用同工酶技术鉴定滇产菟丝子
作者：郭凤根 李扬汉
单位：郭凤根(云南农业大学农学院(昆明 650201)；李扬汉(南京农业大学农学系)
关键词：过氧化物酶同工酶；谷草转氨酶同工酶；菟丝子鉴定
中草药000739摘 要 采用过氧化物酶同工酶和谷草转氨酶同工酶分析技术鉴定了产 于云南的3种7份菟丝子材料，结果表明用同工酶技术鉴定菟丝子是一种新的行之有效的方法。
Identification of Cuscuta L. by I sozyme Analysis
Guo Fenggen
(College of Agronomy, Yunnan Agricultural University Kunming 650201)
, 百拇医药
Li Yanghan
(Department of Agronomy, Nanjing Agricultural University)
Abstract 7 samples of 3 species of Yunnan dodders were ident if ied by peroxidase isozyme and glutamic oxalacetate transaminase isozyme analysis . The results showed that isozyme analysis was a new and effective method to ide ntify these dodders.
Key words peroxidase isozyme isozyme of glutamic oxalacetate transaminase dodder identification
, 百拇医药
菟丝子 Cuscuta spp.是一类重要的中草药资源，具有补肝 肾、益精、明目、安胎等功效[1]。关于菟丝子种类的鉴定，已报道过花粉形态 [2]、种子表面超微结构[3]、种皮显微特征[4]、薄层层析[5 ]、紫外光谱法[6]和蛋白质纸上电泳[7]等方法或技术，但用同工酶技 术鉴定菟丝子尚未见报道。作者进行了用同工酶技术鉴定菟丝子的尝试，效果很好。现将结 果作一报道。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理：从云南各地收集到3种7份菟丝子种子(表1)，用浓硫酸处理20～30 mi n以打破休眠，用清水漂洗干净后把种子置于垫有潮湿滤纸的培养皿中，于 25 ℃生化培养 箱中培养，每天光照 12 h。约 3 d 后待菟丝子茎尖从种皮中伸出时取幼苗制样。
, 百拇医药
表1 供试菟丝子材料 编号
中名
拉丁学名
产地
1
菟 丝 子
Cuscuta chinensis Lam.
云南省 宾川县
2
金 灯 藤
C. japonica Choisy
云南省景洪 市
, 百拇医药
3
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省玉溪市
4
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省大理市
5
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省昆明市
, 百拇医药
6
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省呈贡县
7
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省路南县
1.2 聚丙烯酰胺凝胶的制备：按胡能书等介绍的方法[8]制备聚丙烯酰胺凝胶， 规格为13.5 cm×23.5 cm×0.1 cm， 每板 12 个点样槽，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度因酶而异： 过氧化物酶同工酶(POD) 7 %；谷草转氨酶同工酶(GOT) 6%。
, 百拇医药
1.3 酶液的制备：取菟丝子幼苗 0.5 g，放入蒸馏水中冲洗，滤纸吸干后放入预冷的小 研钵中，加 10 滴 1% β-巯基乙醇和 10 滴浓电极缓冲液，冰浴研磨匀浆，10 000 r/min 离心 10 min 后取上清液作酶液备用。
1.4 点样、电泳和染色：用 50 μL 微量进样器吸取酶液点在样品槽内，每槽 1 个样品 ；点完样吸取电极缓冲液缓缓加在样品上至点样槽满，然后再加电极缓冲液使电路接通，以 溴 酚蓝作指示剂，用稳压稳流电泳仪稳流电泳，浓缩胶时每槽 1 mA，到分离胶时加大电流至 每 槽 2 mA，约需 5 h后当溴酚蓝移至离玻板下端 1 cm 处时停止电泳。POD 染色液配方是 5 mL 联苯胺贮存液 +2 mL 3% H2O2+93 mL 蒸馏水，室温下染色 5 min； GOT 染色液配 方是吡哆醛-5′-磷酸盐 2 mg+α-酮戊二酸 200 mg+L-天冬氨酸 4 00 mg+坚牢蓝 BB 60 0 mg+0.2 mol/L Tris-HCL 缓冲液 (pH 8.0) 100 mL，凝胶在染色液中于 37 ℃下恒温染 色 10 min[9，10]。
, 百拇医药
1.5 电泳结果的记录和保存：将染完色的同工酶凝胶用 7% 醋酸进行漂洗和固定；测定酶 带迁移距离和指示剂迁移距离，两者相除即得相对迁移率(Rf值)；拍摄凝胶照片，绘制酶谱 示意图；制干胶片供永久保存。
2 结果与分析
