人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达
作者：张春艳 李树浓 宁波 张志方 曹开源
单位：张春艳 宁波 曹开源(中山医科大学免疫学教研室)；李树浓(病理生理教研室)；张志方(生理教研室, 广东 广州 510089)
关键词：人CD154；融合蛋白；基因表达；克隆，分子
中国病理生理杂志000801 [摘 要] 目的：为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154 -GST)，用于人CD154单克隆抗体研制。方法：根据人CD154基因序列设计合成特异性引物，RT-PCR扩增人CD154基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154；用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，转化菌落经BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154 cDNA；将其克隆至pGEX-4T-1质粒中，经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因；IPTG诱导后的大肠杆菌经 SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。 结论：成功构建了人CD154-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白，为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。
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[中图分类号] Q754 [文献标示码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0673-05
Cloning of hCD154 gene from human activated peripheral
blood mononuclear cell and expression of hCD154-GST
fusion protein in prokaryote
ZHANG Chun-yan，NING Bo，CAO Kai-yuan
(Department of ImmunologyGuangzhou 510089, China)
, 百拇医药
LI Shu-nong
(Department of PathphysiologyGuangzhou 510089, China)
ZHANG Zhi-fang
(Department of Physiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM：To express recombinant hCD154-GST fusion protein, to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, and to investigate the effect of anti-hCD154 monoclonal antibody on graft rejection. METHODS AND RESULTS: Total RNA was prepared from human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activated with 10ng/mL PMA and 1 μg/mL PHA for 8h, the total RNA was reversetranscribed to cDNA. The entire coding region and a part of the 3'non-coding regions were amplified by PCR using a pair of primers designed and synthesized according to the sequence of human CD154 gene from gene bank. The amplified product, a 820bp DNA fragment was cloned into pGEX-4T-1 plasmid expressing glutathione S-transferase(GST). The cloned insert was identified by double digestion of the cloned pGEX-4T-1 plasmid with retriction enzymes BamHⅠand EcoRⅠ.The fusion protein expression plasmid of PGEX-4T-1/hCD154 was constructed, then transformed to E coli BL21. The human CD154-GST fusion protein expression was induced by IPTG in BL21. The expression of recombinant 26kD GST and 55kD human CD154-GST fusion protein were confirmed by SDS-PAGE. CONCLUSION: We have express the recombinant human CD154-GST fusion protein. The expressed hCD154-GST fusion protein will be used to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, to investigate the role of anti-CD154 monoclonal antibody on graft rejection.
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[MeSH] Human CD154; Fusion protein; Gene expression; Cloning, molecular
移植排斥反应发生的主要机制是T细胞介导的免疫应答。CD154是一种分子量为29～39 kD的II型跨膜糖蛋白，主要存在于激活的T细胞，它是CD40分子的配体。研究表明[1，2]，在免疫应答过程中，T细胞上的CD154分子与抗原呈递细胞上的CD40分子结合，信号通过CD40分子传递，引起抗原呈递细胞上B7分子的表达，B7分子与T细胞上的CD28分子结合，为T细胞的活化提供第二信号。业已证明[3，4]，CD154抗体可以阻断CD40与CD154分子的结合，使CD40信号传递中断，B7分子不能表达，T细胞缺乏第二活化信号，导致T细胞无反应性。因此，探讨CD154单克隆抗体抗移植排斥反应作用已成为移植免疫研究领域中的一个新的热点[5，6]。我们构建全长的人CD154 cDNA原核表达质粒，表达人GST-CD154融合蛋白，为制备人CD154单克隆抗体，进而研制成新的免疫抑制剂打下基础。
