应激性生殖内分泌功能低下动物模型
连晓媛 丁岩 张均田
摘要 目的：观察应激对动物生殖内分泌的影响，建立符合临床需要的生殖内分泌紊乱的动物模型。方法：用悬吊和制动方法造成动物急性或重复应激状态，用放射免疫结合的方法测定血浆有关性激素的水平，用阴道涂片的方法观察雌性动物的性周期，用常规方法观察雄性动物的性行为。结果：急性制动应激和急性悬吊应激1，2，3 h均能使雄性小鼠血浆睾酮水平显著降低, 皮质酮水平则明显升高。大鼠急性制动应激3 h，可见血浆睾酮水平及睾丸中合成酶17α-羟化酶、17,20-羟甾脱氢酶和3β-裂解酶活性显著降低，皮质酮水平则明显升高。重复悬吊应激可使雄性小鼠性行为低下或缺损，雌性小鼠性周期紊乱，分别可见血浆睾酮和雌二醇水平降低。结论：应激可使生殖内分泌功能低下或紊乱，在此过程中性激素降低起着重要的作用。提示临床上各种躯体或心理应激引起的生殖内分泌功能低下或紊乱也与相关性激素降低或分泌节律失常有关, 应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型可供相关药物研究。
关键词:激性应激 重复应激 生殖内分泌紊乱
, 百拇医药
应激是指内外环境剧变刺激时，机体出现的包括精神、神经、内分泌和免疫系统等的综合应答状态。强烈身心应激尤其是长期慢性应激严重影响着人类的身心健康，导致临床疾病、亚健康状态及早衰[1,2]。
生殖内分泌系统对应激刺激尤为敏感，月经失调、高雄激素血症、闭经、不孕、男女性功能障碍等均与身心应激密切相关[3～8]。在“生物医学模式”向“生理、心理和社会医学模式”转变的今天，应激方法尤其是心理应激方法在相关药物研究中具有十分重要的作用。现将几年来我们建立的及国外应用较多、可操作性强的有关应激性生殖内分泌功能低下模型作一介绍[9～11]。
材料与方法
1 急性应激性睾酮水平低下模型
1.1 小鼠制动应激性睾酮水平低下模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00～12∶00，将小鼠置于50ml茶色瓶中，完全限制其自由活动即制动应激1～3h，应激期间不影响动物自由呼吸。应激结束即刻取血，肝素抗凝，分离血浆，用放射免疫结合方法测定血浆睾酮及皮质酮水平。
, 百拇医药
1.2 小鼠悬吊应激性睾酮水平低下模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00，以小鼠尾部为支点，将其悬吊于水面上，水温(25±1)℃，水深20 cm，悬吊高度以小鼠前肢刚接触水面为度，悬吊时间1～3 h，应激结束即刻取血，肝素抗凝，分离血浆，用放射免疫结合方法测定血浆睾酮及皮质酮水平。
1.3 大鼠制动应激性睾丸功能低下模型 取性成熟SD大鼠，体重230～250g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00将动物置于透明的聚乙烯圆锥形的制动应激装置中，使头部朝圆锥方向，圆锥大小以完全限制动物活动为度，位于动物鼻部的圆锥体处，开一直径1 cm的孔，以保证动物自由呼吸，如此应激3 h 。
2 重复应激性生殖内分泌功能低下模型
2.1 重复应激性小鼠性行为低下动物模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d。悬吊方法同前，悬吊1次/d，连续12d，并通过循序延长悬吊时间增加应激强度, d1～d3悬吊2h/d，d4～d6悬吊3h/d，d7～d9悬吊4h/d，d10～d12悬吊5h/d，每天应激时间安排在上午9∶00～下午2∶00。d6下午7∶00～9∶00开始观察每天应激后及末次应激恢复24h后15 min内性行为，即舔吻、跨骑、交配的潜伏期、发生数及发生率, 部分动物于末次应激后30 min取血，肝素抗凝，分离血浆供血浆中睾酮及皮质酮水平测定。
, 百拇医药
2.2 重复应激性雌小鼠性周期失常、雌二醇降低模型 取性成熟昆明种雌性小鼠，体重34～36g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，每天上午7∶30～8∶30阴道涂片，连续15d。选择有规律性周期的动物，悬吊方法同前，悬吊1次/d，连续12d，并通过循序延长悬吊时间增加应激强度，d1～d3悬吊1h/d,d4～d6悬吊2h/d,d7～d9悬吊3h/d，d10～d12悬吊4 h/d。每天应激时间安排在上午9∶00～12∶00。应激期间继续每天阴道涂片，观察性周期应激性变化。于应激后第2个动情期，取血，肝素抗凝，分离血浆，用放免法观察血浆中雌二醇水平应激性变化。
结 果
1 急性应激性睾酮水平低下模型
急性制动应激和悬吊应激1,2,3 h均能使小鼠血浆睾酮水平显著降低，相反，皮质酮水平则显著升高。急性制动应激3 h可使大鼠血浆睾酮水平及睾丸中睾酮合成酶17α-羟化酶、17,20-裂解酶和3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)活性显著降低，而血浆皮质酮水平明显升高。
, 百拇医药
2 重复应激性生殖内分泌功能低下模型
连续悬吊应激6d，即可见雄性小鼠性行为降低，应激12 d性行为进一步降低，甚至达到缺损的程度，同时血浆睾酮水平降低，而皮质酮水平及肾上腺指数明显升高。末次应激后恢复24 h动物性行为仍然处于低下状态。远低于雄性小鼠应激强度的重复应激12 d可使雌性小鼠性周期延长或紊乱，阴道涂片可见动情期角化上皮细胞减少，同时雌二醇水平显著降低。
讨 论
