弓形虫疫苗的研究进展
陈慧红(综述) 古钦民(审校)
关键词；弓形虫 疫苗 弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，该虫能感染包括人体在内的所有哺乳动物。成人弓形虫感染多呈无症状带虫状态，但先天感染可导致流产，畸胎或死胎。在免疫抑制或免疫缺陷者(如器官移植，恶性肿瘤及AIDS病人)，弓形虫为一种机会性原虫，是致死的主要原因之一。此外，弓形虫也可引起禽畜疾病，给畜牧业生产造成严重的经济损失。因此应重视本病的预防。免疫预防的主要手段是疫苗研制，特将几十年来这方面大量工作综述如下。
1 全虫疫苗
1.1 死疫苗 弓形虫疫苗包括固定的全虫和裂解物，对动物进行免疫接种结果显示，抗感染能力弱。所以对于人群和家畜无实用价值。这方面Krahenbuh L & Remington[1]做过评述。
, http://www.100md.com 1.2 活疫苗 猫是弓形虫的唯一终宿主。Frankel[2]以活弓形虫速殖子感染家猫并辅以化学治疗，结果显示家猫处于免疫状态不再排卵囊。
1.3 减毒活疫苗 弓形虫速配子经物理或化学处理使其毒力降低，而接种后又能保持一定的活力，这可激发较强的免疫应答[3]。在减毒活疫苗中，Pefferkorn等[4]分离出弓形虫温度敏感株ts-4，该突变株对小鼠无致病性，也不使小鼠发生慢性感染，在当时被认为是一种较好的备选疫苗。但ts-4株需要组织培养细胞系传代，长期保种后，其遗传稳定性不能保证。
2 虫体特异组分疫苗
用免疫化学方法从虫体裂解物或排泄和分泌抗原(ESA)中，提取特定组分为疫苗。沈继龙等[5]将弓形虫RH株速殖子裂解，经SDS-PAGE电泳，浸出各组分带注射小鼠，然后用毒力株虫体攻击，发现35kDa组分使免疫小鼠获得抗攻击感染的部分保护性免疫。随着单克隆抗体(McAb)技术的发展，有的作者将识别弓形虫不同分子量的McAb进行体外或体内保护实验，以间接证明其相应抗原可能具有保护性，为纯化抗原用于疫苗的研制提供线索。Johnson在6株抗弓形虫McAb中，发现2株(FMC19和FMC22)输注小鼠使之获得对中等毒力虫株感染的100%的保护力，可使强毒力虫株攻击感染平均存活时间延长。这两株McAb相应抗原组分是35kDa和14kDa的虫体表面抗原。此外，有人发现虫体ESA(速殖子分泌、排泄抗原)可能是诱导抗弓形虫免疫应答的重要成分之一。Darcy等[6]报道的弓形虫ESA是首次用无细胞培养基制备的，基本上排除了虫体裂解成分。其免疫原性已用人的、大鼠的和小鼠的阳性血清进行了识别，发现慢性弓形虫病患者血清可识别26-108kDa之间的11条组分。用ESA做免疫原接种大鼠，可产生高滴度抗体。将该血清注入弓形虫高敏感的nu/nu幼龄大鼠，可使之获得抗RH株的抵抗力，存活期显著延长。
, 百拇医药
3 分子疫苗
3.1 单价分子疫苗
3.1.1 P30(SAG1)P30抗原是Kasper等[7]抗弓形虫P30McAb吸附于琼脂糖载体，分离纯化得到速殖子膜抗原。Burg等[8]对P30抗原的基因序列进行了分析，并推断出了其所编码的336个氨基酸序列。P30基因是单拷贝基因，不含内含子，有一个单一开放阅读框架。Makioka等[9]已报道的P30基因序列合成引物，通过PCR体外扩增P30基因，重组于pTV118N、pKK233-2、pGEX-1等3种不同质粒载体，分别导入K-12株MV1184，JM105和JM109中转化，其中重组非融合蛋白表达系统pTV118N和pKK233-2无非融合性产物产生，pGEX-1重组质粒能以谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的形式高效表达。动物实验[10]表明融合蛋白形式P30蛋白可导致巨噬细胞的活化，使其产生在体外杀弓形虫活性，且巨噬细胞的激活是融合蛋白中P30所致，而不是谷胱甘肽S转移酶。Khan et al[11]报道亲和纯化的P30蛋白能刺激弓形虫血清阳性病人外周单核细胞产生γ-干扰素。Khan et al[12]还报道用亲和纯化的P30蛋白诱导细胞毒性T细胞有抗弓形虫的活性。由于重组P30在大肠杆菌中的表达不能适当折叠形成天然构型且难以分离，所以要获得更接近天然构型的重组蛋白必须在真核系统中进行表达。Cheng Xiong等[13]将辛德毕斯病毒载体(sindbis vector)Toto2J1与弓形虫P30和谷胱甘肽S转移酶的基因重组，在幼仓鼠肾细胞(BHK)表达，发现抗真核表达GST/P30兔血清与还原的或非还原的P30以及纯化的或粗制的速殖子溶解物均产生较强的反应。而抗原核表达GST/P30的兔血清仅与还原的P30和速殖子溶解物反应。Kim等[14]用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达了接近天然构型的P30蛋白，该重组蛋白可被天然蛋白的抗血清以及人类免疫血清所识别。Molen等[15]进一步通过PCR方法获得P30基因的克隆，与pEV142表达载体重组，导入转基因小鼠以研究P30抗原在弓形虫感染中的免疫作用。国内陈晓光等分别将P30基因重组于原核表达pBV220[16]和昆虫杆状病毒表达载体[17]，得到了重组质粒pBV220/P30和TnNPV/P30分别在大肠杆菌的草地夜蛾细胞中进行了表达。严延生等[18]经PCR扩增出P30基因，构建重组质粒sf9昆虫细胞中进行了表达。Roussel等[19]P30的T细胞和B细胞表位进行了分析研究，确认T细胞表位和B细胞表位的基因编码片段。P30迄今被认为是一种很有前途的疫苗候选抗原。