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材 料 和 方 法
一、 菌株和质粒
大肠杆菌BL21和DH5α为本实验室保存；pGEX-4T-1质粒为Pharmercia公司产品。
二、主要试剂
各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、标准分子量蛋白、均购自上海生工生物工程有限公司。RPMI1640细胞培养基购自GIBCO公司。其他常规化学试剂为分析纯以上产品。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
三、 人外周血淋巴细胞总RNA提取
自健康人外周血分离淋巴细胞，加入植物凝集素(phytohamagglutinin,PHA)1 μg/mL和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate、PMA)10 ng/mL激活，37℃培养8 h后，收集培养细胞，按异硫氢酸胍一步法提取总RNA，紫外分光光度计定量[7]。
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四、 引物的设计和反转录PCR
根据基因库(GenBank, 登录号X67878.DNA)中人 CD154(hCD154)基因序列，设计合成一对引物，5’端引物含有BamH I酶切位点和起始密码，3’端引物含有EcoR I酶切位点和终止密码。以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，扩增条件：95℃变性60 s，55℃退火50 s，72℃延伸60 s，循环33次。取PCR产物5 μL在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分析仪检测电泳结果。
五、 pGEX-4T-1/CD154表达质粒的构建
选用谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-trabsferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,将载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，T4连接酶连接反应18℃, 16 h，构建重组质粒pGEX-4T-1/CD154。
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六、 大肠杆菌的转化及重组质粒的酶切鉴定
制备感受态的大肠杆菌BL21细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴30 min，40 ℃热休克90 s，再放冰上2 min；转入LB培养基中，37 ℃ 45 min摇菌培养后，将菌液铺于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃过夜，次日观察菌落，并挑取6个菌落培养后，提取质粒经BamH I和EcoR I双酶切，通过限制性内切酶图谱分析和PCR扩增，鉴定感受态细胞是否插入目的基因[8]。
七、 重组质粒DNA序列测定
取经鉴定含有目的基因的重组质粒进行序列分析。
八、 人CD154-GST融合蛋白的诱导表达
分别将含有pGEX-4T-1/CD154质粒和pGEX-4T-1空载体的菌株放入氨苄青霉素2×YTG培养基中37℃过夜摇菌培养，次日按1：100稀释培养过夜的菌液转种，培养2h，菌液OD600=0.4～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至终浓度为0.2 mmol/L,未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养，分别于2 h和4 h，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。
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结 果
一、 RT-PCR扩增hCD154 cDNA
PCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片段与预期的一致，为820bp (图1)。
Fig 1 Agarose gel electrophoresis map of PCR products
M: 1 kb DNA ladder
1. PCR products with recombinant plasmid
2. RT-PCR products
图1 PCR产物凝胶电泳
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二、pGEX-4T-1/CD154重组质粒的构建和酶切鉴定
pGEX-4T-1载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，经T4连接酶连接，连接产物转化后的大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日观察到pGEX-4T-1/CD154质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上，分别取pGEX-T-1/CD154和pGEX-4T-1质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经0.1%的琼脂糖凝胶电泳，可见经BamH I和EcoR I双酶切后，成为两个片段，分别为4.9kb的pGEX-4T-1和820bp的人CD154基因片段,与理论值相符(图2)。
Fig 2 Restriction map of recombinant plasmid
, 百拇医药 M: 1 kb DNA ladder
1.RT-PCR products
2.Expression plasmid pGEX-4T-1/CD154 digested by BamHⅠand EcoRⅠ
3.Plasmid pGEX-4T-1 degested by BamH I
M: Lambda DNA/Eco911(BstEII) Mark
图2 重组质粒pGEX-4T-1/CD154的酶切分析
三、重组质粒DNA序列测定
