊断和分级：0级为无排斥，心肌组织正常，间质内无炎性细胞浸润；1A级有局灶性血管外周及心肌间质内炎性细胞浸润，未见坏死；1B级有弥漫性但轻微的炎性细胞浸润，未见坏死；2级表现为单灶性侵袭性炎性细胞浸润，并伴有小灶状心肌损害；3A级为多灶性炎性细胞浸润，并伴有心肌损害；3B级为弥漫性炎性细胞浸润，合并心肌坏死；4级表现为弥漫性多类型细胞浸润，伴有明显的水肿、出血和心肌坏死。
三、细胞凋亡的检测
采用细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Apoptosis Detection KitⅠ，购自武汉博士德公司)检测，其中主要试剂来源：末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)为美国Promega公司产品；地高辛标记的三磷酸脱氧尿苷(DIG-dUTP)为德国Bochringer Mannheim公司产品；蛋白酶K、生物素标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)为美国Sigma公司产品。每例切片均取一张常规脱蜡入水，用新鲜配制的体积分数为3% H2O2处理，蒸馏水洗涤；加以Tris缓冲盐水(TBS)1∶100新鲜稀释的蛋白酶K，37℃ 10min，蒸馏水洗；加含TdT和DIG-dUTP的标记缓冲液20μl，37℃ 2h，TBS洗涤；加封闭液50μl, 室温30min，甩干；加以封闭液1∶100稀释的Anti-DIG-Biotin 50μl, 37℃ 30min，TBS洗；加以TBS 1∶100稀释的链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，37℃ 30min，TBS洗；然后用3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)显色20min，蒸馏水洗；苏木素复染，TBS洗；脱水，透明，封片。将切片置显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞，每例切片10个随机200倍视野中的凋亡细胞平均数即为其凋亡指数(AI)[6]。
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四、统计学分析
在微型计算机上用SPSS软件包(9.0版)进行统计学处理，所得数据以均数±标准差表示，急性排斥反应的组织学分级采用t检验，AI采用F检验，当P值小于0.05时差异具有显著性。
结 果
一、 各组大鼠的术后情况
全部受者均于术后0.5～2h内苏醒，一般1～3h后可进水进食，精神状态逐日好转，活动增加。发生排斥反应时精神食欲变差，懒动，体毛疏松，易脱落。实验期内所有受者的移植心存活良好，无停搏发生。
二、移植心的病理变化及分级
两组的分级比较见表1。
表1 术后不同时间移植心急性排斥的组织学分级
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组 别
n
组 织 学 分 级
每只受者的分级
X±s
异基因移植组
第1d亚组
8
0，0，0，0，0，0，1A，1A
0.13±0.23*
第3d亚组
8
, 百拇医药
0，0，0，1A，1A，1A，1A，1B
0.38±0.35*
第5d亚组
8
2，2，2，2，2，3A，3A，3B
2.25±0.38△
第7d亚组
8
3A，3B，3B，3B，4，4，4，4
3.44±0.62△
同基因移植组
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第1d亚组
8
0，0，0，0，0，0，0，0
0.00±0.00
第3d亚组
8
0，0，0，0，0，0，1A，1A
0.13±0.23
第5d亚组
8
0，0，0，0，0，0，0，0
0.00±0.00
, 百拇医药
第7d亚组
8
0，0，0，0，0，0，0，1B
0.13±0.35
注：同一时间异基因移植组与同基因移植组比较：* P>0.05；△ P<0.01
三、急性排斥反应与细胞凋亡的关系
将同一组织的HE切片和TUNEL切片对照观察，发现各级排斥反应中均可见细胞凋亡的存在，其AI与分级成正相关(见表2)。凋亡的细胞主要是心肌细胞，少数为浸润的淋巴细胞和内皮细胞。
