乙型肝炎病毒全基因组扩增方法研究进展
http://www.100md.com
国外医学病毒学分册 2000年第7卷第2期
乙型肝炎病毒全基因组扩增方法研究进展
第四军医大学流行病学教研室 (西安 710032) 李 端(综述) 闫永平(审校)
摘 要 HBV基因全长PCR扩增为HBV基因结构的多样性与致病性和传播途径等关系的研究提供了全新的技术，在HBV研究中已显示了巨大优越性。本文对该方法的几个主要技术问题研究进展作了简要综述。
关键词：乙型肝炎病毒 全基因组 HBV PCR扩增
目前，研究HBV基因序列多样性及其在病因和病毒蛋白表达上的作用已成为乙肝病毒研究的热点[1，2]。但多数研究仅限于某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序。由于HBV基因内部有调控基因，基因片段间又相互重叠，很可能形成HBV不同基因群片段构成一个可供分析的HBV基因片段，使出现在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系无法精确和全面分析。有研究发现，由于病毒体内存在不同变异株，这种直接测部分序列的方法不能准确的提示病毒基因结构与病因及传播的关系[3]。而且，以往对HBV全基因的克隆需从大量血清中提取HBV，故难以对不同患者单一毒株作HBV全基因克隆。Cunther等[4]于1995年建立了一种HBV全长聚合酶链反应(full-length,PCR),不需基因片段的重组，也不需要信赖基因中原有的限制性酶切位点，就可以从HBV低滴度血清中分离，克隆大量全长HBV基因，有效的扩增整个病毒DNA序列，对有意义的毒株进行全基因测序，简便的在基因结构水平进行基因突变，基因型及半定量研究，从而为研究HBV毒株的基因结构与功能提供了新的方法。现就扩增全长HBV DNA 几个主要技术问题研究进展综述如下：
, 百拇医药
1 引物的选择
引物与模板的特异性结合，多聚酶对引物的有效延伸是PCR特异性及扩增效率的关键动力学因素。但是，HBV基因组的特殊结构限制了PCR引物的选择，使扩增全基因极为困难。Cunther等发现，如果延伸越过整个HBV基因序列中的两个缺口区，与扩增连续的基因片段相比，效率约降低1 000倍。因此，选择位于缺口区的引物就可以避免延伸跨越缺口区。Tellier等[5]设计了位于负链末端极保守区的引物，可以扩增大多数HBV感染者的完整基因。
同时，Gunther等设计的引物中含有SapI,HindⅢ以及Sst I三个酶切位点。Sap I的识别位点与酶切位点不同，故可通过用Sap I酶切克降载体的HBV全基因，在已发表的39株HBV全基因中，仅有2株序列中含Sap I酶切点，因而，用Ssp I酶切HBV全基因克降以获得HBV完整的全基因适用于大多数HBV毒株。而所发表的HBV全基因分别只有4株和2株序列中含有HindⅢ及Sst I酶切位点，且没有1株同时包含两种酶切位点，引物中设计的HindⅢ及Sst I酶切点，有利于将扩增的片段克降入载体中。由于我国HBV adr株存在HindⅢ酶切点但无Sap I酶切点。何建文等在设计HBV全基因扩增时，将酶切序列由HindⅢ改为Sap I，也获得了较好效果。
, 百拇医药
2 DNA聚合酶的选择
用于标准PCR的Taq酶有很强的5＇→3＇聚合酶活性，但没有3＇→5＇外切核酸作用无法消除扩增过程中出现的突变和由此产生的新合成的核酸链3＇端与模板链的错配。因此Taq聚合酶催化的反应，碱基错误掺入率可高达10-4/碱基/循环[6]。用于全长PCR克降出单个DNA分子，其序列则不太可靠，据Gunther报道，Expanc High Fidelity 扩增系统，用具有校阅功能的Pwo聚合酶与Taq酶的DNA聚合酶混合物代替Taq酶用于全长 PCR，当扩增1fg的HBV DNA，PCR产物为1ug时，人为造成的突变核苷酸仅为8.3kb，仅1个核苷酸突变。Tellier等将Klentaql与具有校阅功能的Pfu酶按15：1混合，制成KLA-16 DNA集合酶混合物，用于HBV全基因扩增，合成大片段DNA的能力大大提高，人工突变率也很低。因此，在全长PCR中，在不影响HBV含量较低的血清扩增效率的同时应增加具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，以双聚合酶战略消除DNA合成中出现的引起PCR终止的错配碱基而使产物得以继续延伸，是保证扩增出的全长HBV基因序列可靠性的方法之一[7]。已报道的有rTth和Vent聚合酶的混合酶，Am-PliTaq酶与Pfu按8∶1混合形成的Advantage Klen Taq DNA聚合酶混合物用于扩增大片段核酸均取得了较好成果。