重组表达质粒测序结果如图4所示，重组质粒中所含的目的基因片段与国外报道[9]的人CD154 cDNA序列完全一致，对阅读框架分析，证明该重组质粒已正向插入目的基因，肯定了该重组表达质粒能正确表达人CD154-GST融合蛋白。
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四、人CD154-GST融合蛋白的诱导表达
含质粒pGEX-4T-1/CD154的菌株和含质粒pGEX-4T-1的菌株经IPTG诱导后，进行10%SDS-PAGE分析，结果表明，分别在分子量约为55kD(融合蛋白)和26kD(GST)处有特异的蛋白质表达条带，而未经诱导的PGEX-4T-1/CD154无条带产生(图3)。说明pGEX-4T-1/CD154在宿主菌BL21中可表达重组人CD154-GST融合蛋白。
Fig 3 Analysis of hCD154-GST fusion protein expressing products by SDS-PAGE
M: protein marker
1,2 lane: lysate of E coli BL-21 cells
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3,4 lane: 55kD hCD154-GST expression products in lysate of E coli BL-21 cell induced by IPTG 4h and 2h
5,6 lane: 26kD GST expression products in lysate of E coli BL-21 cell induced by IPTG 2h
图3 大肠杆菌BL21中pGEX-4T-1/CD154表达产物的SDS-PAGE分析
讨 论
基于人CD154和CD40分子之间相互作用在T、B细胞活化过程中的重要作用，采用抗CD154单克隆抗体阻止它们之间的相互作用从而达到抑制淋巴细胞活化的目的越来越受到人们重视，并且成为抗移植排斥反应的研究热点。CD154分子主要存在于激活的T细胞膜上，要想得到纯化的抗原免疫动物研制抗体十分困难。国外普遍采用激活的人T细胞直接免疫小鼠，由于激活的T细胞膜表面除了含有 CD154外，还有其它的CD分子，这就给筛选能特异性分泌抗CD154单抗的杂交瘤细胞株带来许多麻烦。为此，我们采用分子克隆方法克隆并表达人CD154-GST融合蛋白，用融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又给筛选工作带来方便，即选择与CD154-GST融合蛋白反应而与GST不反应的特异性杂交瘤细胞株，最后用激活的T细胞鉴定，即可得到特异性抗人CD154分子的单克隆抗体，十分方便。为人CD154单克隆抗体的制备以及抗排斥反应的研究打下了坚实的基础。
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Fig 4 The partial sequencing results of recombinant expression plasmid GEX-4T-1/CD154
图4 重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154部分序列测定结果
我们根据GenBank中hCD154基因序列，自行设计的一对引物，分别在5’端和3’端引物带有BamH I和EcoR I酶切位点，并添加了保护碱基，可扩增目的基因的全部序列以及3'端部分非编码区，使得目的基因能正确插入pGEX-4T-1载体并保持正确的读码框架。采用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞中扩增出编码hCD154的基因，以及重组质粒转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出人CD154-GST融合蛋白，这些结果均证实引物设计的正确性。
pGEX-4T-1为表达GST融合蛋白的原核高效表达载体，带有强的tac启动子。构建的质粒中，SD序列下游是GST基因，pGEX-4T-1的多克隆酶切位点位于GST基因之后，目的基因借助于BamH I和EcoR I酶切位点插入多克隆位点，这样，目的基因接在GST下游，当基因进行表达时，表达产物为GST和目的基因表达蛋白的融合体，融合蛋白表达系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响。表达的融合蛋白可通过谷胱甘肽-agarose柱进行亲和层析，再用凝血酶将其GST切除，从而获得目的蛋白，表达产物的纯化十分方便。
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构建的重组质粒pGEX-4T-1/CD154经酶切鉴定和序列分析证实人CD154基因被成功克隆入pGEX-4T-1中。得到的目的基因为790 bp(820bp减去酶切位点、保护碱基和3'端非编码区)，预期表达分子量为29 kD的蛋白质，而存在于激活的T细胞表面的CD154由于糖基化的原因，分子量为29～39 kD。蛋白表达结果表明：GST分子量为26 kD,融合蛋白分子量为55 kD(26+29)，与我们预期的结果和国外报道的分子量相符[10]。
[参 考 文 献]
[1] Grewal IS, Foellmer HG, Grewal KD. Requirement for CD40L in costimulation induction, T cell activation, and experimental allergic encephalomyelitis[J]. Science, 1996, 273:1864～1867.
, 百拇医药
[2] Janeway CA Je, Bottomly K. Signals and signs for lymphocyte responses[J]. Cell, 1994, 76:275～285.
[3] Renshaw BR, Fanslow WC, Armitage RJ. Humoral immune responses in CD40L -deficient mice[J]. J Exp Med, 1994, 180:1889～1900.
[4] Larsen CP, Elwood ET, Alexander DZ. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after bolcking CD40 and CD28 pathways[J]. Nature, 1996,381:434～438.
[5] Larsen CP, Alexander DZ, Hollenbaugh D. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway[J]. Transplantation, 1996, 61:4～9.
