依那普利对大鼠残肾细胞外基质蓄积的作用观察
阳晓 魏毅 叶任高 张进华 刘晓文
摘 要：目的：探讨依那普利延缓肾小球硬化的有效性。方法：运用免疫组化方法观察依那普利对5/6肾切除大鼠残肾模型早、中期细胞外基质(ECM)蓄积及其部分调控机制的影响。结果：残肾模型术后1周开始给予依那普利，术后5周大鼠尿蛋白显著降低〔(2.01±0.13)g/24 h比(3.10±0.17)g/24 h〕；病理结果示ECM多种成分的蓄积显著减少，肾小球硬化减轻(硬化指数SI为1.67±0.76比2.00±0.75, P<0.05)。肾小球内细胞数〔(72.28±13.70)个/肾小球横截面比(81.16±16.62)个/肾小球横截面〕及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数〔(6.76±2.72)个/肾小球横截面比(8.16±2.78)个/肾小球横截面〕均显著减少(P均<0.01)。结论：依那普利能延缓肾小球硬化，减少残肾ECM蓄积可能是其作用机制之一。
关键词：依那普利 细胞外基质 肾小球硬化
, 百拇医药
细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肾小球内进行性蓄积是肾小球硬化的病理特征之一。本研究通过观察依那普利对5/6肾切除大鼠残肾模型早、中期ECM蓄积及其部分调控机制的影响，探讨其延缓肾小球硬化的有效性和作用环节。
1 材料与方法
1.1 动物：SD雄性大鼠，体重160～200 g，购自第一军医大学动物所。
1.2 受试药物：依那普利为默沙东(澳大利亚)公司美国默克公司分部生产，每片10 mg，临用前用蒸馏水配制成0.4 g/L药液。
1.3 造模及分组：大鼠随机分为假手术组、模型组和依那普利组。各组自由饮水，饲以标准蛋白饲料。除假手术组外，其余各组行5/6肾切除进行制模，即用戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射将大鼠麻醉，分离左肾，行上下极肾切除，明胶海绵压迫止血，1周后切除右肾。术后1周根据尿蛋白含量及体重将动物随机分组，各组施以相应的受试因素：假手术组(n=6)及模型组(n=6)给予蒸馏水10 ml/kg，依那普利组(n=6)给予依那普利5 mg/kg。各组动物每日灌胃1次，连续4周，4周末用代谢笼收集24小时尿液，测量尿量，留取尿样测尿蛋白；腹主动脉取血测尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)；取肾标本作光镜及免疫组化检测。
, 百拇医药
1.4 指标检测：
1.4.1 生化指标：BUN测定用脲酶Berthelot比色法(试剂盒由卫生部上海生物制品研究所生产)；肌酐测定用Jaffe氏反应法(试剂盒由宁波市临床检验中心监制)；尿蛋白测定用三氯醋酸比浊法(三氯醋酸由广州医药站监制，批号850901)。测试仪器为752紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.4.2 肾组织形态学检测：用于光镜及免疫组化的肾组织标本用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3 μm切片作HE和PAS染色，计数每一肾小球横截面细胞核总数(细胞核数少于50的肾小球删除〔1〕)；按文献〔1〕报道半定量计分法测量肾小球硬化指数，每只动物计数25个肾小球，取平均值。
1.4.3 免疫组化染色：试剂：一抗有兔抗大鼠Ⅰ型胶原(博士德公司产品)，既用型；小鼠抗大鼠Ⅳ型胶原(DAKO公司产品)，工作浓度1∶100；兔抗大鼠层粘连蛋白(Sigma公司产品)，既用型；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA，ZYMED公司产品)，既用型。二抗有生物素化山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG(博士德公司产品)，工作浓度为1∶100。SABC试剂盒(博士德公司产品)。