表2 移植心急性排斥分级与AI的关系
, 百拇医药 组织学分级
n
AI
0
38
0.29±0.32
1
10
5.84±2.13*
2
5
8.02±2.80*
3
, 百拇医药
7
10.59±3.91*
4
4
11.18±4.31*
注：* 与0级比较，P<0.01
讨 论
细胞凋亡的概念由Kerr等于1972年首次提出, 意即细胞死亡时就象树叶或花瓣凋落一样，属于形态学的描述，以区别于细胞坏死。细胞凋亡是细胞程序死亡的一种特殊形式，是生物体内广泛存在的一种由特定基因控制的主动的细胞自杀，它参与调节机体内许多生理及病理过程。90年代以来，随着分子生物学技术的迅速发展，人们开始重视这种不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式，认识到细胞凋亡的实际意义，从而形成了许多有关细胞凋亡研究的新热点[1,2]。
, 百拇医药
细胞凋亡最主要的生化特征是细胞内源性核酸内切酶被激活，引起细胞自身核小体间DNA链的断裂，产生180～200bp或其倍数的双链DNA片段。TUNEL技术是将生物素标记的dUTP底物接合于与DNA断点相同的3'-OH末端，经过标记信号的放大、显色和衬染，可在光镜下单细胞水平上直接观察到DNA的断裂，结构完好和清晰地原位显示凋亡细胞[3]。该法操作简单、快速，灵敏度高，特异性亦较强，尤其适合于形态学改变尚不明显的早期凋亡细胞的检出，可用于细胞凋亡的定性、定位研究和计数，是一种较好的细胞凋亡研究方法[7]。
心脏异位移植以心脏搏动作为脏器存活的标志，能敏锐地、准确地反映移植后器官的变化情况，在移植免疫、抗排斥药物筛选等研究方面有着重要作用。Stanford标准是诊断心脏移植排斥反应及分级的标准，从本研究结果可以看出，同基因移植组未发生明显的排斥反应，而异基因移植组排斥反应显著，尤其是第5d和第7d两组。目前有较多的研究证实细胞凋亡是肝移植排斥反应中组织损伤的重要机制[8]。我们在研究中也发现，在各级排斥反应中均可见细胞凋亡的存在，并且与排斥反应的严重程度成正相关，提示细胞凋亡亦是大鼠心脏移植急性排斥反应中组织损伤的重要机制，细胞凋亡指数可作为判断移植物损伤程度的指标，对急性排斥反应的诊断有一定的参考价值。在器官移植急性排斥反应中，介导移植物损伤的效应细胞主要是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其作用机理主要包括Fas/FasL(TNF/TNFR)系统和颗粒酶/穿孔素系统，它们均有可能激活细胞内某些程序而诱导靶细胞的凋亡[1,2]。
, 百拇医药
本研究中可见，移植心未发生排斥反应(分级为0)时组织切片中仍可见少量凋亡细胞，AI为0.29±0.32，这可能与移植心的冷保存和缺血-再灌注有关。近年来，越来越多的研究证明细胞凋亡与冷保存和缺血-再灌注损伤密切相关[9,10]，其发生机制尚未阐明，很可能是组织缺血-再灌注时细胞内产生氧自由基以及细胞内钙超载等因素诱致细胞凋亡的发生。
本研究亦提示，预防心肌细胞的凋亡能减少移植物损伤，而延长其存活时间，相反，促进移植物中特异性的淋巴细胞凋亡则有利于诱导针对移植物的免疫耐受。随着细胞凋亡与移植免疫关系的不断阐明，这些策略将有可能成为抗排斥治疗的新手段。
作者单位：钟红兴(510632 广州，暨南大学医学院第一附属医院泌尿外科)
韩辉(同济医科大学附属同济医院泌尿外科)
章咏裳(同济医科大学附属同济医院泌尿外科)
, 百拇医药
参考文献
[1]Kabelitz D.Apoptosis, graft rejection,and transplantation tolerance.Transplantation, 1998, 65:869-875.
[2]Woodle ES, Kulkarni S. Programmed cell death. Transplantation, 1998,66:681-691.
[3]Gavrieli Y, Sherman Y, Ben Sassion SA, et al. Identification of programmed cell death in situ fragmentation. J Cell Biol, 1992,119:493-501.
[4]陈忠华，何藕聪，钟妙英. 改进的同种大白鼠异位心脏移植术. 中华器官移植杂志, 1982,3:38-41.