, http://www.100md.com
3 模板的制备
模板DNA的完整性是决定大片段核酸扩增的关键，常规制备模板DNA的方法是用蛋白酶K等裂解液将血清或组织消化，然后经饱和酚和氯仿抽提，用乙醇沉淀后待扩增，有人比较过不同方法提取的DNA模板对扩增大片段基因的影响，结果高盐，大孔透析和阴离子交换树脂等方法较传统地酚提取方法能更好地保持模板DNA的完整性。
4 热启动PCR
1991年D’ Aquaila等[8]正式提出热启动PCR概念，即在高温(70℃左右)下使酶，模板DNA与引物混合，并与传统PCR进行对比实验，发现热启动RCR可显著增加特异产物的量，减少非特异产物和背景，使低拷贝数病毒更易检出，其后Chou等[9]对这一技术与标准PCR进行了严密的实验比较，证实室温下加样所形成的引物错导和引物聚体是影响PCR特异性和敏感性的两个重要原因。热启动可避免PCR反应中引物与模板的非特异性复性和扩增，这对扩增大片段核酸非常重要。Gunther等在用EXpand High Fidelity 扩增系统扩增全长HBV基因时，采用热启动方法，大大提高了基因扩增的特异性和灵敏性 。
, 百拇医药
5 温度循环参数
全长HBV PCR系统多采用退火和延伸结合的“双温”反应，或退火和延伸温度极其接近，以提高扩增的特异性和效率，延伸温度一般为68℃ 。Gunther采用扩增全长HBV DNA RCR反应程序是：每一循环94℃变性40s，60℃退火1.5min,68℃延伸3min,每10个循环增加延伸时间2min,共进行40个循环,由于在较后的循环中,产物浓度增大,酶减少,dNTP减少,适当延长延伸时间可让引物与模板充分结合,使聚合酶合成期望产物的长度,非特异性扩增也较少,同时尽可能减少热循环次数以减少PCR诱导的错配率.Tellier等扩增全长HBV DNA PCR反应共进行了35个循环,并采用不同的延伸时间作比较,最终发现,最初25个循环每循环延伸6min,后10个循环延伸12min,可达到最佳的扩增效率。
6 应用
, 百拇医药
HBV全长PCR扩增为HBV基因结构和多样性与致病性和传播途径等关系的研究提供了全新的技术，在HBV研究中已显示了巨大的优越性。Sommer等[10]对10例乙肝病人的血清中HBV DNA做全长PCR扩增，发现4例病人基因序列中含有约60到100个核苷长度的poly(dA)序列，提示HBV p蛋白选择具有poly(A)尾的病毒前基因组RNA作为反转录的模板，引起DNA负链发生突变，变异株的产生导致HBV致病性和临床表现的明显改变。Gunther等[11]从7例乙型肝炎病毒携带者中用全长PCR分离出大量含缺失突变的HBV基因，经克隆，测序等分析发现，由拼接的前基因RNA包装和反转录产生了有缺失突变的HBV基因，提示有特殊的“拼接”基因变异株存在，并证明其与乙型肝炎慢性感染有密切关系。突破了以往根据基因片段只能研究“单一拼接”基因而不能检出其它拼接基因的局限性。最后，Sterneck等[12]应用该方法HBsAg阳性母亲与出生后发生暴发性肝炎的婴儿HBV基因结构的研究。结果表明前C区终止码突变。C区T-1762和A-1760突变以及前S2启动码变可能是暴发性肝炎发生的原因。因此，利用全长HBV PCR可进行HBV全长序列与HBV复制，表达的研究及从基因水平入手，进行乙型肝炎致病因素与传播机理的探索，并可从总体上把握致病基因间的相互关系。可以预料，HBV全长PCR将大大推进对HBV毒株结构和功能的研究。
, http://www.100md.com
自全长PCR技术开展以来，已陆续的用于多种病毒基因结构的研究。1995年Salminen等[13]首次用此技术直接扩增来自不同组织的HIV 1全长DNA，并构建了具有完全复制能力的HIV I病毒克隆，为HIV的研究提供了新的方法。全长PCR在人类乳头瘤病毒[14]，HAV[15]等基因结构的研究都取得了良好的效果。但由于全长基因扩增的技术困难较大，影响因素较多，目前还很难应用在其它病毒方面。随着PCR技术的提高，全长基因扩增将会有更广泛的应用。
参考文献
1 Buckwold V, et al. J Virol ,1996;70(9):5848-5851
2 Sato S, et al. Ann lntern med ,1995(3):122:241-246
, http://www.100md.com
3 Netter H, et al. J Gen Virol,1997;78(7):1707-1718