, 百拇医药
3.1.2 P22(SAG2)P22是Prine等[20]利用McAb对弓形虫cDNA文库进行筛选，构建了P22基因克隆，推断出其编码的氨基酸序列，并进行了初步表达研究。P22为单拷贝基因，不含内含子。该基因体外表达研究结果表明，P22可与谷胱甘肽S转移酶(GST)呈融合蛋白形式大量表达，初步表达产物可与急慢性弓形虫感染病人血清IgG抗体反应。由于此融合蛋白不溶于水，Parmley et al[21]构建了P22-438bp片段的亚克隆，仍以GST融合蛋白形式在大肠杆菌中进行了表达，此重组蛋白经纯化溶解，可与病人血清IgG抗体反应。
3.1.3 P28 Handman 获得针对胞质抗原的McAb，F3G3其中一株McAb，该抗体输给小鼠后，可使小鼠的90%获得保护性免疫力。Prine研究指出编码F3G3抗原的基因长度为1051kb，编码分子量为28kDa的抗原蛋白质。近期[22]对P28抗原基因的克隆及序列分析研究表明，P28的结构基因为1050bp，含有一个245bp的内含子。在SDS-PAGE凝胶电泳中，所表达的蛋白分子量为18kDa，远远低于天然P28的分子量，可能是因为转录后的各种修饰作用所致。在大肠杆菌系统表达的重组P28抗原不稳定难以应用于保护性免疫功能研究。
, 百拇医药
3.1.4 P23 Cestbron-Delauw 等[23]构建了P23基因克隆，并在原核系统及真核系统进行了表达研究。通过免疫印迹45Ca2+孵育试验发现，重组蛋白吸附有45Ca2+。P23作为特异的蛋白具有可以激活和/或稳定网状结构的功能，也可能具有钙离子缓冲剂的作用，调节钙离子浓度，从而在寄生虫侵入时，发挥类似寄生虫分泌的蛋白酶和清除酶的活性，由于P23特有的生化特性，所以P23抗原值得进一步研究。
3.1.5 其他抗原
3.1.5.1 缓殖子抗原 Parmley et al[24]克隆了一个分子量为65kDa的抗原基因，此基因大量存在于包囊的基质和包囊壁，而不存在于速殖子和纳虫泡中。其体外表达的重组抗原与抗缓殖子多克隆抗体强烈反应。Bohne等[25]则克隆与表达了缓殖子特异hsp30/bag基因，以其表达抗原相应的多克隆抗血清分离得到了一分子量为30kDa的抗原，免疫电镜显示此抗原位于缓殖子的胞质内。Soete利用亲和层析法纯化P18，P18是缓殖子另一种抗原，测定其N-末端序列。
, 百拇医药
3.1.5.2 PEF(侵入促进因子) PEF(penetration-enhancing factor)是Lycke E et al[26]首次报道的。PEF可促进弓形虫侵入宿主细胞，并且侵入活性直接与PEF浓度成比例，侵入促进效应可被相应的抗血清去除。多数学者PEF是由虫体前端的棒状体(rhoptries)分泌的多种蛋白的复合体，许多实验证实PEF贮存于棒状体内[27]。Ossorio et al[28]实验结果提示ROP1(棒状蛋白1)可能就是PEF。PEF的基因已被克隆。
3.1.5.3 致密颗粒抗原(dense granules antigens GRA)致密颗粒中至少有6种蛋白[29]，6种GRA分子均已克隆。免疫化学分析了分子量23kDa的弓形虫分泌抗原(后来证实为GRA1)，存在于速殖子及缓殖子的致密颗粒，可作为慢性感染的诊断抗原及可能的疫苗成分[23]。用纯化GRA2或GRA5免疫小鼠，抗攻击感染小鼠的存活率分别为75%和50%，具有免疫保护性。对GRA1及GRA2分子的一些B细胞及T细胞表位予以鉴定。从GRA1序列中合成了两个羧基端肽链(区域为170-193，194-208bp)，已证实为T细胞表位，前者同时也是B细胞表位，能被抗GRA1的TG17-43所识别。用人抗血清及GRA2重组蛋白的抗血清的血清学实验显示，该抗原含有至少3个B细胞表位，其中羧基端表位可能是线形的，能被鼠抗GRA2单抗TG17-179所识别。
, 百拇医药
3.1.5.4 微线体抗原(microneme antigen)研究表明，微线体蛋白与虫体对宿主细胞的识别和结合有关，在虫体侵入宿主细胞早期起作用。已报道的微线体蛋白有MIC1，MIC2及，MIC3。
3.1.5.5 54kDa膜蛋白[30]可被T淋巴细胞克隆识别，该蛋白可刺激特异的抗弓形虫T淋巴细胞克隆增生，诱导机体产生细胞免疫效应，对于弓形虫的感染具有一定的保护作用。
3.2 复合多价疫苗 将不同抗原分子或不同抗原分子的功能性表位的氨基酸序列结合起来，设计合成联合抗原或联合表位肽段。动物实验表明单价亚单位疫苗效果不理想，发展复合多价疫苗成为弓形虫疫苗研制的新策略。Lunden等[31]把P30、P22以及另一分子量约为6000的抗原混合成免疫刺激复合体(iscoms)免疫小鼠产生了对弓形虫的高滴度抗体和迟发型变态反应。Darcy等[32]发现P30的合成肽P30 48-67的八单位的复合抗原(MAP)构建物可诱导产生保护性免疫反应，并预言将其与另一种23kDa的分泌抗原的170-193多肽形成的同样结构以及与弓形虫其它一些抗原多肽联合应用，可能产生更好的免疫效果。
