精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系
崔英霞 王咏梅 商学军 黄宇烽
摘 要 目的 探讨精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系。 方法 应用PCR技术对100例不育男性(精子活动力差50例，精子活动力正 常50例)和30例已育男性的精子MTCYB基因进行检测。 结果 男 性不育组精子MTCYB基因缺失率为16%，其中精子活力差的50例标本检出9例，精子活动力正 常的50例标本中检出7例，经统计学检验二组差异无显著性(P>0.05)。生育组30例精子 标本中未检出MTCYB基因缺失，与男性不育组比较差异有非常显著性(P<0.01)。 结论 MTCYB基因缺失可能是男性不育的原因之一。
关键词：不育症，男性 基因
精子活动力障碍是男性不育的重要原因之一。近年来精子活动力障碍及男性不育与线粒体DNA(mtDNA)缺失的关系引起人们的关注。我们为此进行了mtDNA编码的精子MTCYB基因的检测工作，报告如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、样本选择
不育男性100例。年龄28～37岁。手淫法留取精液标本。精液常规检查精子密度10～30×109/L。按活动率不同分为二组，每组各50例。一组为精子活力A+B>50%，活动率>70%。另一组活力A+B<30%，活动率<35%，此组病人标本经伊红Y染色，确定70%以上为活精子。30名正常已育男性，年龄29～36岁，精液常规检查正常，精子密度>20×109/L，活动力A+B>50%，活动率为70%～75%。
二、精子mtDNA提取
将精子密度调整至10×109/L，按文献〔1〕方法提取精子总DNA。DNA浓度用紫外分光光度计测定。
三、MTCYB基因引物的设计与合成
, 百拇医药
参照mtDNA的序列〔2〕，设计MTCYB基因引物为：5’-GGGACAGACCTAGTTCAATG-3’和5’-CTGCGGCTAGGAGTCAATAA-3’。同时设计MTATP6基因引物为：5’-CACCAACCACCCAACTATCT-3’和5’-TAAGGCGACAGCGATTTCT-3’。MTATP6基因的扩增作为检测模板是否可靠的对照(引物由上海生工公司合成)。MTCYB期待产物为523bp，MTATP6的期待产物为346bp。
四、PCR检测
每份标本均进行MTCYB及MTATP6的检测，PCR反应体积50μl，含DNA模板0.4μg，预变性后，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，延伸72℃ 7min，取10μl PCR产物，与1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相。
五、测序分析
, http://www.100md.com
MTCYB和MTATP6PCR产物经纯化后分别进行DNA序列测定(由大连宝生物公司进行)。
结 果
一、PCR分析
MTCYB基因扩增产物、MTATP6基因扩增产物与期待扩增产物片段大小一致(图1)。
图1 琼脂糖凝胶(1.5%)电泳分离的MTCYB基因、MTATP6基因的PCR产物
M为标样：1～3为346bp(MTATP6)，4～6为523bp(MTCYB)
MTCYB基因缺失率在男性不育组为16%，其中精子活动率<35%组检出9例，精子活动率>70%组中检出7例，经统计学检验，二组差异无显著性(P>0.05)。生育组30例标本中未检出MTCYB基因缺失。生育组与不育二组分别比较，差异均有显著性(P<0.05)。不育组与生育组比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
二、DNA序列分析
为了证明PCR产物的正确性，PCR产物经纯化后进行DNA测序，结果证实PCR产物确为MTCYB和MTATP6基因片段。
讨 论
精子活动能力是衡量精液质量和男性生育力的一项重要指标。近年来，mtDNA缺陷与精子活动力及男性不育之间是否相关引起关注。Kao等〔3〕研究发现mtDNA4977bp的缺失与精子活力呈负相关。本研究中，不育组精子活动率<35%的标本中，检出9例MTCYB基因缺失，精子活动率>70%的标本中，检出7例MTCYB基因缺失，二组比较无统计学差异，因此认为，MTCYB基因缺失与获能前的精子运动力差无直接关系。研究证明，获能前的精子主要依赖酵解供能，酵解供能过程不需线粒体参与〔4〕。精液常规检查的是获能前的精子运动状态，此时的活动能力主要反映的不是线粒体的功能，因此，此项检查 并没能揭示不育患者精子活动能力差的原因。但生育组与不育组比较，差异有非常显著性，表明线粒体功能在生育过程中的重要作用。精子进入女性生殖道以后，开始获能，女性生殖道液中富含葡萄糖、丙酮酸盐与乳酸盐，为精子获能提供了能源物质，此时在精子线粒体中经氧化磷酸化产生大量ATP，使原来由酵解供能的精子代谢活性明显升高，出现一种特异的“鞭打样”(whiplashmotility)运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。