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方法：4 μm石蜡切片，常规脱蜡至水，蒸馏水新鲜配制3%H2O2以灭活内源性酶；修复抗原；滴加1∶50正常山羊血清封闭液，室温20分钟；滴加适当稀释的一抗，室温1～2小时或4 ℃过夜，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)冲洗；滴加1∶100生物素化山羊抗小鼠IgG(或其它与一抗对应的二抗)，室温30分钟，PBS冲洗；滴加试剂1∶100 SABC，室温30分钟，PBS冲洗；DAB显色，镜下控制反应时间，水洗；苏木素轻度复染、脱水、透明、封片、显微镜下观察。阴性对照组以正常兔IgG及PBS代替一抗。每组取3只动物，每张切片至少观察25个肾小球，PCNA阳性细胞采用直接计数法，其余各指标按文献〔1〕报道半定量计分：0：肾小球染色无定位性增加；1+：1%～25%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；2+：25%～50%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；3+：50%～70%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；4+：>75%肾小球血管袢呈强染色。
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1.5 统计学方法：计量资料采用方差分析，对不满足参数统计条件的资料比较用秩和检验，连续变量作相关分析，全部统计采用SPSS统计软件完成。
2 结 果
2.1 制模后5周血BUN、SCr、尿蛋白含量变化见表1。结果示模型组和依那普利组BUN、SCr均显著高于假手术组(P<0.05或P<0.01)；依那普利组与模型组上述指标比较差异无显著性(P均>0.05)；模型组和依那普利组尿蛋白均极显著高于假手术组(P均<0.01),依那普利组尿蛋白则极显著低于模型组(P<0.01)。
表1 3组大鼠制模后5周血BUN、SCr和尿蛋白含量比较(X±s)
组别
动物数(只)
BUN(mmol/L)
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SCr(μmol/L)
尿蛋白(g/24h)
假手术组
6
7.42±1.35
65.71±13.29
0.14±0.02
模型组
6
16.61±3.55**
93.11± 9.68**
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3.10±0.17**
依那普利组
6
14.07±1.17**
88.11±6.17*
2.01±0.13**△△
注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01
2.2 肾脏病理改变：光镜下，假手术组大鼠肾小球血管壁正常，系膜细胞无增生，间质无明显炎症细胞浸润(图1)。模型组则可见包氏囊扩张，肾小球血管袢狭窄、闭塞，管壁增厚，细胞大量增生，基质增多，系膜区增宽，间质炎症细胞浸润，近曲小管浊肿，有大量管型(图2)。依那普利组肾小球毛细血管袢充血较显著，部分管袢增厚，管腔变窄，系膜区增宽，间质炎症细胞浸润较少，管型多(图3)；表2示肾小球硬化指数在制模各组均显著高于假手术组(P均<0.01)，依那普利组则显著低于模型组(P<0.05)。
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图1 假手术组肾病理改变(PAS×200)
图2 模型组肾病理改变(PAS×200)
图3 依那普利组肾病理改变(PAS×200)
表2 3组大鼠肾小球硬化指数及ECM成分比较(X±s)
组别
动物数(只)
肾小球硬化指数
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Ⅰ型胶原(分)
Ⅳ型胶原(分)
层粘连蛋白(分)
假手术组
6
0.12±0.32
0.08±0.27
1.33±0.45
1.29±0.46
模型组
6
2.00±0.75**
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0.64±0.53**
2.61±0.59**
2.64±0.56**
依那普利组
6
1.67±0.76**△
0.43±0.49**△
2.37±0.49**△
2.13±0.64**△△
注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01
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2.3 肾小球ECM半定量分析：假手术组中，Ⅰ型胶原主要在肾间质和血管壁表达，肾小球内一般无表达或极少量表达(0～1级，图4)，造模后各组动物肾小球内均有少量Ⅰ型胶原表达(图5、6)，主要出现在系膜区，从表2半定量结果可见,与假手术组比较均有极显著差异(P均<0.01)；而依那普利组显著低于模型组 (P<0.05)；层粘连蛋白与Ⅳ型胶原正常在肾小管基底膜、肾小球内毛细血管基底膜表达(1～2级)。制模后，两种胶原在肾小球内表达增加，其染色增加的区域通常与细胞增生区域有关。半定量结果示依那普利组Ⅳ型胶原及层粘连蛋白在肾小球内的表达显著低于模型组(P<0.05和P<0.01，图7～12)。