, http://www.100md.com
由于γ-IFN和IL-2在感染和治疗中起作用。有人拟将P30抗原基因与IL-2，IL-4和γ-IFN基因体外重组，产生融合P30/IL-2或P30/γ-IFN蛋白质。本人认为可以筛选出弓形虫速殖子、缓殖子、胞质分泌抗原的特异性抗原，进而确定特异性抗原的T细胞表位和B细胞表位的基因编码片段，选择某一基因片段与其他基因片段经体外连接的方法进行连接，形成复合多价亚单位疫苗。近年来在寄生虫疫苗研究方面已出现了合成多肽疫苗，这是Lerner提出的[36]，其研究方法是：确定天然抗原的氨基酸序列，并寻找抗原决定簇肽段，然后合成抗原肽，并试验其诱导产生抗体的能力，选出具有免疫性和保护性的特异性抗原肽制备疫苗。这也是弓形虫疫苗研究应发展的方向。
以上提到的分子疫苗要经过基因克隆、表达、蛋白纯化等复杂过程，成本也比较高，所以现在又提出了核酸疫苗。
4 核酸疫苗
Wolff et al[37]于1990年在基因治疗的研究中，小鼠肌细胞能吸附裸质粒DNA，并表达外源蛋白。Ulmer等首次报道裸质粒DNA技术在疫苗研究中的应用。核酸疫苗有以下优点：(1)无需佐剂(2)无需重组抗原的表达和纯化。制备简单且成本低。(3)产生CTL作用，对胞内寄生的病毒，原虫等具有杀伤作用。(4)在宿主细胞的真核环境中表达，使寄生虫的有关蛋白更接近天然构象。(5)免疫具有持续性。(6)可制备成多价疫苗(7)便于储存和运输。在核酸疫苗方面，弓形虫疫苗的研究尚未进行研究。文献仅见疟原虫，血吸虫，利什曼原虫核酸疫苗的报道。弓形虫疫苗的研究有待于向这一方向发展。
, http://www.100md.com
5 弓形虫疫苗研究现状及前景
目前弓形虫疫苗的研制尚处于单价亚单位疫苗的研究阶段，动物和人体实验结果显示亚单位疫苗的效果不理想。复合多价疫苗和核酸疫苗的出现为正面临困境的弓形虫疫苗的研制带来了新希望，尤其是核酸疫苗的研制，因为它能同时诱导机体产生高水平的保护性体液和细胞免疫力。所以，弓形虫疫苗的研制应致力于复合多价疫苗和核酸疫苗。
陈慧红现为中山医科大学病原微生物专业博士生
陈慧红(山东医科大学寄生虫学教研室 济南，250012)
古钦民(山东医科大学寄生虫学教研室 济南，250012)
参考文献
1，Krahenbuh JL，et al.Immunology of Toxoplasma and toxoplasmosis In ∶cohens，and warren ks eds〔J〕.Immunolgy of Parasitic Infections.ed 2.Black，Oxford，1982，408.
, 百拇医药
2，Frenkel Jk，et al.Immunization of cats against shedding of Toxoplasma oocysts〔J〕.J Parasitol 1982，68∶774.
3，Seah SKK，et al.The use of irradiated vaccine in immunization aganist experimental murine toxoplasmosis〔J〕.Can J Microbiol，1975，21∶1379.
4，Pfefferkorn ER，et al.Toxoplasma gondii isolation and preliminary characterization of temperature sensitive mutants〔J〕.Exp Parasitol，1976，39∶365.
5，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1990，6∶14.
, http://www.100md.com
6，Darcy F，et al.Induction of a protective antibody-dependent response against toxoplasmosis by in vitro excreted/secreted antigens from tachyzoites of Toxoplasma gondii〔J〕.Parasite Immunol，1998，10∶553.
7，Kasper LH，et al.Purfication of a membrane protein of Toxoplasma gondii by immunoabsortion with a monoclonal antibody〔J〕.J Immunol，1983，130∶2407.
8，Burg JL，et al.Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii〔J〕.J Immunol，1998，141∶3584.
, 百拇医药
9，Makioka A，et al.Expression of the major surface antigen (P30) gene of Toxoplasma gondii as an insoluable glutathione S-transferase fusion protein〔J〕.Jpn J Parasitol，1991，40∶344.
