VEGF在膀胱癌细胞中的表达
王嵩 薛兆英 张智清 俞莉章 刘漓波 姚立红 陈爱君
摘 要 目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱肿瘤发生发展中的作用。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测三种人膀胱癌细胞系(BIU-87，T24，EJ)和正常膀胱组织中VEGF mRNA的表达，同时用免疫细胞化学方法检测三种人膀胱癌细胞系VEGF蛋白的表达。结果：三种膀胱癌细胞系均有VEGF mNRA的表达，正常膀胱组织无表达；免疫细胞化学检测显示，VEGF蛋白表达于三种细胞系，而以EJ和T24表达较强，BIU-87表达较弱。结论：VEGF在膀胱癌细胞系中的表达提示其可能在膀胱肿瘤的发生和发展中起重要作用，它可以刺激膀胱肿瘤的血管生成，促进肿瘤的生长。
关键词：膀胱肿瘤 癌 血管内皮生长因子
肿瘤相关的血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件，迄今已知有多种血管生成相关因子可刺激肿瘤血管生成，而血管内皮生长因子(VEGF)被认为是促进肿瘤血管生成的最主要的血管生长因子之一[1]。与大多数恶性肿瘤一样，膀胱癌的生长和转移依赖于血管生成[2]。本实验采用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测三种膀胱癌细胞株的VEGF mRNA和蛋白表达，探讨VEGF在膀胱肿瘤生长和发展中的作用。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞系及组织标本
三种膀胱癌细胞株(T24，EJ，BIU-87)取自本所免疫室，其中BIU-87细胞株为本所免疫室建系。用含16%FCS的RPMI-1640培养液常规方法进行细胞传代培养。当细胞生长状态稳定，呈对数生长期时，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化细胞，用培养液将消化下来的细胞重新悬浮，计数并调整到适当浓度后滴在预先经严格清洗并消毒的载玻片上，放入湿盒内37℃，5% CO2孵箱内恒温培养约4～5h，待细胞贴壁后将载玻片取出，PBS冲洗3次，冷丙酮固定10min后自然干燥，放入4℃冰箱内保存，3天内进行免疫细胞化学染色。1例正常膀胱组织新鲜标本，来源于膀胱癌膀胱全切之病人，标本离体后迅速置入液氮中保存。
二、RT-PCR检测VEGF mRNA的表达
根据VEGF cDNA序列设计引物：正向引物5′-TACATATGGCACCGATGGCAGAAGGAG-3′、反向引物为5′-TAGGATCCTATCACCGCCTCGGCTT
, 百拇医药
GTC-3′；另外，内参照β-actin正向引物为5′-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3′、反向引物为5′-GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。在15%FCA的RPMI-1640培养液中分别培养BIU-87、EJ和T24细胞至1×107/瓶，用RNA提取液Trizol提取细胞中总RNA。正常组织标本从液氮中取出后，立即在冰上破碎，取1g组织，用Trizolv提取液提取总RNA，行RT-PCR，扩增条件为94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，35个循环后，72℃继续反应10min。同时扩增β-actin作为内参照，并设不加逆转录产物的PCR体系为阴性对照。最后用1.7%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
三、免疫细胞化学检测试剂与方法
免疫细胞化学所用鼠抗人VEGF单克隆抗体由中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室提供。生物素标记的羊抗鼠IgG和辣根酶标记链霉卵白素工作液为北京中山生物技术公司产品。所有标本均在同一条件下采用过氧化酶标记链霉卵白素染色法(SP法)进行免疫细胞化学染色，一抗稀释度为1∶100，并用PBS代替一抗为阴性对照。用经病理确诊为肾细胞癌的病理切片作阳性对照。结果判定：细胞浆出现棕黄色染色为阳性细胞，阳性显色者按细胞浆着色强度分为强、中、弱三个级别。
, 百拇医药
结 果
一、VEGF mRNA在膀胱癌细胞株的表达
RT-PCR产物电泳结果图像见图1，三种膀胱癌细胞株均可见516bp的VEGF mRNA扩增产物，为不含信号肽序列的VEGF165。正常膀胱组织无VEGF mRNA表达。β-actin作为内参照基因，在三种膀胱癌细胞株和正常膀胱组织均有表达，扩增片段为310bp。阴性对照组则无任何扩增条带出现。
图1 VEGF mRAN RT-PCR产物电泳结果
1.DL2000核酸分子量标准；2.阴性对照；3.正常膀胱组织；4.BIU-87细胞；5.24细胞；6.EJ细胞
二、VEGF蛋白在三种膀胱癌细胞株的表达
, 百拇医药 三种膀胱癌细胞株VEGF蛋白表达均呈阳性，着色部位主要分布在细胞浆。 三种膀胱癌细胞株中，以EJ细胞株染色最强，T24细胞株染色属中等强度，BIU-87细胞株VEGF蛋白表达较弱。
讨 论
肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成，抑制肿瘤血管生成是近年来肿瘤治疗的一个重要方向。血管基底膜及其周围细胞外基质的降解、血管内皮细胞的增殖、迁移和重组形成血管网，是肿瘤血管生成的重要环节。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，通过分布于内皮细胞表面、具有酪氨激酶活性的二种受体FLT-1和KDR发挥生物学作用。因其亦可增加微血管通透性，又称血管通透因子(VPF)[3]。