, 百拇医药
[6] Gordon EJ, Markes TG, Phillips NE. Prolonged survival of rat islet and skin xenografts in mice treated with donor splenocytes and anti- CD154 monoclonal antibody[J]. Diabetes, 1998, 47:1199～1206.
[7] Lederman BS, Yellin MJ, Krichevsky A. Identification of a novel surface protein on activated CD4+ T cells that induces contact-dependent B cell differentiation[J]. J Exp Med, 1992,175:1091～1101.
[8] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 49～66.
, 百拇医药
[9] Seyama K, Kira S, Ishidoh K. Genomic structure and PCR-SSCP analysis of the human CD40 ligand gene:its application to prenatal screening for X-linked hyper-IgM syndrome[J]. Hum Genet, 1996,97:180～190.
[10] Kim KM, Min HY,Jung SH. Characterization of an immunosuppressive anti CD40 ligand monoclonal antibody[J]. Hybridoma, 1998,17:463～470.
[收稿日期] 1999-12-27 [修回日期] 2000-03-28, 百拇医药
单位：张春艳 宁波 曹开源(中山医科大学免疫学教研室)；李树浓(病理生理教研室)；张志方(生理教研室, 广东 广州 510089)
关键词：人CD154；融合蛋白；基因表达；克隆，分子
中国病理生理杂志000801 [摘 要] 目的：为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154 -GST)，用于人CD154单克隆抗体研制。方法：根据人CD154基因序列设计合成特异性引物，RT-PCR扩增人CD154基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154；用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，转化菌落经BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154 cDNA；将其克隆至pGEX-4T-1质粒中，经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因；IPTG诱导后的大肠杆菌经 SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。 结论：成功构建了人CD154-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白，为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。
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[中图分类号] Q754 [文献标示码] A
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Cloning of hCD154 gene from human activated peripheral
blood mononuclear cell and expression of hCD154-GST
fusion protein in prokaryote
ZHANG Chun-yan，NING Bo，CAO Kai-yuan
(Department of ImmunologyGuangzhou 510089, China)
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LI Shu-nong
(Department of PathphysiologyGuangzhou 510089, China)
ZHANG Zhi-fang
(Department of Physiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM：To express recombinant hCD154-GST fusion protein, to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, and to investigate the effect of anti-hCD154 monoclonal antibody on graft rejection. METHODS AND RESULTS: Total RNA was prepared from human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activated with 10ng/mL PMA and 1 μg/mL PHA for 8h, the total RNA was reversetranscribed to cDNA. The entire coding region and a part of the 3'non-coding regions were amplified by PCR using a pair of primers designed and synthesized according to the sequence of human CD154 gene from gene bank. The amplified product, a 820bp DNA fragment was cloned into pGEX-4T-1 plasmid expressing glutathione S-transferase(GST). The cloned insert was identified by double digestion of the cloned pGEX-4T-1 plasmid with retriction enzymes BamHⅠand EcoRⅠ.The fusion protein expression plasmid of PGEX-4T-1/hCD154 was constructed, then transformed to E coli BL21. The human CD154-GST fusion protein expression was induced by IPTG in BL21. The expression of recombinant 26kD GST and 55kD human CD154-GST fusion protein were confirmed by SDS-PAGE. CONCLUSION: We have express the recombinant human CD154-GST fusion protein. The expressed hCD154-GST fusion protein will be used to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, to investigate the role of anti-CD154 monoclonal antibody on graft rejection.