2.1 过氧化物酶同工酶(POD)：7份菟丝子试材的过氧化物酶同工酶的电泳酶谱见图1-Ⅰ ，共 有 15 条 POD 酶带，其中 Rf 值为 0.059 的第一条酶带为所有试材所共有，是菟丝子的 特征带。菟丝子 POD 酶带根据迁移率的大小可分为慢带区(Rf 值<0.15)、中间带区(0.1 5～0.4)和快带区 (0.4～0.7) 3个区域。菟丝子 (No.1) 仅有 2 条酶带，均位于慢带区 ：金灯藤 (No.2) 有 14 条酶带，分布在3个区中；大花菟丝子 (No.3～7) 有 2～5 条酶带 ，分布在3个区中，其中 Rf 值为 0.196 的酶带为大花菟丝子的共有带。
, 百拇医药
图1 电泳酶谱
2.2 谷草转氨酶同工酶(GOT)：7份菟丝子试材的谷草转氨酶同工酶电泳酶谱见图1-Ⅱ， 它们 共有5条酶带，Rf值为0.61的酶带是菟丝子 GOT 的特征带。菟丝子 (No.1) 具有 Rf 值为0 .54 和 0.61 的 2 条酶带；金灯藤 (No.2) 有 4 条酶带， Rf 值分别为0.34，0.54，0.61 和 0.71；5份大花菟丝子中有 4 份的酶谱完全相同，都有 2 条强 带和 1 条 弱带，仅云南产大花菟丝子除具有这 3 条酶带外还具有 Rf 值为 0.54 的强带。
3 讨论
3.1 菟丝子等小粒菟丝子的种子一般都很小，用种子来鉴定难度很大；金灯藤和大花菟丝 子等大粒菟丝子的种子虽然较大，但两者极为相似，用显微方法较难区分。黄建中等[ 3]提出了应用扫描电镜观察菟丝子种子表面超微结构，并依据超微结构进行检疫、鉴定 的新方法，该法效果很好，但由于电镜设备非一般单位所具有，测试价格也比较高，所以其 应用受到了一定的限制。作者以产于云南省的 3 种菟丝子的 7 份种子为试材，先让其萌发 长成幼苗，制样分析了过氧化物酶同工酶和谷草转氨酶同工酶 2 种酶系统，酶带分离效果 好，重复性也好，而且设备简单，操作方便，分析技术也都比较成熟，可作为菟丝子鉴定的 新方法加以应用。
, 百拇医药
3.2 菟丝子分种检索表
3.2.1 过氧化物酶同工酶分种检索表
1.有 1 条 Rf 值为 0.108 的酶带。
2.仅有 2 条酶带………………………………菟丝子
2.酶带数多，9～14条…………………………金灯藤
1.不具 Rf 值为 0.108 的酶带…………………大花菟丝子
3.2.2 谷草转氨酶同工酶分种检索表
1.有 1 条 Rf 值为 0.34 的酶带………………金灯藤
1.不具有 Rf 值为 0.34 的酶带。
, 百拇医药
2.仅有 2 条酶带………………………………菟丝子
2.有 3 条或 4 条酶带………………………大花菟丝子
郭凤根 男，1964年6月生于浙江平湖。1998年7月从南京农业大学农学系植物学专业毕业， 并获理学博士学位。1996年11月起任云南农业大学农学院副教授。主要从事资源植物学的教 学和科研工作，曾主持或参与了8 项国家自然科学基金课题或省部级科研课题的研究工作， 在各级学术刊物上发表学术论文30 篇，许多论文被《Agris》、《Weed Abstracts》、《Bi ocontrol News and Information》、《Chemical Abstracts》、《中国生物学文摘》和《 中国农业文摘》等中外检索刊物收录。
参考文献
1，金 晓，李家实，阎文玫.中国中药杂志，1992，17(5)：292
, http://www.100md.com
2，张芝玉，郭 澄，苏中武，等.广西植物，1991，11(4)：308
3，黄建中，李扬汉，章毓英.植物分类学报，1993，31(3)：261
4，金 晓，李家实，阎文玫.中国中药杂志，1990，15(4)：9
5，郭 澄，苏中武，李承祜，等.基层中药杂志，1992，6(3)：12
6，郭 澄，苏中武，李承祜.中草药，1991，22(12)：553
7，张淑华，李连怀，常广敬，等.河北医学院学报，1988，9(4)：169
8，胡能书，万贤国编.同工酶技术及其应用.长沙：湖南科技出版社，19 85：1
9，沈全光.植物生理学通讯，1980(4)：59
10，黄庆榴.植物生理学实验手册.上海：上海科技出版社，1985：344
(1999-06-28收稿), http://www.100md.com
单位：郭凤根(云南农业大学农学院(昆明 650201)；李扬汉(南京农业大学农学系)
关键词：过氧化物酶同工酶；谷草转氨酶同工酶；菟丝子鉴定
中草药000739摘 要 采用过氧化物酶同工酶和谷草转氨酶同工酶分析技术鉴定了产 于云南的3种7份菟丝子材料，结果表明用同工酶技术鉴定菟丝子是一种新的行之有效的方法。
Identification of Cuscuta L. by I sozyme Analysis
Guo Fenggen
(College of Agronomy, Yunnan Agricultural University Kunming 650201)
, 百拇医药
Li Yanghan
(Department of Agronomy, Nanjing Agricultural University)
Abstract 7 samples of 3 species of Yunnan dodders were ident if ied by peroxidase isozyme and glutamic oxalacetate transaminase isozyme analysis . The results showed that isozyme analysis was a new and effective method to ide ntify these dodders.