, 百拇医药
[5]Billigham ME, Cary NRB, Hamond EH, et al. A working formulation for the heart rejection study group. J Heart Transplant, 1990,9:587-593.
[6]Matsuno T, Sasaki H, Nakagawa K, et al. Fas antigen express and apoptosis in kidney allografts. Transplant Proc, 1997,29:177-178.
[7]郑俊年.细胞凋亡检测方法研究进展.国外医学临床生物化学与检验学分册，1999,3:124-126.
[8]Krams SM, Martinez OM. Apoptosis as a mechanism of tissue injury in live allograft rejection. Semin Liver Dis, 1998,18:153-167.
[9]Trieb K, Eberl T, Steger M, et al. Apoptosis is involved in endothelial cell damage during preservation and influenced by organ storage solutions. Transplant Proc, 1997,29:416-421.
[10]Fliss H, Gaottinger D. Apoptosis in ischemia and reperfusion rat myocardium. Circ Res, 1996,79:949-954., http://www.100md.com
摘 要 目的 观察移植心脏的细胞凋亡现象及其与急性排斥反应的关系。方法 建立大鼠异位心脏移植模型，用HE染色和原位末端标记(TUNEL)技术检测移植心脏切片，进行排斥反应的病理分级，计算凋亡指数(AI)。 结果 发生凋亡的细胞主要是心肌细胞，在各级排斥反应中均可见凋亡细胞存在，且AI与急性排斥反应的分级成正相关；各级的AI与0级(无排斥反应)比较，差异均有显著性。结论 细胞凋亡与移植心脏急性排斥反应的严重程度显著相关，凋亡指数可作为判断移植物损伤程度的指标，对急性排斥反应的诊断有一定参考价值。
关键词：脱噬作用 心脏移植 移植物排斥 原位缺口末端标记
细胞凋亡是近20年来生命科学领域中最重要的进展之一，细胞凋亡的研究具有普遍的生物学意义，也是器官移植领域的一个重要课题[1，2]。我们通过大鼠心脏移植模型，用原位末端标记(TUNEL)技术[3]检测排斥反应时的细胞凋亡情况，现报告如下。
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材料与方法
一、 大鼠心脏移植及取材
1. 动物：采用健康清洁级、近交系封闭群Wistar大鼠96只，SD大鼠32只，均系雄性，体重200～280g，购自同济医科大学实验动物中心。
2. 实验分组： (1)同基因移植组：将Wistar大鼠的心脏移植给Wistar大鼠；(2)异基因移植组：将SD大鼠的心脏移植给Wistar大鼠。根据移植后观察时间的不同，上述两组又各分为4个亚组，即1d、3d、5d和7d亚组，每个亚组8只大鼠。
3. 移植方法：按照陈忠华等[4]报道的术式进行腹部异位心脏移植，供心肺动脉与受者的下腔静脉端侧吻合，供心主动脉与受者的腹主动脉端侧吻合。术后正常饲养，不给任何免疫抑制剂，并每天进行腹部触诊，观察移植心的搏动情况，心跳停止为排斥反应终点。
, http://www.100md.com
4. 取材：术后各组按预定观察时间处死动物，切取移植心左室壁组织，用质量浓度为100g/L的中性甲醛固定，常规石腊包埋，切片备用。
二、急性排斥反应的诊断
每例切片均取一张行HE染色，显微镜观察，根据Stanford标准[5]进行病理学诊断和分级：0级为无排斥，心肌组织正常，间质内无炎性细胞浸润；1A级有局灶性血管外周及心肌间质内炎性细胞浸润，未见坏死；1B级有弥漫性但轻微的炎性细胞浸润，未见坏死；2级表现为单灶性侵袭性炎性细胞浸润，并伴有小灶状心肌损害；3A级为多灶性炎性细胞浸润，并伴有心肌损害；3B级为弥漫性炎性细胞浸润，合并心肌坏死；4级表现为弥漫性多类型细胞浸润，伴有明显的水肿、出血和心肌坏死。
三、细胞凋亡的检测