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移植排斥反应发生的主要机制是T细胞介导的免疫应答。CD154是一种分子量为29～39 kD的II型跨膜糖蛋白，主要存在于激活的T细胞，它是CD40分子的配体。研究表明[1，2]，在免疫应答过程中，T细胞上的CD154分子与抗原呈递细胞上的CD40分子结合，信号通过CD40分子传递，引起抗原呈递细胞上B7分子的表达，B7分子与T细胞上的CD28分子结合，为T细胞的活化提供第二信号。业已证明[3，4]，CD154抗体可以阻断CD40与CD154分子的结合，使CD40信号传递中断，B7分子不能表达，T细胞缺乏第二活化信号，导致T细胞无反应性。因此，探讨CD154单克隆抗体抗移植排斥反应作用已成为移植免疫研究领域中的一个新的热点[5，6]。我们构建全长的人CD154 cDNA原核表达质粒，表达人GST-CD154融合蛋白，为制备人CD154单克隆抗体，进而研制成新的免疫抑制剂打下基础。
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材 料 和 方 法
一、 菌株和质粒
大肠杆菌BL21和DH5α为本实验室保存；pGEX-4T-1质粒为Pharmercia公司产品。
二、主要试剂
各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、标准分子量蛋白、均购自上海生工生物工程有限公司。RPMI1640细胞培养基购自GIBCO公司。其他常规化学试剂为分析纯以上产品。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
三、 人外周血淋巴细胞总RNA提取
自健康人外周血分离淋巴细胞，加入植物凝集素(phytohamagglutinin,PHA)1 μg/mL和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate、PMA)10 ng/mL激活，37℃培养8 h后，收集培养细胞，按异硫氢酸胍一步法提取总RNA，紫外分光光度计定量[7]。
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四、 引物的设计和反转录PCR
根据基因库(GenBank, 登录号X67878.DNA)中人 CD154(hCD154)基因序列，设计合成一对引物，5’端引物含有BamH I酶切位点和起始密码，3’端引物含有EcoR I酶切位点和终止密码。以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，扩增条件：95℃变性60 s，55℃退火50 s，72℃延伸60 s，循环33次。取PCR产物5 μL在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分析仪检测电泳结果。
五、 pGEX-4T-1/CD154表达质粒的构建
选用谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-trabsferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,将载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，T4连接酶连接反应18℃, 16 h，构建重组质粒pGEX-4T-1/CD154。
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六、 大肠杆菌的转化及重组质粒的酶切鉴定
制备感受态的大肠杆菌BL21细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴30 min，40 ℃热休克90 s，再放冰上2 min；转入LB培养基中，37 ℃ 45 min摇菌培养后，将菌液铺于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃过夜，次日观察菌落，并挑取6个菌落培养后，提取质粒经BamH I和EcoR I双酶切，通过限制性内切酶图谱分析和PCR扩增，鉴定感受态细胞是否插入目的基因[8]。
七、 重组质粒DNA序列测定
取经鉴定含有目的基因的重组质粒进行序列分析。
八、 人CD154-GST融合蛋白的诱导表达
分别将含有pGEX-4T-1/CD154质粒和pGEX-4T-1空载体的菌株放入氨苄青霉素2×YTG培养基中37℃过夜摇菌培养，次日按1：100稀释培养过夜的菌液转种，培养2h，菌液OD600=0.4～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至终浓度为0.2 mmol/L,未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养，分别于2 h和4 h，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。
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结 果
一、 RT-PCR扩增hCD154 cDNA
PCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片段与预期的一致，为820bp (图1)。
Fig 1 Agarose gel electrophoresis map of PCR products
M: 1 kb DNA ladder
1. PCR products with recombinant plasmid
2. RT-PCR products
图1 PCR产物凝胶电泳
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二、pGEX-4T-1/CD154重组质粒的构建和酶切鉴定
pGEX-4T-1载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，经T4连接酶连接，连接产物转化后的大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日观察到pGEX-4T-1/CD154质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上，分别取pGEX-T-1/CD154和pGEX-4T-1质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经0.1%的琼脂糖凝胶电泳，可见经BamH I和EcoR I双酶切后，成为两个片段，分别为4.9kb的pGEX-4T-1和820bp的人CD154基因片段,与理论值相符(图2)。