在线粒体内膜中，呼吸复合体Ⅲ是线粒体氧化磷酸化电子传递中的第二个酶，它的缺失将不能催化电子从还原型辅酶Q到细胞色素C的转运，并把质子从线粒体内膜转移至膜外，而MTCYB是呼吸复合体Ⅲ中唯一由mtDNA编码的亚基，为高度保守的疏水蛋白，含有8或9个跨膜区和2个血红素基团，MTCYB与核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同构成呼吸复合体Ⅲ的中心成分。因此，MTCYB基因的缺失将直接影响线粒体氧化磷酸化过程，从而影响精子获能受精过程〔5〕。本研究结果表明，MTCYB基因的缺失可能是男性不育的原因之一。
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作者单位：崔英霞(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
王咏梅(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
商学军(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
黄宇烽(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
参考文献
1，赵权,方刚,王咏梅.快速、可靠的血和组织中DNA提取法.金陵医院学报1994， 1∶48-49.
2，Anderson S,Bankier AT,Barrell MT,et al.Sepunce and organization of the hum an mitochondrial genome.Nature,1981,290∶457-465.
3，Kao SH,Chao HT,Wei YH.Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4977 bp deletion is associated with diminished fetility and motility of human sperm.Biol Reprod 1995,52∶729-736.
4，谢文英,王飞,江渔.男性学.第1版.上海：上海科学技术出版社.1991,138-139.
5，McKusick VA著.人类孟德尔遗传.罗会元等译.第11版.北京：北京医科大学 中国协和 医科大学联合出版社.1998,3002-3003., http://www.100md.com
摘 要 目的 探讨精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系。 方法 应用PCR技术对100例不育男性(精子活动力差50例，精子活动力正 常50例)和30例已育男性的精子MTCYB基因进行检测。 结果 男 性不育组精子MTCYB基因缺失率为16%，其中精子活力差的50例标本检出9例，精子活动力正 常的50例标本中检出7例，经统计学检验二组差异无显著性(P>0.05)。生育组30例精子 标本中未检出MTCYB基因缺失，与男性不育组比较差异有非常显著性(P<0.01)。 结论 MTCYB基因缺失可能是男性不育的原因之一。
关键词：不育症，男性 基因
精子活动力障碍是男性不育的重要原因之一。近年来精子活动力障碍及男性不育与线粒体DNA(mtDNA)缺失的关系引起人们的关注。我们为此进行了mtDNA编码的精子MTCYB基因的检测工作，报告如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、样本选择
不育男性100例。年龄28～37岁。手淫法留取精液标本。精液常规检查精子密度10～30×109/L。按活动率不同分为二组，每组各50例。一组为精子活力A+B>50%，活动率>70%。另一组活力A+B<30%，活动率<35%，此组病人标本经伊红Y染色，确定70%以上为活精子。30名正常已育男性，年龄29～36岁，精液常规检查正常，精子密度>20×109/L，活动力A+B>50%，活动率为70%～75%。
二、精子mtDNA提取
将精子密度调整至10×109/L，按文献〔1〕方法提取精子总DNA。DNA浓度用紫外分光光度计测定。
三、MTCYB基因引物的设计与合成
, 百拇医药
参照mtDNA的序列〔2〕，设计MTCYB基因引物为：5’-GGGACAGACCTAGTTCAATG-3’和5’-CTGCGGCTAGGAGTCAATAA-3’。同时设计MTATP6基因引物为：5’-CACCAACCACCCAACTATCT-3’和5’-TAAGGCGACAGCGATTTCT-3’。MTATP6基因的扩增作为检测模板是否可靠的对照(引物由上海生工公司合成)。MTCYB期待产物为523bp，MTATP6的期待产物为346bp。
四、PCR检测