采用细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Apoptosis Detection KitⅠ，购自武汉博士德公司)检测，其中主要试剂来源：末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)为美国Promega公司产品；地高辛标记的三磷酸脱氧尿苷(DIG-dUTP)为德国Bochringer Mannheim公司产品；蛋白酶K、生物素标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)为美国Sigma公司产品。每例切片均取一张常规脱蜡入水，用新鲜配制的体积分数为3% H2O2处理，蒸馏水洗涤；加以Tris缓冲盐水(TBS)1∶100新鲜稀释的蛋白酶K，37℃ 10min，蒸馏水洗；加含TdT和DIG-dUTP的标记缓冲液20μl，37℃ 2h，TBS洗涤；加封闭液50μl, 室温30min，甩干；加以封闭液1∶100稀释的Anti-DIG-Biotin 50μl, 37℃ 30min，TBS洗；加以TBS 1∶100稀释的链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，37℃ 30min，TBS洗；然后用3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)显色20min，蒸馏水洗；苏木素复染，TBS洗；脱水，透明，封片。将切片置显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞，每例切片10个随机200倍视野中的凋亡细胞平均数即为其凋亡指数(AI)[6]。
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四、统计学分析
在微型计算机上用SPSS软件包(9.0版)进行统计学处理，所得数据以均数±标准差表示，急性排斥反应的组织学分级采用t检验，AI采用F检验，当P值小于0.05时差异具有显著性。
结 果
一、 各组大鼠的术后情况
全部受者均于术后0.5～2h内苏醒，一般1～3h后可进水进食，精神状态逐日好转，活动增加。发生排斥反应时精神食欲变差，懒动，体毛疏松，易脱落。实验期内所有受者的移植心存活良好，无停搏发生。
二、移植心的病理变化及分级
两组的分级比较见表1。
表1 术后不同时间移植心急性排斥的组织学分级
, 百拇医药
组 别
n
组 织 学 分 级
每只受者的分级
X±s
异基因移植组
第1d亚组
8
0，0，0，0，0，0，1A，1A
0.13±0.23*
第3d亚组
8
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0，0，0，1A，1A，1A，1A，1B
0.38±0.35*
第5d亚组
8
2，2，2，2，2，3A，3A，3B
2.25±0.38△
第7d亚组
8
3A，3B，3B，3B，4，4，4，4
3.44±0.62△
同基因移植组
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第1d亚组
8
0，0，0，0，0，0，0，0
0.00±0.00
第3d亚组
8
0，0，0，0，0，0，1A，1A
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第5d亚组
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第7d亚组
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0，0，0，0，0，0，0，1B
0.13±0.35
注：同一时间异基因移植组与同基因移植组比较：* P>0.05；△ P<0.01
三、急性排斥反应与细胞凋亡的关系
将同一组织的HE切片和TUNEL切片对照观察，发现各级排斥反应中均可见细胞凋亡的存在，其AI与分级成正相关(见表2)。凋亡的细胞主要是心肌细胞，少数为浸润的淋巴细胞和内皮细胞。
表2 移植心急性排斥分级与AI的关系
, 百拇医药 组织学分级
n
AI
0
38
0.29±0.32
1
10
5.84±2.13*
2
5
8.02±2.80*
3
, 百拇医药
7
10.59±3.91*
4
4
11.18±4.31*
注：* 与0级比较，P<0.01
讨 论
细胞凋亡的概念由Kerr等于1972年首次提出, 意即细胞死亡时就象树叶或花瓣凋落一样，属于形态学的描述，以区别于细胞坏死。细胞凋亡是细胞程序死亡的一种特殊形式，是生物体内广泛存在的一种由特定基因控制的主动的细胞自杀，它参与调节机体内许多生理及病理过程。90年代以来，随着分子生物学技术的迅速发展，人们开始重视这种不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式，认识到细胞凋亡的实际意义，从而形成了许多有关细胞凋亡研究的新热点[1,2]。
, 百拇医药
细胞凋亡最主要的生化特征是细胞内源性核酸内切酶被激活，引起细胞自身核小体间DNA链的断裂，产生180～200bp或其倍数的双链DNA片段。TUNEL技术是将生物素标记的dUTP底物接合于与DNA断点相同的3'-OH末端，经过标记信号的放大、显色和衬染，可在光镜下单细胞水平上直接观察到DNA的断裂，结构完好和清晰地原位显示凋亡细胞[3]。该法操作简单、快速，灵敏度高，特异性亦较强，尤其适合于形态学改变尚不明显的早期凋亡细胞的检出，可用于细胞凋亡的定性、定位研究和计数，是一种较好的细胞凋亡研究方法[7]。