10，Makioka A，et al.Toxoplasmacidal activity of macrophages activated by recombinant major surface antigen (P30) of Toxoplasma gondii〔J〕.Infection and Immunity，1991，59∶2851.
11，Khan I.A，et al.Production of γ-interferon by cultured human lymphocytes stimulated with a purified member protein(P30) from Toxoplasma gondii〔J〕.J Infect Dis，1988，157∶979.
, 百拇医药
12，Khan I.A，et al.Induction of antigen-specific parasiticidal cytotoxic T cell splenocytes by a major membrane protein(P30) of Toxoplasma gondii〔J〕.J Immunol 1988，141∶3600.
13，Xiong C，et al.Expression of Toxoplasma gondii P30 as fusion with glutathione s-transferase in animal cells by sindbis recombinant virus〔J〕.Mol Bio Parasitol.1993，61∶143.
14，Kim K，et al.Conformationally appropriate expression of the Toxoplasma antigen SAG1(P30) in CHO cells.〔J〕.Infect Immun，1994，62∶203.
, 百拇医药
15，Molen I，et al.Cloning of the gene encoding the P30 antigen of Toxoplasma gondii by PCR to insert it in transgenic mice.〔J〕.Arch Med Res，1994，25∶463.
16，Chen XG，et al.Amplication，cloning sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated in China〔J〕.J Med Coll PLA.，1994，9∶98
17，陈晓光，等.弓形虫P30基因在昆虫杆状病毒载体体系中的初步表达〔J〕.寄生虫与医学昆虫学报，1996，3∶19.
18，严延生，等.弓形虫主要抗原基因(SAG1)在昆虫细胞中表达的研究[J].中国人兽共患病杂志，1997，13∶16.
, 百拇医药
19，Roussel FV,et al.Epitopic analysis of the Toxoplasma gondii major surface antigen SAG1〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1994,66∶33.
20，Prince JB，et al.Cloning expression and cDNA sequence of surface antigen P22 from Toxoplasma gondii〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1990，43∶97.
21，Parmley SF，et al.Expression characterization and serological reactivity of recombinant surface antigen P22 of Toxoplasma gondii〔J〕J Clin Microbiol，1992，30∶1127.
, 百拇医药
22，Parmley SF，et al.Genomic and correct cDNA sequence of the P28from Toxoplasma gondii〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1993，57∶161.
23，Cestron-Delauw，et al.Molecular characterization of a 23-kilodalton major antigen secreted by Toxoplasma gondii〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86∶7537.
24，Parmley SF，et al.Molecular characterization of a 65-kildalton Toxoplasma gondii antigen expresssed abundantly in the matrix of tissue cysts.〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1994，66∶283.
, 百拇医药
25，Bohne w，et al.Cloning and characterization of a bradyzoite-specifically expressed gene (hsp30/bag)of Toxoplasma gondii related to genes encoding small heat-shock protein of plants〔J〕.Mol Microbiol，1995，16∶1221.
26，Lycke E，et al.Penetration-enhancing factor extracted from Toxoplasma gondii which increases its virulence for mice〔J〕.J Bacteriol，1968，96∶785.
27，Schwartzman JD，et al.Inhibition of a penetration-enhancing factor of Toxoplasma gondii by monoclonal antibodies specific for rhoptries〔J〕.Inf Immun，1986，51∶760.
, 百拇医药
28，Ossorio PN，et al.A Toxoplasma gondii rhoptry protein associated with host cell penetration has unusual charge asmmetry〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1992，50∶1.
29，Charif H，et al.Toxoplasma gondii∶characterization and localization of antigen secreted from Tachyzoites〔J〕.Exp parasitol，1990，71∶114.
30，Savvedra R，et al.Human T cell clone identifies a potentially protective 54-kDa protein antigen of Toxoplasma gondii cloned and expressed in Escherichia coli〔J〕.J Immunol，1991，147∶1975.
, 百拇医药
31，Lunden A，et al.Immune reponse and resistance to Toxoplasma gondii in mice immunized with antigen of the parasite incorporated into immunostimulating complexes〔J〕.Infect Immun，1993，61∶2639.
32，Darcy F，et al.Protection of mice and nude rats against toxoplasmosis by a multiple antigenic peptide construction derived from Toxoplasma gondii P30 gene.〔J〕.J Immunol，1992，149∶3636.
33，Itaque，et al.Impairment of the cellular immune response in acute murine Toxoplasmosis∶regulation of interleukin 2 production and macrophage-mediated inhibitory efforts〔J〕.Infect Immun，1994，62∶2908.
, 百拇医药
34，Shirahata T，et al.Enhancement by recombinant human interleukin 2 of host resistance to Toxoplasma gondii infection in pregnant mice〔J〕.Microbiol Immunol，1993，37∶583.
35，Khan IA，et al.Production of γ-Interferon by cultured human lymphocytes stimulated with a purified membrane protein (P30) from Toxoplasma gondii〔J〕.J Infect Dis，1988，157∶979.
36，Lerner RA，et al.Chemically synthesized peptides predicted from the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome elicit antibodies reactive with the native envelop protein of Dane particles〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1981，78∶3403.
37，Wolff JA，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo〔J〕.Science，1990，247∶1465.