图4 假手术组肾I型胶原结果(×200)
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图5 模型组肾I型胶原结果(×200)
图6 依那普利组肾I型胶原结果(×200)
图7 假手术组肾IV型胶原结果(×200)
图8 模型组肾IV型胶原结果(×200)
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图9 依那普利组肾IV型胶原结果(×200)
图10 假手术组肾层粘连蛋白结果(×200)
图11 模型组肾层粘连蛋白结果(×200)
图12 依那普利组肾层粘连蛋白结果(×200)
2.4 肾小球细胞增生定量分析：假手术组肾小球细胞无明显增生，PCNA阳性细胞少见。模型组肾小球细胞数显著增加，同时PCNA阳性细胞数亦显著增加。依那普利组肾小球内细胞总数及PCNA阳性细胞数显著低于模型组(P均<0.01)。肾小球细胞增生与PCNA阳性细胞表达之间呈显著正相关(r＝0.379，P<0.01)。
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表3 3组大鼠肾小球总细胞数和PCNA阳性细胞数比较(X±s)
组别
动物数
(只)
肾小球总细胞数
(个/肾小球横截面)
PCNA阳性细胞数
(个/肾小球横截面)
假手术组
6
56.03±6.43
1.83±1.49
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模型组
6
81.16±16.62**
8.16±2.78**
依那普利组
6
72.28±13.70**△△
6.76±2.72**△△
注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01
3 讨 论
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ECM从形态上分为肾小球基底膜、系膜基质和包氏囊基底膜；生化上则由胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖构成，在维持正常的肾小球形态及功能上起着重要作用〔2〕。在各种慢性进行性肾小球疾病中，系膜基质的改变是导致肾小球硬化的共同途径。蓄积的ECM包括正常肾小球具有的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等，也含有Ⅰ、Ⅲ型间质胶原型〔3〕。本实验应用免疫组化方法,通过对Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的检测，发现正常大鼠肾小球内含有Ⅳ型胶原和层粘连蛋白；而Ⅰ型胶原主要在肾间质和血管壁表达，在肾小球内不表达。残肾模型术后5周，肾小球内Ⅳ型胶原及层粘连蛋白显著增多，且与肾小球硬化指数呈正相关。同时肾小球内出现Ⅰ型胶原，结果与文献报道〔1〕一致。残肾模型术后1周开始给予依那普利，术后5周尿蛋白显著降低；病理结果示ECM多种成分的蓄积显著减少，肾小球硬化减轻。提示依那普利能减少ECM蓄积，减缓肾小球硬化的发生。
在进行性肾小球疾病的初起阶段，多数情况下可以发现肾小球内有细胞增殖，随后出现ECM增加。提示ECM增多与细胞增殖有关〔1〕。肾小球系膜细胞、上皮细胞，尤其是系膜细胞在肾小球内ECM聚集中可能起重要作用。培养的系膜细胞能够合成多种ECM成分，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原，层粘连蛋白及各种糖蛋白等〔4〕。PCNA是一种细胞DNA聚合酶的辅助蛋白，其作用是促进DNA聚合酶链延伸DNA链，且有增强DNA聚合酶活性的作用，它在S期的细胞核中达到高峰，因此可作为判断S期DNA含量及细胞增殖分裂的一个标志〔5〕。Floege等〔1〕报道，在5/6肾切除术后5日，PCNA染色提示细胞开始增生，2周内达高峰，以后逐渐降低但仍然高于对照动物，直至第10周；细胞总数在术后第2周时开始显著增加，之后继续增加；运用双重免疫组化染色结果显示残肾中增生的细胞主要是系膜细胞。本研究资料发现，残肾肾小球细胞显著增多，PCNA阳性细胞也显著增多，ECM蓄积常常与细胞增生区域有关。虽然本实验未行双重免疫组化染色确定增生细胞的类型，但结合国内外报道的结果，提示系膜细胞增生可能是本模型ECM蓄积的主要原因之一。使用依那普利后肾小球内细胞数及PCNA阳性细胞数显著减少，提示减少细胞增生是其减少ECM蓄积、减轻肾小球硬化的作用机制之一。
, 百拇医药
基金项目：广东省中医药局科研基金资助项目(99556)