4 Gunther S, et al. J Virol,1995 l69(9):5437-5444
5 Tellier R, et al. J Clin Microbiol ,1996;34(12):3085-3091
6 Kwok S, et al. Nature ,1989,339(18):237-238
7 Gunther S et al. J Clin Microbiol 1998;36(2):531-538
8 D' Aquaila R, et al. Nucleic Acids Research ,1991;19(13):3749
, 百拇医药
9 Chou Q, et al. Nucleic Acids Research,1992;20(7):1717
10 Sommer G, et al. Virology,1997;239(2):402-412
11 Gunther S, et al. Virology ,1997 ;238(2);363-371
12 Sterneck M,et al. JID,1998;177(5):1378-1381
13 Salminen M, et al. Virology 1995;213(1):80-86
14 Stewart A, et al. Genome Res, 1995;5(1):79-88
15 Tellier R, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93(11):4370-4373, 百拇医药
第四军医大学流行病学教研室 (西安 710032) 李 端(综述) 闫永平(审校)
摘 要 HBV基因全长PCR扩增为HBV基因结构的多样性与致病性和传播途径等关系的研究提供了全新的技术，在HBV研究中已显示了巨大优越性。本文对该方法的几个主要技术问题研究进展作了简要综述。
关键词：乙型肝炎病毒 全基因组 HBV PCR扩增
目前，研究HBV基因序列多样性及其在病因和病毒蛋白表达上的作用已成为乙肝病毒研究的热点[1，2]。但多数研究仅限于某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序。由于HBV基因内部有调控基因，基因片段间又相互重叠，很可能形成HBV不同基因群片段构成一个可供分析的HBV基因片段，使出现在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系无法精确和全面分析。有研究发现，由于病毒体内存在不同变异株，这种直接测部分序列的方法不能准确的提示病毒基因结构与病因及传播的关系[3]。而且，以往对HBV全基因的克隆需从大量血清中提取HBV，故难以对不同患者单一毒株作HBV全基因克隆。Cunther等[4]于1995年建立了一种HBV全长聚合酶链反应(full-length,PCR),不需基因片段的重组，也不需要信赖基因中原有的限制性酶切位点，就可以从HBV低滴度血清中分离，克隆大量全长HBV基因，有效的扩增整个病毒DNA序列，对有意义的毒株进行全基因测序，简便的在基因结构水平进行基因突变，基因型及半定量研究，从而为研究HBV毒株的基因结构与功能提供了新的方法。现就扩增全长HBV DNA 几个主要技术问题研究进展综述如下：
, 百拇医药
1 引物的选择
引物与模板的特异性结合，多聚酶对引物的有效延伸是PCR特异性及扩增效率的关键动力学因素。但是，HBV基因组的特殊结构限制了PCR引物的选择，使扩增全基因极为困难。Cunther等发现，如果延伸越过整个HBV基因序列中的两个缺口区，与扩增连续的基因片段相比，效率约降低1 000倍。因此，选择位于缺口区的引物就可以避免延伸跨越缺口区。Tellier等[5]设计了位于负链末端极保守区的引物，可以扩增大多数HBV感染者的完整基因。
同时，Gunther等设计的引物中含有SapI,HindⅢ以及Sst I三个酶切位点。Sap I的识别位点与酶切位点不同，故可通过用Sap I酶切克降载体的HBV全基因，在已发表的39株HBV全基因中，仅有2株序列中含Sap I酶切点，因而，用Ssp I酶切HBV全基因克降以获得HBV完整的全基因适用于大多数HBV毒株。而所发表的HBV全基因分别只有4株和2株序列中含有HindⅢ及Sst I酶切位点，且没有1株同时包含两种酶切位点，引物中设计的HindⅢ及Sst I酶切点，有利于将扩增的片段克降入载体中。由于我国HBV adr株存在HindⅢ酶切点但无Sap I酶切点。何建文等在设计HBV全基因扩增时，将酶切序列由HindⅢ改为Sap I，也获得了较好效果。