VEGF高表达于多种恶性肿瘤组织和体外培养的肿瘤细胞系，包括乳癌、神经胶质瘤、肾癌和卵巢癌等。但目前对肿瘤组织中VEGF的来源尚有争议。Takahashi等[4]证明VEGF主要存在于肿瘤细胞，可促使肿瘤的血管生成，并与其它血管生成相关因子之间有协同作用。Freeman等[5]则发现VEGF可由肿瘤浸润淋巴细胞表达。而Plate等[6]认为VEGF可由肿瘤血管内皮细胞表达，而正常组织中的内皮细胞没有表达。本实验从膀胱癌细胞株T24、BIU-87、EJ中均扩增出VEGF的PCR产物，说明在三种膀胱癌的细胞株中有VEGF的mRNA表达，这与Takahashi等[4]的结果一致。明确膀胱肿瘤中VEGF的来源，能够从细胞水平和基因水平上阻断VEGF的表达，从而抑制膀胱肿瘤的血管生成。
, 百拇医药
由于编码VEGF mRNA剪接方式不同，VEGF的mRNA有四种形式，分别编码含121、165、189和206个氨基酸的成熟蛋白，其中VEGF165是血管内皮生长因子生物学活性的主要存在形式，以可溶性方式分泌。VEGF121也以可溶性方式分泌，另外两种VEGF以细胞表面蛋白多糖的形式存在[7]。本实验从膀胱癌细胞系BIU-87、T24和EJ中扩增出VEGF165的PCR底物，提示VEGF165是人膀胱肿瘤中血管内皮生长因子的主要存在形式，并可能与膀胱肿瘤的血管生成有关。
本实验应用免疫细胞化学方法检测到膀胱癌细胞株BIU-87，T24和EJ均可表达VEGF蛋白，但表达强度不同。这三种细胞系来源于不同的膀胱恶性肿瘤，在生物学特性上是不同的，在一定程度上也反映了膀胱肿瘤的不均质性。O'Brien等[8]认为VEGF的表达是膀胱肿瘤的恶性表型之一，它在不同病理类型的膀胱肿瘤中表达不同，并证明VEGF的表达增加与膀胱肿瘤的复发密切相关。我们对三种膀胱癌细胞株VEGF蛋白表达检测结果进一步支持了O'Brien的观点。
, 百拇医药
进一步明确VEGF表达的调控机制将有助于控制肿瘤相关的血管生成[9]。以VEGF及其基因为靶分子，抑制其表达及活性，使肿瘤生长减缓甚至消失，将成为肿瘤治疗的一个有前途的方向。
作者单位：王 嵩(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
薛兆英(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
俞莉章(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
刘漓波(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
张智清(病毒基因工程国家重点实验室)
姚立红(病毒基因工程国家重点实验室)
, 百拇医药
陈爱君(病毒基因工程国家重点实验室)
参考文献
[1]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor.European J Cancer,1996,32A∶2413-2422.
[2]Campbell SC,Volpert OV,Ivanovich M,et al.Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer.Cancer Res,1998,58∶1298-1304.
[3]Keck PJ,Hauser SD,Krivi G,et al.Vascular permeability factor,an endothelial cell mitogen related to PDGF.Science,1989,246∶1309-1312.
, 百拇医药
[4]Takahashi A,Sasaki H,Kim SJ,et al.Markedly increased amounts of messenger RNAs for vascular endothelial growth factor and placenta growth factor in renal cell carcinoma associated with angiogenesis.Cancer Res,1994,54∶4233-4237.
[5]Freeman MR,Schneck FX,Gagnon ML,et al.Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancer express vascular endothelial growth factor:a potential role for T cells in angiogenesis.Cancer Res,1995,55∶4140-4145.
, 百拇医药
[6]Plate HK,Breier G,Weich HA,et al.Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo.Nature,1992,359∶845-848.
[7]Dvorak FH,Brown FL,Detmar M,et al.Vascular permeability factor/Vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability and angiogenesis.Am J Pathol.1995,146∶1029-1039.
[8]O'Brien T,Cranston D,Fuggle S,et al.Differental angiogenesis pathways characterize supperficial and invasive bladder cancer.Cancer Res,1995,55∶510-513.