Fig 2 Restriction map of recombinant plasmid
, 百拇医药 M: 1 kb DNA ladder
1.RT-PCR products
2.Expression plasmid pGEX-4T-1/CD154 digested by BamHⅠand EcoRⅠ
3.Plasmid pGEX-4T-1 degested by BamH I
M: Lambda DNA/Eco911(BstEII) Mark
图2 重组质粒pGEX-4T-1/CD154的酶切分析
三、重组质粒DNA序列测定
重组表达质粒测序结果如图4所示，重组质粒中所含的目的基因片段与国外报道[9]的人CD154 cDNA序列完全一致，对阅读框架分析，证明该重组质粒已正向插入目的基因，肯定了该重组表达质粒能正确表达人CD154-GST融合蛋白。
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四、人CD154-GST融合蛋白的诱导表达
含质粒pGEX-4T-1/CD154的菌株和含质粒pGEX-4T-1的菌株经IPTG诱导后，进行10%SDS-PAGE分析，结果表明，分别在分子量约为55kD(融合蛋白)和26kD(GST)处有特异的蛋白质表达条带，而未经诱导的PGEX-4T-1/CD154无条带产生(图3)。说明pGEX-4T-1/CD154在宿主菌BL21中可表达重组人CD154-GST融合蛋白。
Fig 3 Analysis of hCD154-GST fusion protein expressing products by SDS-PAGE
M: protein marker
1,2 lane: lysate of E coli BL-21 cells
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3,4 lane: 55kD hCD154-GST expression products in lysate of E coli BL-21 cell induced by IPTG 4h and 2h
5,6 lane: 26kD GST expression products in lysate of E coli BL-21 cell induced by IPTG 2h
图3 大肠杆菌BL21中pGEX-4T-1/CD154表达产物的SDS-PAGE分析
讨 论
基于人CD154和CD40分子之间相互作用在T、B细胞活化过程中的重要作用，采用抗CD154单克隆抗体阻止它们之间的相互作用从而达到抑制淋巴细胞活化的目的越来越受到人们重视，并且成为抗移植排斥反应的研究热点。CD154分子主要存在于激活的T细胞膜上，要想得到纯化的抗原免疫动物研制抗体十分困难。国外普遍采用激活的人T细胞直接免疫小鼠，由于激活的T细胞膜表面除了含有 CD154外，还有其它的CD分子，这就给筛选能特异性分泌抗CD154单抗的杂交瘤细胞株带来许多麻烦。为此，我们采用分子克隆方法克隆并表达人CD154-GST融合蛋白，用融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又给筛选工作带来方便，即选择与CD154-GST融合蛋白反应而与GST不反应的特异性杂交瘤细胞株，最后用激活的T细胞鉴定，即可得到特异性抗人CD154分子的单克隆抗体，十分方便。为人CD154单克隆抗体的制备以及抗排斥反应的研究打下了坚实的基础。
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Fig 4 The partial sequencing results of recombinant expression plasmid GEX-4T-1/CD154
图4 重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154部分序列测定结果
我们根据GenBank中hCD154基因序列，自行设计的一对引物，分别在5’端和3’端引物带有BamH I和EcoR I酶切位点，并添加了保护碱基，可扩增目的基因的全部序列以及3'端部分非编码区，使得目的基因能正确插入pGEX-4T-1载体并保持正确的读码框架。采用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞中扩增出编码hCD154的基因，以及重组质粒转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出人CD154-GST融合蛋白，这些结果均证实引物设计的正确性。
pGEX-4T-1为表达GST融合蛋白的原核高效表达载体，带有强的tac启动子。构建的质粒中，SD序列下游是GST基因，pGEX-4T-1的多克隆酶切位点位于GST基因之后，目的基因借助于BamH I和EcoR I酶切位点插入多克隆位点，这样，目的基因接在GST下游，当基因进行表达时，表达产物为GST和目的基因表达蛋白的融合体，融合蛋白表达系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响。表达的融合蛋白可通过谷胱甘肽-agarose柱进行亲和层析，再用凝血酶将其GST切除，从而获得目的蛋白，表达产物的纯化十分方便。
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构建的重组质粒pGEX-4T-1/CD154经酶切鉴定和序列分析证实人CD154基因被成功克隆入pGEX-4T-1中。得到的目的基因为790 bp(820bp减去酶切位点、保护碱基和3'端非编码区)，预期表达分子量为29 kD的蛋白质，而存在于激活的T细胞表面的CD154由于糖基化的原因，分子量为29～39 kD。蛋白表达结果表明：GST分子量为26 kD,融合蛋白分子量为55 kD(26+29)，与我们预期的结果和国外报道的分子量相符[10]。
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-12-27 [修回日期] 2000-03-28, 百拇医药