心脏异位移植以心脏搏动作为脏器存活的标志，能敏锐地、准确地反映移植后器官的变化情况，在移植免疫、抗排斥药物筛选等研究方面有着重要作用。Stanford标准是诊断心脏移植排斥反应及分级的标准，从本研究结果可以看出，同基因移植组未发生明显的排斥反应，而异基因移植组排斥反应显著，尤其是第5d和第7d两组。目前有较多的研究证实细胞凋亡是肝移植排斥反应中组织损伤的重要机制[8]。我们在研究中也发现，在各级排斥反应中均可见细胞凋亡的存在，并且与排斥反应的严重程度成正相关，提示细胞凋亡亦是大鼠心脏移植急性排斥反应中组织损伤的重要机制，细胞凋亡指数可作为判断移植物损伤程度的指标，对急性排斥反应的诊断有一定的参考价值。在器官移植急性排斥反应中，介导移植物损伤的效应细胞主要是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其作用机理主要包括Fas/FasL(TNF/TNFR)系统和颗粒酶/穿孔素系统，它们均有可能激活细胞内某些程序而诱导靶细胞的凋亡[1,2]。
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本研究中可见，移植心未发生排斥反应(分级为0)时组织切片中仍可见少量凋亡细胞，AI为0.29±0.32，这可能与移植心的冷保存和缺血-再灌注有关。近年来，越来越多的研究证明细胞凋亡与冷保存和缺血-再灌注损伤密切相关[9,10]，其发生机制尚未阐明，很可能是组织缺血-再灌注时细胞内产生氧自由基以及细胞内钙超载等因素诱致细胞凋亡的发生。
本研究亦提示，预防心肌细胞的凋亡能减少移植物损伤，而延长其存活时间，相反，促进移植物中特异性的淋巴细胞凋亡则有利于诱导针对移植物的免疫耐受。随着细胞凋亡与移植免疫关系的不断阐明，这些策略将有可能成为抗排斥治疗的新手段。
作者单位：钟红兴(510632 广州，暨南大学医学院第一附属医院泌尿外科)
韩辉(同济医科大学附属同济医院泌尿外科)
章咏裳(同济医科大学附属同济医院泌尿外科)
, 百拇医药
参考文献
[1]Kabelitz D.Apoptosis, graft rejection,and transplantation tolerance.Transplantation, 1998, 65:869-875.
[2]Woodle ES, Kulkarni S. Programmed cell death. Transplantation, 1998,66:681-691.
[3]Gavrieli Y, Sherman Y, Ben Sassion SA, et al. Identification of programmed cell death in situ fragmentation. J Cell Biol, 1992,119:493-501.
[4]陈忠华，何藕聪，钟妙英. 改进的同种大白鼠异位心脏移植术. 中华器官移植杂志, 1982,3:38-41.
, 百拇医药
[5]Billigham ME, Cary NRB, Hamond EH, et al. A working formulation for the heart rejection study group. J Heart Transplant, 1990,9:587-593.
[6]Matsuno T, Sasaki H, Nakagawa K, et al. Fas antigen express and apoptosis in kidney allografts. Transplant Proc, 1997,29:177-178.
[7]郑俊年.细胞凋亡检测方法研究进展.国外医学临床生物化学与检验学分册，1999,3:124-126.
[8]Krams SM, Martinez OM. Apoptosis as a mechanism of tissue injury in live allograft rejection. Semin Liver Dis, 1998,18:153-167.
[9]Trieb K, Eberl T, Steger M, et al. Apoptosis is involved in endothelial cell damage during preservation and influenced by organ storage solutions. Transplant Proc, 1997,29:416-421.
[10]Fliss H, Gaottinger D. Apoptosis in ischemia and reperfusion rat myocardium. Circ Res, 1996,79:949-954., http://www.100md.com