每份标本均进行MTCYB及MTATP6的检测，PCR反应体积50μl，含DNA模板0.4μg，预变性后，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，延伸72℃ 7min，取10μl PCR产物，与1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相。
五、测序分析
, http://www.100md.com
MTCYB和MTATP6PCR产物经纯化后分别进行DNA序列测定(由大连宝生物公司进行)。
结 果
一、PCR分析
MTCYB基因扩增产物、MTATP6基因扩增产物与期待扩增产物片段大小一致(图1)。
图1 琼脂糖凝胶(1.5%)电泳分离的MTCYB基因、MTATP6基因的PCR产物
M为标样：1～3为346bp(MTATP6)，4～6为523bp(MTCYB)
MTCYB基因缺失率在男性不育组为16%，其中精子活动率<35%组检出9例，精子活动率>70%组中检出7例，经统计学检验，二组差异无显著性(P>0.05)。生育组30例标本中未检出MTCYB基因缺失。生育组与不育二组分别比较，差异均有显著性(P<0.05)。不育组与生育组比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
二、DNA序列分析
为了证明PCR产物的正确性，PCR产物经纯化后进行DNA测序，结果证实PCR产物确为MTCYB和MTATP6基因片段。
讨 论
精子活动能力是衡量精液质量和男性生育力的一项重要指标。近年来，mtDNA缺陷与精子活动力及男性不育之间是否相关引起关注。Kao等〔3〕研究发现mtDNA4977bp的缺失与精子活力呈负相关。本研究中，不育组精子活动率<35%的标本中，检出9例MTCYB基因缺失，精子活动率>70%的标本中，检出7例MTCYB基因缺失，二组比较无统计学差异，因此认为，MTCYB基因缺失与获能前的精子运动力差无直接关系。研究证明，获能前的精子主要依赖酵解供能，酵解供能过程不需线粒体参与〔4〕。精液常规检查的是获能前的精子运动状态，此时的活动能力主要反映的不是线粒体的功能，因此，此项检查 并没能揭示不育患者精子活动能力差的原因。但生育组与不育组比较，差异有非常显著性，表明线粒体功能在生育过程中的重要作用。精子进入女性生殖道以后，开始获能，女性生殖道液中富含葡萄糖、丙酮酸盐与乳酸盐，为精子获能提供了能源物质，此时在精子线粒体中经氧化磷酸化产生大量ATP，使原来由酵解供能的精子代谢活性明显升高，出现一种特异的“鞭打样”(whiplashmotility)运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。在线粒体内膜中，呼吸复合体Ⅲ是线粒体氧化磷酸化电子传递中的第二个酶，它的缺失将不能催化电子从还原型辅酶Q到细胞色素C的转运，并把质子从线粒体内膜转移至膜外，而MTCYB是呼吸复合体Ⅲ中唯一由mtDNA编码的亚基，为高度保守的疏水蛋白，含有8或9个跨膜区和2个血红素基团，MTCYB与核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同构成呼吸复合体Ⅲ的中心成分。因此，MTCYB基因的缺失将直接影响线粒体氧化磷酸化过程，从而影响精子获能受精过程〔5〕。本研究结果表明，MTCYB基因的缺失可能是男性不育的原因之一。
, http://www.100md.com
作者单位：崔英霞(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
王咏梅(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
商学军(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
黄宇烽(210002 南京军区南京总医院解放军医学检验中心)
参考文献
1，赵权,方刚,王咏梅.快速、可靠的血和组织中DNA提取法.金陵医院学报1994， 1∶48-49.
2，Anderson S,Bankier AT,Barrell MT,et al.Sepunce and organization of the hum an mitochondrial genome.Nature,1981,290∶457-465.
3，Kao SH,Chao HT,Wei YH.Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4977 bp deletion is associated with diminished fetility and motility of human sperm.Biol Reprod 1995,52∶729-736.
4，谢文英,王飞,江渔.男性学.第1版.上海：上海科学技术出版社.1991,138-139.
5，McKusick VA著.人类孟德尔遗传.罗会元等译.第11版.北京：北京医科大学 中国协和 医科大学联合出版社.1998,3002-3003., http://www.100md.com