38，Ulmer JB，et al.Heterologous protein against influenza by injection of DNA encoding a viral protein〔J〕.Science，1993，259∶1745., http://www.100md.com
关键词；弓形虫 疫苗 弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，该虫能感染包括人体在内的所有哺乳动物。成人弓形虫感染多呈无症状带虫状态，但先天感染可导致流产，畸胎或死胎。在免疫抑制或免疫缺陷者(如器官移植，恶性肿瘤及AIDS病人)，弓形虫为一种机会性原虫，是致死的主要原因之一。此外，弓形虫也可引起禽畜疾病，给畜牧业生产造成严重的经济损失。因此应重视本病的预防。免疫预防的主要手段是疫苗研制，特将几十年来这方面大量工作综述如下。
1 全虫疫苗
1.1 死疫苗 弓形虫疫苗包括固定的全虫和裂解物，对动物进行免疫接种结果显示，抗感染能力弱。所以对于人群和家畜无实用价值。这方面Krahenbuh L & Remington[1]做过评述。
, http://www.100md.com 1.2 活疫苗 猫是弓形虫的唯一终宿主。Frankel[2]以活弓形虫速殖子感染家猫并辅以化学治疗，结果显示家猫处于免疫状态不再排卵囊。
1.3 减毒活疫苗 弓形虫速配子经物理或化学处理使其毒力降低，而接种后又能保持一定的活力，这可激发较强的免疫应答[3]。在减毒活疫苗中，Pefferkorn等[4]分离出弓形虫温度敏感株ts-4，该突变株对小鼠无致病性，也不使小鼠发生慢性感染，在当时被认为是一种较好的备选疫苗。但ts-4株需要组织培养细胞系传代，长期保种后，其遗传稳定性不能保证。
2 虫体特异组分疫苗
用免疫化学方法从虫体裂解物或排泄和分泌抗原(ESA)中，提取特定组分为疫苗。沈继龙等[5]将弓形虫RH株速殖子裂解，经SDS-PAGE电泳，浸出各组分带注射小鼠，然后用毒力株虫体攻击，发现35kDa组分使免疫小鼠获得抗攻击感染的部分保护性免疫。随着单克隆抗体(McAb)技术的发展，有的作者将识别弓形虫不同分子量的McAb进行体外或体内保护实验，以间接证明其相应抗原可能具有保护性，为纯化抗原用于疫苗的研制提供线索。Johnson在6株抗弓形虫McAb中，发现2株(FMC19和FMC22)输注小鼠使之获得对中等毒力虫株感染的100%的保护力，可使强毒力虫株攻击感染平均存活时间延长。这两株McAb相应抗原组分是35kDa和14kDa的虫体表面抗原。此外，有人发现虫体ESA(速殖子分泌、排泄抗原)可能是诱导抗弓形虫免疫应答的重要成分之一。Darcy等[6]报道的弓形虫ESA是首次用无细胞培养基制备的，基本上排除了虫体裂解成分。其免疫原性已用人的、大鼠的和小鼠的阳性血清进行了识别，发现慢性弓形虫病患者血清可识别26-108kDa之间的11条组分。用ESA做免疫原接种大鼠，可产生高滴度抗体。将该血清注入弓形虫高敏感的nu/nu幼龄大鼠，可使之获得抗RH株的抵抗力，存活期显著延长。
, 百拇医药
3 分子疫苗
3.1 单价分子疫苗
3.1.1 P30(SAG1)P30抗原是Kasper等[7]抗弓形虫P30McAb吸附于琼脂糖载体，分离纯化得到速殖子膜抗原。Burg等[8]对P30抗原的基因序列进行了分析，并推断出了其所编码的336个氨基酸序列。P30基因是单拷贝基因，不含内含子，有一个单一开放阅读框架。Makioka等[9]已报道的P30基因序列合成引物，通过PCR体外扩增P30基因，重组于pTV118N、pKK233-2、pGEX-1等3种不同质粒载体，分别导入K-12株MV1184，JM105和JM109中转化，其中重组非融合蛋白表达系统pTV118N和pKK233-2无非融合性产物产生，pGEX-1重组质粒能以谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的形式高效表达。动物实验[10]表明融合蛋白形式P30蛋白可导致巨噬细胞的活化，使其产生在体外杀弓形虫活性，且巨噬细胞的激活是融合蛋白中P30所致，而不是谷胱甘肽S转移酶。Khan et al[11]报道亲和纯化的P30蛋白能刺激弓形虫血清阳性病人外周单核细胞产生γ-干扰素。Khan et al[12]还报道用亲和纯化的P30蛋白诱导细胞毒性T细胞有抗弓形虫的活性。由于重组P30在大肠杆菌中的表达不能适当折叠形成天然构型且难以分离，所以要获得更接近天然构型的重组蛋白必须在真核系统中进行表达。Cheng Xiong等[13]将辛德毕斯病毒载体(sindbis vector)Toto2J1与弓形虫P30和谷胱甘肽S转移酶的基因重组，在幼仓鼠肾细胞(BHK)表达，发现抗真核表达GST/P30兔血清与还原的或非还原的P30以及纯化的或粗制的速殖子溶解物均产生较强的反应。而抗原核表达GST/P30的兔血清仅与还原的P30和速殖子溶解物反应。Kim等[14]用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达了接近天然构型的P30蛋白，该重组蛋白可被天然蛋白的抗血清以及人类免疫血清所识别。Molen等[15]进一步通过PCR方法获得P30基因的克隆，与pEV142表达载体重组，导入转基因小鼠以研究P30抗原在弓形虫感染中的免疫作用。国内陈晓光等分别将P30基因重组于原核表达pBV220[16]和昆虫杆状病毒表达载体[17]，得到了重组质粒pBV220/P30和TnNPV/P30分别在大肠杆菌的草地夜蛾细胞中进行了表达。严延生等[18]经PCR扩增出P30基因，构建重组质粒sf9昆虫细胞中进行了表达。Roussel等[19]P30的T细胞和B细胞表位进行了分析研究，确认T细胞表位和B细胞表位的基因编码片段。P30迄今被认为是一种很有前途的疫苗候选抗原。