下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能亢进与下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴功能降低为机体应激反应的明显特征。血浆中皮质酮水平升高为判断机体处于应激状态的经典指标， 而肾上腺指数升高既可反映慢性应激过程中下丘脑-垂体轴应激反应对肾上腺作用的结果，也与慢性应激引起的血浆皮质酮水平升高密切相关。现有大量研究表明，HPA轴功能应激性亢进与HPG轴功能应激降低密切相关，应激反应时，下丘脑促肾上腺皮质释放激素(CRF)及肾上腺糖皮质激素(GCS)大量释放，CRF和 GCS均可在下丘脑、垂体、性腺(睾丸或卵巢)多水平抑制HPG轴功能[12～19]，我们发现睾酮应激性降低与皮质酮升高成反比[10]。临床上许多妇科疾病如闭经、多囊卵巢等均伴有肾上腺功能亢进[4,5,7,20，21]。可见，观察血浆皮质酮水平或肾上腺指数，在应激性生殖内分泌功能低下或紊乱模型及药物研究中具有重要的意义。
, 百拇医药
身心应激是生殖内分泌疾病、男女性功能低下或障碍的重要诱因。所以，用应激方法造成生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型，观察药物的作用能很好地预测药物的临床疗效。而且，应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型具有稳定、重现性好、可操作性强、无须特殊仪器设备的优点。综上所述，应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型在防治生殖内分泌疾病，男女性功能降低及延缓生殖内分泌功能衰老的药物研究中具有重要的作用。
作者单位：连晓媛，张均田(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)
丁 岩(江西江中制药责任有限公司)
参考文献
[1]Morse DR. Confronting existential anxiety: the ultimate stressor.Stress Med, 1998,14∶109
, 百拇医药
[2]Roch PJ. Stress and Aging.Stress Med,1997,13∶69
[3]Sommer B. Stress and menstrual distress. J Human Stress,1978,9∶5
[4]Modell E, Goldstein D, Reyes FI. Endocrine and behavioral responses to psychological stress in hyperandrogenic women.Fertil Steril,1990, 53∶454
[5]Bille BMK, Federoff HJ, Koenig JI,et al. Abnormal cortisol secretion and responses to corticotropin-releasing hormone in women with hypothalamic amenorrhea.J Clin Endocrinol Metab,1990, 70∶3112
, 百拇医药
[6]Russell GFM. Psychological and nutritional factors in disturbance of menstrual function and ovulation.Postgrad Med J, 1972,48∶10
[7]Demyttenaere K, Nijs P, Evers-Kiebooms G,et al. Coping and the ineffectiveness of coping influence the outcome of in vitro fertilization through stress responses.Psychoneuroendocrinology, 1992, 17(6)∶655
[8]Wheatley D. Sex,stress and sleep.Stress Med,1998,14∶245
, 百拇医药 [9]Orr TE, Taylor M F, Bhattacharyya A, et al. Acute immobilization stress disrupts testicular steriodogenesis in adult male rats by inhibiting the activity of 17α-hydroxylase and 17,20-layase without affecting the binding of LH/HCG Receptors.J Androl, 1994, 15∶302
[10]连晓媛，张均田.重复应激造成小鼠性行为缺损.中国药理学通报，1998,14(3)∶273
[11]Tiantong Bao, Hiroshi Saito. Effects of red Ginseng,vitamins and their preparations(Ⅱ)-effect of passive avoidance response in stressed mice. 药理ど治疗， 1984,12(4)∶20
, 百拇医药
[12]Rivier C, Vale W. Influence of corticotropin-releasing factor on reproduction functions in the rat.Endocrinology, 1984, 114∶914