作者简介：阳 晓(1961-)，女(汉族)，湖南株洲人，博士，副教授，副主任医师，现为广州中山医科大学第一附属医院肾脏病研究所博士后。主要从事中西医结合肾脏病研究;获省科技成果二等奖1项，三等奖4项；共发表学术论文28篇。湖南省中西医结合肾病跨世纪学科带头人后备人选。
阳晓(中山医科大学第一附属医院肾内科卫生部重点实验室，广东 广州 510080)
叶任高(中山医科大学第一附属医院肾内科卫生部重点实验室，广东 广州 510080)
魏毅(第一军医大学，广东 广州 510515)
张进华(第一军医大学，广东 广州 510515)
, 百拇医药
刘晓文(第一军医大学，广东 广州 510515)
参考文献：
〔1〕Floege J,Johnson R J,Gordon K,et al.Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis.Kidney Int,1991,40:477-488.
〔2〕Floege J,Burns M W,Alpers C E,et al.Glomerular cell proliferation and PDGF expression precede glomerulosclerosis in the remnant kidney model.Kidney Int,1992,41:297-309.
〔3〕Rosenblum N D.The mesangial matrix in the normal and sclerotic glomerulus. Kidney Int,1994,(Suppl 45):S73-S77.
〔4〕Ishimura E,Sterzel J,Budde Y,et al.Formation of extracelluar matrix by cultured rat mesangial cells.Am J Pathol，1989,134:843-849.
〔5〕Prelich G,Tan C K,Kostura R,et al. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase:an auxiliany protein.Nature，1987,326: 517-520., 百拇医药
摘 要：目的：探讨依那普利延缓肾小球硬化的有效性。方法：运用免疫组化方法观察依那普利对5/6肾切除大鼠残肾模型早、中期细胞外基质(ECM)蓄积及其部分调控机制的影响。结果：残肾模型术后1周开始给予依那普利，术后5周大鼠尿蛋白显著降低〔(2.01±0.13)g/24 h比(3.10±0.17)g/24 h〕；病理结果示ECM多种成分的蓄积显著减少，肾小球硬化减轻(硬化指数SI为1.67±0.76比2.00±0.75, P<0.05)。肾小球内细胞数〔(72.28±13.70)个/肾小球横截面比(81.16±16.62)个/肾小球横截面〕及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数〔(6.76±2.72)个/肾小球横截面比(8.16±2.78)个/肾小球横截面〕均显著减少(P均<0.01)。结论：依那普利能延缓肾小球硬化，减少残肾ECM蓄积可能是其作用机制之一。
关键词：依那普利 细胞外基质 肾小球硬化
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细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肾小球内进行性蓄积是肾小球硬化的病理特征之一。本研究通过观察依那普利对5/6肾切除大鼠残肾模型早、中期ECM蓄积及其部分调控机制的影响，探讨其延缓肾小球硬化的有效性和作用环节。
1 材料与方法
1.1 动物：SD雄性大鼠，体重160～200 g，购自第一军医大学动物所。
1.2 受试药物：依那普利为默沙东(澳大利亚)公司美国默克公司分部生产，每片10 mg，临用前用蒸馏水配制成0.4 g/L药液。
1.3 造模及分组：大鼠随机分为假手术组、模型组和依那普利组。各组自由饮水，饲以标准蛋白饲料。除假手术组外，其余各组行5/6肾切除进行制模，即用戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射将大鼠麻醉，分离左肾，行上下极肾切除，明胶海绵压迫止血，1周后切除右肾。术后1周根据尿蛋白含量及体重将动物随机分组，各组施以相应的受试因素：假手术组(n=6)及模型组(n=6)给予蒸馏水10 ml/kg，依那普利组(n=6)给予依那普利5 mg/kg。各组动物每日灌胃1次，连续4周，4周末用代谢笼收集24小时尿液，测量尿量，留取尿样测尿蛋白；腹主动脉取血测尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)；取肾标本作光镜及免疫组化检测。