[9]Claffey KP,Robison GS.Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells:consequences for tumor growth and metastasis.Cancer Metastasis Rev,1996,15∶165-176., http://www.100md.com
摘 要 目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱肿瘤发生发展中的作用。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测三种人膀胱癌细胞系(BIU-87，T24，EJ)和正常膀胱组织中VEGF mRNA的表达，同时用免疫细胞化学方法检测三种人膀胱癌细胞系VEGF蛋白的表达。结果：三种膀胱癌细胞系均有VEGF mNRA的表达，正常膀胱组织无表达；免疫细胞化学检测显示，VEGF蛋白表达于三种细胞系，而以EJ和T24表达较强，BIU-87表达较弱。结论：VEGF在膀胱癌细胞系中的表达提示其可能在膀胱肿瘤的发生和发展中起重要作用，它可以刺激膀胱肿瘤的血管生成，促进肿瘤的生长。
关键词：膀胱肿瘤 癌 血管内皮生长因子
肿瘤相关的血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件，迄今已知有多种血管生成相关因子可刺激肿瘤血管生成，而血管内皮生长因子(VEGF)被认为是促进肿瘤血管生成的最主要的血管生长因子之一[1]。与大多数恶性肿瘤一样，膀胱癌的生长和转移依赖于血管生成[2]。本实验采用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测三种膀胱癌细胞株的VEGF mRNA和蛋白表达，探讨VEGF在膀胱肿瘤生长和发展中的作用。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞系及组织标本
三种膀胱癌细胞株(T24，EJ，BIU-87)取自本所免疫室，其中BIU-87细胞株为本所免疫室建系。用含16%FCS的RPMI-1640培养液常规方法进行细胞传代培养。当细胞生长状态稳定，呈对数生长期时，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化细胞，用培养液将消化下来的细胞重新悬浮，计数并调整到适当浓度后滴在预先经严格清洗并消毒的载玻片上，放入湿盒内37℃，5% CO2孵箱内恒温培养约4～5h，待细胞贴壁后将载玻片取出，PBS冲洗3次，冷丙酮固定10min后自然干燥，放入4℃冰箱内保存，3天内进行免疫细胞化学染色。1例正常膀胱组织新鲜标本，来源于膀胱癌膀胱全切之病人，标本离体后迅速置入液氮中保存。
二、RT-PCR检测VEGF mRNA的表达
根据VEGF cDNA序列设计引物：正向引物5′-TACATATGGCACCGATGGCAGAAGGAG-3′、反向引物为5′-TAGGATCCTATCACCGCCTCGGCTT
, 百拇医药
GTC-3′；另外，内参照β-actin正向引物为5′-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3′、反向引物为5′-GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。在15%FCA的RPMI-1640培养液中分别培养BIU-87、EJ和T24细胞至1×107/瓶，用RNA提取液Trizol提取细胞中总RNA。正常组织标本从液氮中取出后，立即在冰上破碎，取1g组织，用Trizolv提取液提取总RNA，行RT-PCR，扩增条件为94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，35个循环后，72℃继续反应10min。同时扩增β-actin作为内参照，并设不加逆转录产物的PCR体系为阴性对照。最后用1.7%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
三、免疫细胞化学检测试剂与方法
免疫细胞化学所用鼠抗人VEGF单克隆抗体由中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室提供。生物素标记的羊抗鼠IgG和辣根酶标记链霉卵白素工作液为北京中山生物技术公司产品。所有标本均在同一条件下采用过氧化酶标记链霉卵白素染色法(SP法)进行免疫细胞化学染色，一抗稀释度为1∶100，并用PBS代替一抗为阴性对照。用经病理确诊为肾细胞癌的病理切片作阳性对照。结果判定：细胞浆出现棕黄色染色为阳性细胞，阳性显色者按细胞浆着色强度分为强、中、弱三个级别。
, 百拇医药
结 果
一、VEGF mRNA在膀胱癌细胞株的表达
RT-PCR产物电泳结果图像见图1，三种膀胱癌细胞株均可见516bp的VEGF mRNA扩增产物，为不含信号肽序列的VEGF165。正常膀胱组织无VEGF mRNA表达。β-actin作为内参照基因，在三种膀胱癌细胞株和正常膀胱组织均有表达，扩增片段为310bp。阴性对照组则无任何扩增条带出现。
图1 VEGF mRAN RT-PCR产物电泳结果
1.DL2000核酸分子量标准；2.阴性对照；3.正常膀胱组织；4.BIU-87细胞；5.24细胞；6.EJ细胞
二、VEGF蛋白在三种膀胱癌细胞株的表达
, 百拇医药 三种膀胱癌细胞株VEGF蛋白表达均呈阳性，着色部位主要分布在细胞浆。 三种膀胱癌细胞株中，以EJ细胞株染色最强，T24细胞株染色属中等强度，BIU-87细胞株VEGF蛋白表达较弱。
讨 论
肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成，抑制肿瘤血管生成是近年来肿瘤治疗的一个重要方向。血管基底膜及其周围细胞外基质的降解、血管内皮细胞的增殖、迁移和重组形成血管网，是肿瘤血管生成的重要环节。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，通过分布于内皮细胞表面、具有酪氨激酶活性的二种受体FLT-1和KDR发挥生物学作用。因其亦可增加微血管通透性，又称血管通透因子(VPF)[3]。