Key words peroxidase isozyme isozyme of glutamic oxalacetate transaminase dodder identification
, 百拇医药
菟丝子 Cuscuta spp.是一类重要的中草药资源，具有补肝 肾、益精、明目、安胎等功效[1]。关于菟丝子种类的鉴定，已报道过花粉形态 [2]、种子表面超微结构[3]、种皮显微特征[4]、薄层层析[5 ]、紫外光谱法[6]和蛋白质纸上电泳[7]等方法或技术，但用同工酶技 术鉴定菟丝子尚未见报道。作者进行了用同工酶技术鉴定菟丝子的尝试，效果很好。现将结 果作一报道。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理：从云南各地收集到3种7份菟丝子种子(表1)，用浓硫酸处理20～30 mi n以打破休眠，用清水漂洗干净后把种子置于垫有潮湿滤纸的培养皿中，于 25 ℃生化培养 箱中培养，每天光照 12 h。约 3 d 后待菟丝子茎尖从种皮中伸出时取幼苗制样。
, 百拇医药
表1 供试菟丝子材料 编号
中名
拉丁学名
产地
1
菟 丝 子
Cuscuta chinensis Lam.
云南省 宾川县
2
金 灯 藤
C. japonica Choisy
云南省景洪 市
, 百拇医药
3
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省玉溪市
4
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省大理市
5
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省昆明市
, 百拇医药
6
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省呈贡县
7
大花菟丝子
C. reflexa Roxb.
云南省路南县
1.2 聚丙烯酰胺凝胶的制备：按胡能书等介绍的方法[8]制备聚丙烯酰胺凝胶， 规格为13.5 cm×23.5 cm×0.1 cm， 每板 12 个点样槽，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度因酶而异： 过氧化物酶同工酶(POD) 7 %；谷草转氨酶同工酶(GOT) 6%。
, 百拇医药
1.3 酶液的制备：取菟丝子幼苗 0.5 g，放入蒸馏水中冲洗，滤纸吸干后放入预冷的小 研钵中，加 10 滴 1% β-巯基乙醇和 10 滴浓电极缓冲液，冰浴研磨匀浆，10 000 r/min 离心 10 min 后取上清液作酶液备用。
1.4 点样、电泳和染色：用 50 μL 微量进样器吸取酶液点在样品槽内，每槽 1 个样品 ；点完样吸取电极缓冲液缓缓加在样品上至点样槽满，然后再加电极缓冲液使电路接通，以 溴 酚蓝作指示剂，用稳压稳流电泳仪稳流电泳，浓缩胶时每槽 1 mA，到分离胶时加大电流至 每 槽 2 mA，约需 5 h后当溴酚蓝移至离玻板下端 1 cm 处时停止电泳。POD 染色液配方是 5 mL 联苯胺贮存液 +2 mL 3% H2O2+93 mL 蒸馏水，室温下染色 5 min； GOT 染色液配 方是吡哆醛-5′-磷酸盐 2 mg+α-酮戊二酸 200 mg+L-天冬氨酸 4 00 mg+坚牢蓝 BB 60 0 mg+0.2 mol/L Tris-HCL 缓冲液 (pH 8.0) 100 mL，凝胶在染色液中于 37 ℃下恒温染 色 10 min[9，10]。
, 百拇医药
1.5 电泳结果的记录和保存：将染完色的同工酶凝胶用 7% 醋酸进行漂洗和固定；测定酶 带迁移距离和指示剂迁移距离，两者相除即得相对迁移率(Rf值)；拍摄凝胶照片，绘制酶谱 示意图；制干胶片供永久保存。
2 结果与分析