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1.4 指标检测：
1.4.1 生化指标：BUN测定用脲酶Berthelot比色法(试剂盒由卫生部上海生物制品研究所生产)；肌酐测定用Jaffe氏反应法(试剂盒由宁波市临床检验中心监制)；尿蛋白测定用三氯醋酸比浊法(三氯醋酸由广州医药站监制，批号850901)。测试仪器为752紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.4.2 肾组织形态学检测：用于光镜及免疫组化的肾组织标本用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3 μm切片作HE和PAS染色，计数每一肾小球横截面细胞核总数(细胞核数少于50的肾小球删除〔1〕)；按文献〔1〕报道半定量计分法测量肾小球硬化指数，每只动物计数25个肾小球，取平均值。
1.4.3 免疫组化染色：试剂：一抗有兔抗大鼠Ⅰ型胶原(博士德公司产品)，既用型；小鼠抗大鼠Ⅳ型胶原(DAKO公司产品)，工作浓度1∶100；兔抗大鼠层粘连蛋白(Sigma公司产品)，既用型；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA，ZYMED公司产品)，既用型。二抗有生物素化山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG(博士德公司产品)，工作浓度为1∶100。SABC试剂盒(博士德公司产品)。
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方法：4 μm石蜡切片，常规脱蜡至水，蒸馏水新鲜配制3%H2O2以灭活内源性酶；修复抗原；滴加1∶50正常山羊血清封闭液，室温20分钟；滴加适当稀释的一抗，室温1～2小时或4 ℃过夜，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)冲洗；滴加1∶100生物素化山羊抗小鼠IgG(或其它与一抗对应的二抗)，室温30分钟，PBS冲洗；滴加试剂1∶100 SABC，室温30分钟，PBS冲洗；DAB显色，镜下控制反应时间，水洗；苏木素轻度复染、脱水、透明、封片、显微镜下观察。阴性对照组以正常兔IgG及PBS代替一抗。每组取3只动物，每张切片至少观察25个肾小球，PCNA阳性细胞采用直接计数法，其余各指标按文献〔1〕报道半定量计分：0：肾小球染色无定位性增加；1+：1%～25%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；2+：25%～50%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；3+：50%～70%肾小球血管袢呈局灶增强的染色；4+：>75%肾小球血管袢呈强染色。
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1.5 统计学方法：计量资料采用方差分析，对不满足参数统计条件的资料比较用秩和检验，连续变量作相关分析，全部统计采用SPSS统计软件完成。
2 结 果
2.1 制模后5周血BUN、SCr、尿蛋白含量变化见表1。结果示模型组和依那普利组BUN、SCr均显著高于假手术组(P<0.05或P<0.01)；依那普利组与模型组上述指标比较差异无显著性(P均>0.05)；模型组和依那普利组尿蛋白均极显著高于假手术组(P均<0.01),依那普利组尿蛋白则极显著低于模型组(P<0.01)。
表1 3组大鼠制模后5周血BUN、SCr和尿蛋白含量比较(X±s)
组别
动物数(只)
BUN(mmol/L)
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SCr(μmol/L)
尿蛋白(g/24h)
假手术组
6
7.42±1.35
65.71±13.29
0.14±0.02
模型组
6
16.61±3.55**
93.11± 9.68**
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3.10±0.17**
依那普利组
6
14.07±1.17**
88.11±6.17*
2.01±0.13**△△
注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01