[13]Olster DH, Ferin M. Corticotropin-releasing hormone inhibits gonadotropin secretion in the ovariectomized Rhesus monkey.J Clin Endocrinol Metab, 1987, 65∶262
[14]Padmanabhan V, Keech C, Convey EM. Cortisol inhibits and adrenocorticotropin has no effect on luteinizing hormone-releasing hormone from bovine pituitary cells in vitro.Endocrinology, 1983, 112(5)∶1782
, http://www.100md.com
[15]Ulisse S, Fabbri A, Dufau ML. Corticotropin-releasing factor receptors and actions in rat leydig cells. J Biol Chem, 1989,264(4)∶2156
[16]Calogero DE, Burrello N, Negri-Cesi P, et al. Effects of corticotropin-releasing hormone on ovarian estrogen production in vitro.Endocrinology,1996, 137∶4161
[17]Saketos M,Sharma N, Santoro N. Suppression of the hypothalamic-pituitary-ovarian axis in normal women by glucocorticoids.Biol Reprod,1993, 49∶1270
, 百拇医药
[18]Cumming C, Quigley ME, Yen SSC. Acute suppression of circulating testosterone levels by cortisol in men.J Clin Endocrinol Metab,1983, 57∶671
[19]Hales DB, Payne AH. Glucocorticoid mediated repression of P450 scc mRNA and de novo synthesis in cultured leydig cells.Endocrinology,1989, 124∶2019
[20]Berga SL, Mortola JF, Girton L,et al. Neuroendocrine abberations in women with Functional hypothalamic amenorrhea. J Clin Endocrinol Metab, 1989, 68∶301
[21]Loucks AE, Mortola JF, Girton L, et al. Alterations in the hyptothalamic-pituitary-ovarian and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in athletic. J Clin Endocrinol Metab,1989,68∶402, 百拇医药
摘要 目的：观察应激对动物生殖内分泌的影响，建立符合临床需要的生殖内分泌紊乱的动物模型。方法：用悬吊和制动方法造成动物急性或重复应激状态，用放射免疫结合的方法测定血浆有关性激素的水平，用阴道涂片的方法观察雌性动物的性周期，用常规方法观察雄性动物的性行为。结果：急性制动应激和急性悬吊应激1，2，3 h均能使雄性小鼠血浆睾酮水平显著降低, 皮质酮水平则明显升高。大鼠急性制动应激3 h，可见血浆睾酮水平及睾丸中合成酶17α-羟化酶、17,20-羟甾脱氢酶和3β-裂解酶活性显著降低，皮质酮水平则明显升高。重复悬吊应激可使雄性小鼠性行为低下或缺损，雌性小鼠性周期紊乱，分别可见血浆睾酮和雌二醇水平降低。结论：应激可使生殖内分泌功能低下或紊乱，在此过程中性激素降低起着重要的作用。提示临床上各种躯体或心理应激引起的生殖内分泌功能低下或紊乱也与相关性激素降低或分泌节律失常有关, 应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型可供相关药物研究。
关键词:激性应激 重复应激 生殖内分泌紊乱
, 百拇医药
应激是指内外环境剧变刺激时，机体出现的包括精神、神经、内分泌和免疫系统等的综合应答状态。强烈身心应激尤其是长期慢性应激严重影响着人类的身心健康，导致临床疾病、亚健康状态及早衰[1,2]。
生殖内分泌系统对应激刺激尤为敏感，月经失调、高雄激素血症、闭经、不孕、男女性功能障碍等均与身心应激密切相关[3～8]。在“生物医学模式”向“生理、心理和社会医学模式”转变的今天，应激方法尤其是心理应激方法在相关药物研究中具有十分重要的作用。现将几年来我们建立的及国外应用较多、可操作性强的有关应激性生殖内分泌功能低下模型作一介绍[9～11]。
材料与方法
1 急性应激性睾酮水平低下模型
1.1 小鼠制动应激性睾酮水平低下模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00～12∶00，将小鼠置于50ml茶色瓶中，完全限制其自由活动即制动应激1～3h，应激期间不影响动物自由呼吸。应激结束即刻取血，肝素抗凝，分离血浆，用放射免疫结合方法测定血浆睾酮及皮质酮水平。
, 百拇医药