, 百拇医药
3.1.2 P22(SAG2)P22是Prine等[20]利用McAb对弓形虫cDNA文库进行筛选，构建了P22基因克隆，推断出其编码的氨基酸序列，并进行了初步表达研究。P22为单拷贝基因，不含内含子。该基因体外表达研究结果表明，P22可与谷胱甘肽S转移酶(GST)呈融合蛋白形式大量表达，初步表达产物可与急慢性弓形虫感染病人血清IgG抗体反应。由于此融合蛋白不溶于水，Parmley et al[21]构建了P22-438bp片段的亚克隆，仍以GST融合蛋白形式在大肠杆菌中进行了表达，此重组蛋白经纯化溶解，可与病人血清IgG抗体反应。
3.1.3 P28 Handman 获得针对胞质抗原的McAb，F3G3其中一株McAb，该抗体输给小鼠后，可使小鼠的90%获得保护性免疫力。Prine研究指出编码F3G3抗原的基因长度为1051kb，编码分子量为28kDa的抗原蛋白质。近期[22]对P28抗原基因的克隆及序列分析研究表明，P28的结构基因为1050bp，含有一个245bp的内含子。在SDS-PAGE凝胶电泳中，所表达的蛋白分子量为18kDa，远远低于天然P28的分子量，可能是因为转录后的各种修饰作用所致。在大肠杆菌系统表达的重组P28抗原不稳定难以应用于保护性免疫功能研究。
, 百拇医药
3.1.4 P23 Cestbron-Delauw 等[23]构建了P23基因克隆，并在原核系统及真核系统进行了表达研究。通过免疫印迹45Ca2+孵育试验发现，重组蛋白吸附有45Ca2+。P23作为特异的蛋白具有可以激活和/或稳定网状结构的功能，也可能具有钙离子缓冲剂的作用，调节钙离子浓度，从而在寄生虫侵入时，发挥类似寄生虫分泌的蛋白酶和清除酶的活性，由于P23特有的生化特性，所以P23抗原值得进一步研究。
3.1.5 其他抗原
3.1.5.1 缓殖子抗原 Parmley et al[24]克隆了一个分子量为65kDa的抗原基因，此基因大量存在于包囊的基质和包囊壁，而不存在于速殖子和纳虫泡中。其体外表达的重组抗原与抗缓殖子多克隆抗体强烈反应。Bohne等[25]则克隆与表达了缓殖子特异hsp30/bag基因，以其表达抗原相应的多克隆抗血清分离得到了一分子量为30kDa的抗原，免疫电镜显示此抗原位于缓殖子的胞质内。Soete利用亲和层析法纯化P18，P18是缓殖子另一种抗原，测定其N-末端序列。
, 百拇医药
3.1.5.2 PEF(侵入促进因子) PEF(penetration-enhancing factor)是Lycke E et al[26]首次报道的。PEF可促进弓形虫侵入宿主细胞，并且侵入活性直接与PEF浓度成比例，侵入促进效应可被相应的抗血清去除。多数学者PEF是由虫体前端的棒状体(rhoptries)分泌的多种蛋白的复合体，许多实验证实PEF贮存于棒状体内[27]。Ossorio et al[28]实验结果提示ROP1(棒状蛋白1)可能就是PEF。PEF的基因已被克隆。
3.1.5.3 致密颗粒抗原(dense granules antigens GRA)致密颗粒中至少有6种蛋白[29]，6种GRA分子均已克隆。免疫化学分析了分子量23kDa的弓形虫分泌抗原(后来证实为GRA1)，存在于速殖子及缓殖子的致密颗粒，可作为慢性感染的诊断抗原及可能的疫苗成分[23]。用纯化GRA2或GRA5免疫小鼠，抗攻击感染小鼠的存活率分别为75%和50%，具有免疫保护性。对GRA1及GRA2分子的一些B细胞及T细胞表位予以鉴定。从GRA1序列中合成了两个羧基端肽链(区域为170-193，194-208bp)，已证实为T细胞表位，前者同时也是B细胞表位，能被抗GRA1的TG17-43所识别。用人抗血清及GRA2重组蛋白的抗血清的血清学实验显示，该抗原含有至少3个B细胞表位，其中羧基端表位可能是线形的，能被鼠抗GRA2单抗TG17-179所识别。
, 百拇医药
3.1.5.4 微线体抗原(microneme antigen)研究表明，微线体蛋白与虫体对宿主细胞的识别和结合有关，在虫体侵入宿主细胞早期起作用。已报道的微线体蛋白有MIC1，MIC2及，MIC3。
3.1.5.5 54kDa膜蛋白[30]可被T淋巴细胞克隆识别，该蛋白可刺激特异的抗弓形虫T淋巴细胞克隆增生，诱导机体产生细胞免疫效应，对于弓形虫的感染具有一定的保护作用。
3.2 复合多价疫苗 将不同抗原分子或不同抗原分子的功能性表位的氨基酸序列结合起来，设计合成联合抗原或联合表位肽段。动物实验表明单价亚单位疫苗效果不理想，发展复合多价疫苗成为弓形虫疫苗研制的新策略。Lunden等[31]把P30、P22以及另一分子量约为6000的抗原混合成免疫刺激复合体(iscoms)免疫小鼠产生了对弓形虫的高滴度抗体和迟发型变态反应。Darcy等[32]发现P30的合成肽P30 48-67的八单位的复合抗原(MAP)构建物可诱导产生保护性免疫反应，并预言将其与另一种23kDa的分泌抗原的170-193多肽形成的同样结构以及与弓形虫其它一些抗原多肽联合应用，可能产生更好的免疫效果。