2.2 肾脏病理改变：光镜下，假手术组大鼠肾小球血管壁正常，系膜细胞无增生，间质无明显炎症细胞浸润(图1)。模型组则可见包氏囊扩张，肾小球血管袢狭窄、闭塞，管壁增厚，细胞大量增生，基质增多，系膜区增宽，间质炎症细胞浸润，近曲小管浊肿，有大量管型(图2)。依那普利组肾小球毛细血管袢充血较显著，部分管袢增厚，管腔变窄，系膜区增宽，间质炎症细胞浸润较少，管型多(图3)；表2示肾小球硬化指数在制模各组均显著高于假手术组(P均<0.01)，依那普利组则显著低于模型组(P<0.05)。
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图1 假手术组肾病理改变(PAS×200)
图2 模型组肾病理改变(PAS×200)
图3 依那普利组肾病理改变(PAS×200)
表2 3组大鼠肾小球硬化指数及ECM成分比较(X±s)
组别
动物数(只)
肾小球硬化指数
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Ⅰ型胶原(分)
Ⅳ型胶原(分)
层粘连蛋白(分)
假手术组
6
0.12±0.32
0.08±0.27
1.33±0.45
1.29±0.46
模型组
6
2.00±0.75**
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0.64±0.53**
2.61±0.59**
2.64±0.56**
依那普利组
6
1.67±0.76**△
0.43±0.49**△
2.37±0.49**△
2.13±0.64**△△
注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01
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2.3 肾小球ECM半定量分析：假手术组中，Ⅰ型胶原主要在肾间质和血管壁表达，肾小球内一般无表达或极少量表达(0～1级，图4)，造模后各组动物肾小球内均有少量Ⅰ型胶原表达(图5、6)，主要出现在系膜区，从表2半定量结果可见,与假手术组比较均有极显著差异(P均<0.01)；而依那普利组显著低于模型组 (P<0.05)；层粘连蛋白与Ⅳ型胶原正常在肾小管基底膜、肾小球内毛细血管基底膜表达(1～2级)。制模后，两种胶原在肾小球内表达增加，其染色增加的区域通常与细胞增生区域有关。半定量结果示依那普利组Ⅳ型胶原及层粘连蛋白在肾小球内的表达显著低于模型组(P<0.05和P<0.01，图7～12)。
图4 假手术组肾I型胶原结果(×200)
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图5 模型组肾I型胶原结果(×200)
图6 依那普利组肾I型胶原结果(×200)
图7 假手术组肾IV型胶原结果(×200)
图8 模型组肾IV型胶原结果(×200)
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图9 依那普利组肾IV型胶原结果(×200)
图10 假手术组肾层粘连蛋白结果(×200)
图11 模型组肾层粘连蛋白结果(×200)
图12 依那普利组肾层粘连蛋白结果(×200)
2.4 肾小球细胞增生定量分析：假手术组肾小球细胞无明显增生，PCNA阳性细胞少见。模型组肾小球细胞数显著增加，同时PCNA阳性细胞数亦显著增加。依那普利组肾小球内细胞总数及PCNA阳性细胞数显著低于模型组(P均<0.01)。肾小球细胞增生与PCNA阳性细胞表达之间呈显著正相关(r＝0.379，P<0.01)。
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表3 3组大鼠肾小球总细胞数和PCNA阳性细胞数比较(X±s)
组别
动物数
(只)
肾小球总细胞数
(个/肾小球横截面)
PCNA阳性细胞数
(个/肾小球横截面)
假手术组
6
56.03±6.43
1.83±1.49
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模型组
6
81.16±16.62**
8.16±2.78**
依那普利组
6
72.28±13.70**△△
6.76±2.72**△△
注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01
3 讨 论