1.2 小鼠悬吊应激性睾酮水平低下模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00，以小鼠尾部为支点，将其悬吊于水面上，水温(25±1)℃，水深20 cm，悬吊高度以小鼠前肢刚接触水面为度，悬吊时间1～3 h，应激结束即刻取血，肝素抗凝，分离血浆，用放射免疫结合方法测定血浆睾酮及皮质酮水平。
1.3 大鼠制动应激性睾丸功能低下模型 取性成熟SD大鼠，体重230～250g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d, d4上午9∶00将动物置于透明的聚乙烯圆锥形的制动应激装置中，使头部朝圆锥方向，圆锥大小以完全限制动物活动为度，位于动物鼻部的圆锥体处，开一直径1 cm的孔，以保证动物自由呼吸，如此应激3 h 。
2 重复应激性生殖内分泌功能低下模型
2.1 重复应激性小鼠性行为低下动物模型 取性成熟昆明种小鼠，体重36～38g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，适应环境3d。悬吊方法同前，悬吊1次/d，连续12d，并通过循序延长悬吊时间增加应激强度, d1～d3悬吊2h/d，d4～d6悬吊3h/d，d7～d9悬吊4h/d，d10～d12悬吊5h/d，每天应激时间安排在上午9∶00～下午2∶00。d6下午7∶00～9∶00开始观察每天应激后及末次应激恢复24h后15 min内性行为，即舔吻、跨骑、交配的潜伏期、发生数及发生率, 部分动物于末次应激后30 min取血，肝素抗凝，分离血浆供血浆中睾酮及皮质酮水平测定。
, 百拇医药
2.2 重复应激性雌小鼠性周期失常、雌二醇降低模型 取性成熟昆明种雌性小鼠，体重34～36g，室温20～23℃，光照(14h光∶10h暗)，每天上午7∶30～8∶30阴道涂片，连续15d。选择有规律性周期的动物，悬吊方法同前，悬吊1次/d，连续12d，并通过循序延长悬吊时间增加应激强度，d1～d3悬吊1h/d,d4～d6悬吊2h/d,d7～d9悬吊3h/d，d10～d12悬吊4 h/d。每天应激时间安排在上午9∶00～12∶00。应激期间继续每天阴道涂片，观察性周期应激性变化。于应激后第2个动情期，取血，肝素抗凝，分离血浆，用放免法观察血浆中雌二醇水平应激性变化。
结 果
1 急性应激性睾酮水平低下模型
急性制动应激和悬吊应激1,2,3 h均能使小鼠血浆睾酮水平显著降低，相反，皮质酮水平则显著升高。急性制动应激3 h可使大鼠血浆睾酮水平及睾丸中睾酮合成酶17α-羟化酶、17,20-裂解酶和3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)活性显著降低，而血浆皮质酮水平明显升高。
, 百拇医药
2 重复应激性生殖内分泌功能低下模型
连续悬吊应激6d，即可见雄性小鼠性行为降低，应激12 d性行为进一步降低，甚至达到缺损的程度，同时血浆睾酮水平降低，而皮质酮水平及肾上腺指数明显升高。末次应激后恢复24 h动物性行为仍然处于低下状态。远低于雄性小鼠应激强度的重复应激12 d可使雌性小鼠性周期延长或紊乱，阴道涂片可见动情期角化上皮细胞减少，同时雌二醇水平显著降低。
讨 论
下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能亢进与下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴功能降低为机体应激反应的明显特征。血浆中皮质酮水平升高为判断机体处于应激状态的经典指标， 而肾上腺指数升高既可反映慢性应激过程中下丘脑-垂体轴应激反应对肾上腺作用的结果，也与慢性应激引起的血浆皮质酮水平升高密切相关。现有大量研究表明，HPA轴功能应激性亢进与HPG轴功能应激降低密切相关，应激反应时，下丘脑促肾上腺皮质释放激素(CRF)及肾上腺糖皮质激素(GCS)大量释放，CRF和 GCS均可在下丘脑、垂体、性腺(睾丸或卵巢)多水平抑制HPG轴功能[12～19]，我们发现睾酮应激性降低与皮质酮升高成反比[10]。临床上许多妇科疾病如闭经、多囊卵巢等均伴有肾上腺功能亢进[4,5,7,20，21]。可见，观察血浆皮质酮水平或肾上腺指数，在应激性生殖内分泌功能低下或紊乱模型及药物研究中具有重要的意义。
, 百拇医药
身心应激是生殖内分泌疾病、男女性功能低下或障碍的重要诱因。所以，用应激方法造成生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型，观察药物的作用能很好地预测药物的临床疗效。而且，应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型具有稳定、重现性好、可操作性强、无须特殊仪器设备的优点。综上所述，应激性生殖内分泌功能低下或紊乱动物模型在防治生殖内分泌疾病，男女性功能降低及延缓生殖内分泌功能衰老的药物研究中具有重要的作用。
作者单位：连晓媛，张均田(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)
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[16]Calogero DE, Burrello N, Negri-Cesi P, et al. Effects of corticotropin-releasing hormone on ovarian estrogen production in vitro.Endocrinology,1996, 137∶4161
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