, http://www.100md.com
由于γ-IFN和IL-2在感染和治疗中起作用。有人拟将P30抗原基因与IL-2，IL-4和γ-IFN基因体外重组，产生融合P30/IL-2或P30/γ-IFN蛋白质。本人认为可以筛选出弓形虫速殖子、缓殖子、胞质分泌抗原的特异性抗原，进而确定特异性抗原的T细胞表位和B细胞表位的基因编码片段，选择某一基因片段与其他基因片段经体外连接的方法进行连接，形成复合多价亚单位疫苗。近年来在寄生虫疫苗研究方面已出现了合成多肽疫苗，这是Lerner提出的[36]，其研究方法是：确定天然抗原的氨基酸序列，并寻找抗原决定簇肽段，然后合成抗原肽，并试验其诱导产生抗体的能力，选出具有免疫性和保护性的特异性抗原肽制备疫苗。这也是弓形虫疫苗研究应发展的方向。
以上提到的分子疫苗要经过基因克隆、表达、蛋白纯化等复杂过程，成本也比较高，所以现在又提出了核酸疫苗。
4 核酸疫苗
Wolff et al[37]于1990年在基因治疗的研究中，小鼠肌细胞能吸附裸质粒DNA，并表达外源蛋白。Ulmer等首次报道裸质粒DNA技术在疫苗研究中的应用。核酸疫苗有以下优点：(1)无需佐剂(2)无需重组抗原的表达和纯化。制备简单且成本低。(3)产生CTL作用，对胞内寄生的病毒，原虫等具有杀伤作用。(4)在宿主细胞的真核环境中表达，使寄生虫的有关蛋白更接近天然构象。(5)免疫具有持续性。(6)可制备成多价疫苗(7)便于储存和运输。在核酸疫苗方面，弓形虫疫苗的研究尚未进行研究。文献仅见疟原虫，血吸虫，利什曼原虫核酸疫苗的报道。弓形虫疫苗的研究有待于向这一方向发展。
, http://www.100md.com
5 弓形虫疫苗研究现状及前景
目前弓形虫疫苗的研制尚处于单价亚单位疫苗的研究阶段，动物和人体实验结果显示亚单位疫苗的效果不理想。复合多价疫苗和核酸疫苗的出现为正面临困境的弓形虫疫苗的研制带来了新希望，尤其是核酸疫苗的研制，因为它能同时诱导机体产生高水平的保护性体液和细胞免疫力。所以，弓形虫疫苗的研制应致力于复合多价疫苗和核酸疫苗。
陈慧红现为中山医科大学病原微生物专业博士生
陈慧红(山东医科大学寄生虫学教研室 济南，250012)
古钦民(山东医科大学寄生虫学教研室 济南，250012)
参考文献
1，Krahenbuh JL，et al.Immunology of Toxoplasma and toxoplasmosis In ∶cohens，and warren ks eds〔J〕.Immunolgy of Parasitic Infections.ed 2.Black，Oxford，1982，408.
, 百拇医药
2，Frenkel Jk，et al.Immunization of cats against shedding of Toxoplasma oocysts〔J〕.J Parasitol 1982，68∶774.
3，Seah SKK，et al.The use of irradiated vaccine in immunization aganist experimental murine toxoplasmosis〔J〕.Can J Microbiol，1975，21∶1379.
4，Pfefferkorn ER，et al.Toxoplasma gondii isolation and preliminary characterization of temperature sensitive mutants〔J〕.Exp Parasitol，1976，39∶365.
5，沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1990，6∶14.
, http://www.100md.com
6，Darcy F，et al.Induction of a protective antibody-dependent response against toxoplasmosis by in vitro excreted/secreted antigens from tachyzoites of Toxoplasma gondii〔J〕.Parasite Immunol，1998，10∶553.
7，Kasper LH，et al.Purfication of a membrane protein of Toxoplasma gondii by immunoabsortion with a monoclonal antibody〔J〕.J Immunol，1983，130∶2407.
8，Burg JL，et al.Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii〔J〕.J Immunol，1998，141∶3584.
, 百拇医药
9，Makioka A，et al.Expression of the major surface antigen (P30) gene of Toxoplasma gondii as an insoluable glutathione S-transferase fusion protein〔J〕.Jpn J Parasitol，1991，40∶344.