2.1 过氧化物酶同工酶(POD)：7份菟丝子试材的过氧化物酶同工酶的电泳酶谱见图1-Ⅰ ，共 有 15 条 POD 酶带，其中 Rf 值为 0.059 的第一条酶带为所有试材所共有，是菟丝子的 特征带。菟丝子 POD 酶带根据迁移率的大小可分为慢带区(Rf 值<0.15)、中间带区(0.1 5～0.4)和快带区 (0.4～0.7) 3个区域。菟丝子 (No.1) 仅有 2 条酶带，均位于慢带区 ：金灯藤 (No.2) 有 14 条酶带，分布在3个区中；大花菟丝子 (No.3～7) 有 2～5 条酶带 ，分布在3个区中，其中 Rf 值为 0.196 的酶带为大花菟丝子的共有带。
, 百拇医药
图1 电泳酶谱
2.2 谷草转氨酶同工酶(GOT)：7份菟丝子试材的谷草转氨酶同工酶电泳酶谱见图1-Ⅱ， 它们 共有5条酶带，Rf值为0.61的酶带是菟丝子 GOT 的特征带。菟丝子 (No.1) 具有 Rf 值为0 .54 和 0.61 的 2 条酶带；金灯藤 (No.2) 有 4 条酶带， Rf 值分别为0.34，0.54，0.61 和 0.71；5份大花菟丝子中有 4 份的酶谱完全相同，都有 2 条强 带和 1 条 弱带，仅云南产大花菟丝子除具有这 3 条酶带外还具有 Rf 值为 0.54 的强带。
3 讨论
3.1 菟丝子等小粒菟丝子的种子一般都很小，用种子来鉴定难度很大；金灯藤和大花菟丝 子等大粒菟丝子的种子虽然较大，但两者极为相似，用显微方法较难区分。黄建中等[ 3]提出了应用扫描电镜观察菟丝子种子表面超微结构，并依据超微结构进行检疫、鉴定 的新方法，该法效果很好，但由于电镜设备非一般单位所具有，测试价格也比较高，所以其 应用受到了一定的限制。作者以产于云南省的 3 种菟丝子的 7 份种子为试材，先让其萌发 长成幼苗，制样分析了过氧化物酶同工酶和谷草转氨酶同工酶 2 种酶系统，酶带分离效果 好，重复性也好，而且设备简单，操作方便，分析技术也都比较成熟，可作为菟丝子鉴定的 新方法加以应用。
, 百拇医药
3.2 菟丝子分种检索表
3.2.1 过氧化物酶同工酶分种检索表
1.有 1 条 Rf 值为 0.108 的酶带。
2.仅有 2 条酶带………………………………菟丝子
2.酶带数多，9～14条…………………………金灯藤
1.不具 Rf 值为 0.108 的酶带…………………大花菟丝子
3.2.2 谷草转氨酶同工酶分种检索表
1.有 1 条 Rf 值为 0.34 的酶带………………金灯藤
1.不具有 Rf 值为 0.34 的酶带。
, 百拇医药
2.仅有 2 条酶带………………………………菟丝子
2.有 3 条或 4 条酶带………………………大花菟丝子
郭凤根 男，1964年6月生于浙江平湖。1998年7月从南京农业大学农学系植物学专业毕业， 并获理学博士学位。1996年11月起任云南农业大学农学院副教授。主要从事资源植物学的教 学和科研工作，曾主持或参与了8 项国家自然科学基金课题或省部级科研课题的研究工作， 在各级学术刊物上发表学术论文30 篇，许多论文被《Agris》、《Weed Abstracts》、《Bi ocontrol News and Information》、《Chemical Abstracts》、《中国生物学文摘》和《 中国农业文摘》等中外检索刊物收录。
参考文献
1，金 晓，李家实，阎文玫.中国中药杂志，1992，17(5)：292
, http://www.100md.com
2，张芝玉，郭 澄，苏中武，等.广西植物，1991，11(4)：308
3，黄建中，李扬汉，章毓英.植物分类学报，1993，31(3)：261
4，金 晓，李家实，阎文玫.中国中药杂志，1990，15(4)：9
5，郭 澄，苏中武，李承祜，等.基层中药杂志，1992，6(3)：12
6，郭 澄，苏中武，李承祜.中草药，1991，22(12)：553
7，张淑华，李连怀，常广敬，等.河北医学院学报，1988，9(4)：169
8，胡能书，万贤国编.同工酶技术及其应用.长沙：湖南科技出版社，19 85：1
9，沈全光.植物生理学通讯，1980(4)：59
10，黄庆榴.植物生理学实验手册.上海：上海科技出版社，1985：344
(1999-06-28收稿), http://www.100md.com
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