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ECM从形态上分为肾小球基底膜、系膜基质和包氏囊基底膜；生化上则由胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖构成，在维持正常的肾小球形态及功能上起着重要作用〔2〕。在各种慢性进行性肾小球疾病中，系膜基质的改变是导致肾小球硬化的共同途径。蓄积的ECM包括正常肾小球具有的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等，也含有Ⅰ、Ⅲ型间质胶原型〔3〕。本实验应用免疫组化方法,通过对Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的检测，发现正常大鼠肾小球内含有Ⅳ型胶原和层粘连蛋白；而Ⅰ型胶原主要在肾间质和血管壁表达，在肾小球内不表达。残肾模型术后5周，肾小球内Ⅳ型胶原及层粘连蛋白显著增多，且与肾小球硬化指数呈正相关。同时肾小球内出现Ⅰ型胶原，结果与文献报道〔1〕一致。残肾模型术后1周开始给予依那普利，术后5周尿蛋白显著降低；病理结果示ECM多种成分的蓄积显著减少，肾小球硬化减轻。提示依那普利能减少ECM蓄积，减缓肾小球硬化的发生。
在进行性肾小球疾病的初起阶段，多数情况下可以发现肾小球内有细胞增殖，随后出现ECM增加。提示ECM增多与细胞增殖有关〔1〕。肾小球系膜细胞、上皮细胞，尤其是系膜细胞在肾小球内ECM聚集中可能起重要作用。培养的系膜细胞能够合成多种ECM成分，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原，层粘连蛋白及各种糖蛋白等〔4〕。PCNA是一种细胞DNA聚合酶的辅助蛋白，其作用是促进DNA聚合酶链延伸DNA链，且有增强DNA聚合酶活性的作用，它在S期的细胞核中达到高峰，因此可作为判断S期DNA含量及细胞增殖分裂的一个标志〔5〕。Floege等〔1〕报道，在5/6肾切除术后5日，PCNA染色提示细胞开始增生，2周内达高峰，以后逐渐降低但仍然高于对照动物，直至第10周；细胞总数在术后第2周时开始显著增加，之后继续增加；运用双重免疫组化染色结果显示残肾中增生的细胞主要是系膜细胞。本研究资料发现，残肾肾小球细胞显著增多，PCNA阳性细胞也显著增多，ECM蓄积常常与细胞增生区域有关。虽然本实验未行双重免疫组化染色确定增生细胞的类型，但结合国内外报道的结果，提示系膜细胞增生可能是本模型ECM蓄积的主要原因之一。使用依那普利后肾小球内细胞数及PCNA阳性细胞数显著减少，提示减少细胞增生是其减少ECM蓄积、减轻肾小球硬化的作用机制之一。
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基金项目：广东省中医药局科研基金资助项目(99556)
作者简介：阳 晓(1961-)，女(汉族)，湖南株洲人，博士，副教授，副主任医师，现为广州中山医科大学第一附属医院肾脏病研究所博士后。主要从事中西医结合肾脏病研究;获省科技成果二等奖1项，三等奖4项；共发表学术论文28篇。湖南省中西医结合肾病跨世纪学科带头人后备人选。
阳晓(中山医科大学第一附属医院肾内科卫生部重点实验室，广东 广州 510080)
叶任高(中山医科大学第一附属医院肾内科卫生部重点实验室，广东 广州 510080)
魏毅(第一军医大学，广东 广州 510515)
张进华(第一军医大学，广东 广州 510515)
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刘晓文(第一军医大学，广东 广州 510515)
参考文献：
〔1〕Floege J,Johnson R J,Gordon K,et al.Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis.Kidney Int,1991,40:477-488.
〔2〕Floege J,Burns M W,Alpers C E,et al.Glomerular cell proliferation and PDGF expression precede glomerulosclerosis in the remnant kidney model.Kidney Int,1992,41:297-309.
〔3〕Rosenblum N D.The mesangial matrix in the normal and sclerotic glomerulus. Kidney Int,1994,(Suppl 45):S73-S77.
〔4〕Ishimura E,Sterzel J,Budde Y,et al.Formation of extracelluar matrix by cultured rat mesangial cells.Am J Pathol，1989,134:843-849.
〔5〕Prelich G,Tan C K,Kostura R,et al. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase:an auxiliany protein.Nature，1987,326: 517-520., 百拇医药