VEGF高表达于多种恶性肿瘤组织和体外培养的肿瘤细胞系，包括乳癌、神经胶质瘤、肾癌和卵巢癌等。但目前对肿瘤组织中VEGF的来源尚有争议。Takahashi等[4]证明VEGF主要存在于肿瘤细胞，可促使肿瘤的血管生成，并与其它血管生成相关因子之间有协同作用。Freeman等[5]则发现VEGF可由肿瘤浸润淋巴细胞表达。而Plate等[6]认为VEGF可由肿瘤血管内皮细胞表达，而正常组织中的内皮细胞没有表达。本实验从膀胱癌细胞株T24、BIU-87、EJ中均扩增出VEGF的PCR产物，说明在三种膀胱癌的细胞株中有VEGF的mRNA表达，这与Takahashi等[4]的结果一致。明确膀胱肿瘤中VEGF的来源，能够从细胞水平和基因水平上阻断VEGF的表达，从而抑制膀胱肿瘤的血管生成。
, 百拇医药
由于编码VEGF mRNA剪接方式不同，VEGF的mRNA有四种形式，分别编码含121、165、189和206个氨基酸的成熟蛋白，其中VEGF165是血管内皮生长因子生物学活性的主要存在形式，以可溶性方式分泌。VEGF121也以可溶性方式分泌，另外两种VEGF以细胞表面蛋白多糖的形式存在[7]。本实验从膀胱癌细胞系BIU-87、T24和EJ中扩增出VEGF165的PCR底物，提示VEGF165是人膀胱肿瘤中血管内皮生长因子的主要存在形式，并可能与膀胱肿瘤的血管生成有关。
本实验应用免疫细胞化学方法检测到膀胱癌细胞株BIU-87，T24和EJ均可表达VEGF蛋白，但表达强度不同。这三种细胞系来源于不同的膀胱恶性肿瘤，在生物学特性上是不同的，在一定程度上也反映了膀胱肿瘤的不均质性。O'Brien等[8]认为VEGF的表达是膀胱肿瘤的恶性表型之一，它在不同病理类型的膀胱肿瘤中表达不同，并证明VEGF的表达增加与膀胱肿瘤的复发密切相关。我们对三种膀胱癌细胞株VEGF蛋白表达检测结果进一步支持了O'Brien的观点。
, 百拇医药
进一步明确VEGF表达的调控机制将有助于控制肿瘤相关的血管生成[9]。以VEGF及其基因为靶分子，抑制其表达及活性，使肿瘤生长减缓甚至消失，将成为肿瘤治疗的一个有前途的方向。
作者单位：王 嵩(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
薛兆英(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
俞莉章(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
刘漓波(北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所 100034)
张智清(病毒基因工程国家重点实验室)
姚立红(病毒基因工程国家重点实验室)
, 百拇医药
陈爱君(病毒基因工程国家重点实验室)
参考文献
[1]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor.European J Cancer,1996,32A∶2413-2422.
[2]Campbell SC,Volpert OV,Ivanovich M,et al.Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer.Cancer Res,1998,58∶1298-1304.
[3]Keck PJ,Hauser SD,Krivi G,et al.Vascular permeability factor,an endothelial cell mitogen related to PDGF.Science,1989,246∶1309-1312.
, 百拇医药
[4]Takahashi A,Sasaki H,Kim SJ,et al.Markedly increased amounts of messenger RNAs for vascular endothelial growth factor and placenta growth factor in renal cell carcinoma associated with angiogenesis.Cancer Res,1994,54∶4233-4237.
[5]Freeman MR,Schneck FX,Gagnon ML,et al.Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancer express vascular endothelial growth factor:a potential role for T cells in angiogenesis.Cancer Res,1995,55∶4140-4145.
, 百拇医药
[6]Plate HK,Breier G,Weich HA,et al.Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo.Nature,1992,359∶845-848.
[7]Dvorak FH,Brown FL,Detmar M,et al.Vascular permeability factor/Vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability and angiogenesis.Am J Pathol.1995,146∶1029-1039.
[8]O'Brien T,Cranston D,Fuggle S,et al.Differental angiogenesis pathways characterize supperficial and invasive bladder cancer.Cancer Res,1995,55∶510-513.
[9]Claffey KP,Robison GS.Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells:consequences for tumor growth and metastasis.Cancer Metastasis Rev,1996,15∶165-176., http://www.100md.com