10，Makioka A，et al.Toxoplasmacidal activity of macrophages activated by recombinant major surface antigen (P30) of Toxoplasma gondii〔J〕.Infection and Immunity，1991，59∶2851.
11，Khan I.A，et al.Production of γ-interferon by cultured human lymphocytes stimulated with a purified member protein(P30) from Toxoplasma gondii〔J〕.J Infect Dis，1988，157∶979.
, 百拇医药
12，Khan I.A，et al.Induction of antigen-specific parasiticidal cytotoxic T cell splenocytes by a major membrane protein(P30) of Toxoplasma gondii〔J〕.J Immunol 1988，141∶3600.
13，Xiong C，et al.Expression of Toxoplasma gondii P30 as fusion with glutathione s-transferase in animal cells by sindbis recombinant virus〔J〕.Mol Bio Parasitol.1993，61∶143.
14，Kim K，et al.Conformationally appropriate expression of the Toxoplasma antigen SAG1(P30) in CHO cells.〔J〕.Infect Immun，1994，62∶203.
, 百拇医药
15，Molen I，et al.Cloning of the gene encoding the P30 antigen of Toxoplasma gondii by PCR to insert it in transgenic mice.〔J〕.Arch Med Res，1994，25∶463.
16，Chen XG，et al.Amplication，cloning sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated in China〔J〕.J Med Coll PLA.，1994，9∶98
17，陈晓光，等.弓形虫P30基因在昆虫杆状病毒载体体系中的初步表达〔J〕.寄生虫与医学昆虫学报，1996，3∶19.
18，严延生，等.弓形虫主要抗原基因(SAG1)在昆虫细胞中表达的研究[J].中国人兽共患病杂志，1997，13∶16.
, 百拇医药
19，Roussel FV,et al.Epitopic analysis of the Toxoplasma gondii major surface antigen SAG1〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1994,66∶33.
20，Prince JB，et al.Cloning expression and cDNA sequence of surface antigen P22 from Toxoplasma gondii〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1990，43∶97.
21，Parmley SF，et al.Expression characterization and serological reactivity of recombinant surface antigen P22 of Toxoplasma gondii〔J〕J Clin Microbiol，1992，30∶1127.
, 百拇医药
22，Parmley SF，et al.Genomic and correct cDNA sequence of the P28from Toxoplasma gondii〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1993，57∶161.
23，Cestron-Delauw，et al.Molecular characterization of a 23-kilodalton major antigen secreted by Toxoplasma gondii〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86∶7537.
24，Parmley SF，et al.Molecular characterization of a 65-kildalton Toxoplasma gondii antigen expresssed abundantly in the matrix of tissue cysts.〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1994，66∶283.
, 百拇医药
25，Bohne w，et al.Cloning and characterization of a bradyzoite-specifically expressed gene (hsp30/bag)of Toxoplasma gondii related to genes encoding small heat-shock protein of plants〔J〕.Mol Microbiol，1995，16∶1221.
26，Lycke E，et al.Penetration-enhancing factor extracted from Toxoplasma gondii which increases its virulence for mice〔J〕.J Bacteriol，1968，96∶785.
27，Schwartzman JD，et al.Inhibition of a penetration-enhancing factor of Toxoplasma gondii by monoclonal antibodies specific for rhoptries〔J〕.Inf Immun，1986，51∶760.
, 百拇医药
28，Ossorio PN，et al.A Toxoplasma gondii rhoptry protein associated with host cell penetration has unusual charge asmmetry〔J〕.Mol Biochem Parasitol，1992，50∶1.
29，Charif H，et al.Toxoplasma gondii∶characterization and localization of antigen secreted from Tachyzoites〔J〕.Exp parasitol，1990，71∶114.
30，Savvedra R，et al.Human T cell clone identifies a potentially protective 54-kDa protein antigen of Toxoplasma gondii cloned and expressed in Escherichia coli〔J〕.J Immunol，1991，147∶1975.
, 百拇医药
31，Lunden A，et al.Immune reponse and resistance to Toxoplasma gondii in mice immunized with antigen of the parasite incorporated into immunostimulating complexes〔J〕.Infect Immun，1993，61∶2639.
32，Darcy F，et al.Protection of mice and nude rats against toxoplasmosis by a multiple antigenic peptide construction derived from Toxoplasma gondii P30 gene.〔J〕.J Immunol，1992，149∶3636.
33，Itaque，et al.Impairment of the cellular immune response in acute murine Toxoplasmosis∶regulation of interleukin 2 production and macrophage-mediated inhibitory efforts〔J〕.Infect Immun，1994，62∶2908.
, 百拇医药
34，Shirahata T，et al.Enhancement by recombinant human interleukin 2 of host resistance to Toxoplasma gondii infection in pregnant mice〔J〕.Microbiol Immunol，1993，37∶583.
35，Khan IA，et al.Production of γ-Interferon by cultured human lymphocytes stimulated with a purified membrane protein (P30) from Toxoplasma gondii〔J〕.J Infect Dis，1988，157∶979.
36，Lerner RA，et al.Chemically synthesized peptides predicted from the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome elicit antibodies reactive with the native envelop protein of Dane particles〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1981，78∶3403.
37，Wolff JA，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo〔J〕.Science，1990，247∶1465.
38，Ulmer JB，et al.Heterologous protein against influenza by injection of DNA encoding a viral protein〔J〕.Science，1993，259∶1745., http://www.100md.com