, 百拇医药
2 DNA聚合酶的选择
用于标准PCR的Taq酶有很强的5＇→3＇聚合酶活性，但没有3＇→5＇外切核酸作用无法消除扩增过程中出现的突变和由此产生的新合成的核酸链3＇端与模板链的错配。因此Taq聚合酶催化的反应，碱基错误掺入率可高达10-4/碱基/循环[6]。用于全长PCR克降出单个DNA分子，其序列则不太可靠，据Gunther报道，Expanc High Fidelity 扩增系统，用具有校阅功能的Pwo聚合酶与Taq酶的DNA聚合酶混合物代替Taq酶用于全长 PCR，当扩增1fg的HBV DNA，PCR产物为1ug时，人为造成的突变核苷酸仅为8.3kb，仅1个核苷酸突变。Tellier等将Klentaql与具有校阅功能的Pfu酶按15：1混合，制成KLA-16 DNA集合酶混合物，用于HBV全基因扩增，合成大片段DNA的能力大大提高，人工突变率也很低。因此，在全长PCR中，在不影响HBV含量较低的血清扩增效率的同时应增加具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，以双聚合酶战略消除DNA合成中出现的引起PCR终止的错配碱基而使产物得以继续延伸，是保证扩增出的全长HBV基因序列可靠性的方法之一[7]。已报道的有rTth和Vent聚合酶的混合酶，Am-PliTaq酶与Pfu按8∶1混合形成的Advantage Klen Taq DNA聚合酶混合物用于扩增大片段核酸均取得了较好成果。
, http://www.100md.com
3 模板的制备
模板DNA的完整性是决定大片段核酸扩增的关键，常规制备模板DNA的方法是用蛋白酶K等裂解液将血清或组织消化，然后经饱和酚和氯仿抽提，用乙醇沉淀后待扩增，有人比较过不同方法提取的DNA模板对扩增大片段基因的影响，结果高盐，大孔透析和阴离子交换树脂等方法较传统地酚提取方法能更好地保持模板DNA的完整性。
4 热启动PCR
1991年D’ Aquaila等[8]正式提出热启动PCR概念，即在高温(70℃左右)下使酶，模板DNA与引物混合，并与传统PCR进行对比实验，发现热启动RCR可显著增加特异产物的量，减少非特异产物和背景，使低拷贝数病毒更易检出，其后Chou等[9]对这一技术与标准PCR进行了严密的实验比较，证实室温下加样所形成的引物错导和引物聚体是影响PCR特异性和敏感性的两个重要原因。热启动可避免PCR反应中引物与模板的非特异性复性和扩增，这对扩增大片段核酸非常重要。Gunther等在用EXpand High Fidelity 扩增系统扩增全长HBV基因时，采用热启动方法，大大提高了基因扩增的特异性和灵敏性 。
, 百拇医药
5 温度循环参数
全长HBV PCR系统多采用退火和延伸结合的“双温”反应，或退火和延伸温度极其接近，以提高扩增的特异性和效率，延伸温度一般为68℃ 。Gunther采用扩增全长HBV DNA RCR反应程序是：每一循环94℃变性40s，60℃退火1.5min,68℃延伸3min,每10个循环增加延伸时间2min,共进行40个循环,由于在较后的循环中,产物浓度增大,酶减少,dNTP减少,适当延长延伸时间可让引物与模板充分结合,使聚合酶合成期望产物的长度,非特异性扩增也较少,同时尽可能减少热循环次数以减少PCR诱导的错配率.Tellier等扩增全长HBV DNA PCR反应共进行了35个循环,并采用不同的延伸时间作比较,最终发现,最初25个循环每循环延伸6min,后10个循环延伸12min,可达到最佳的扩增效率。
6 应用
, 百拇医药
HBV全长PCR扩增为HBV基因结构和多样性与致病性和传播途径等关系的研究提供了全新的技术，在HBV研究中已显示了巨大的优越性。Sommer等[10]对10例乙肝病人的血清中HBV DNA做全长PCR扩增，发现4例病人基因序列中含有约60到100个核苷长度的poly(dA)序列，提示HBV p蛋白选择具有poly(A)尾的病毒前基因组RNA作为反转录的模板，引起DNA负链发生突变，变异株的产生导致HBV致病性和临床表现的明显改变。Gunther等[11]从7例乙型肝炎病毒携带者中用全长PCR分离出大量含缺失突变的HBV基因，经克隆，测序等分析发现，由拼接的前基因RNA包装和反转录产生了有缺失突变的HBV基因，提示有特殊的“拼接”基因变异株存在，并证明其与乙型肝炎慢性感染有密切关系。突破了以往根据基因片段只能研究“单一拼接”基因而不能检出其它拼接基因的局限性。最后，Sterneck等[12]应用该方法HBsAg阳性母亲与出生后发生暴发性肝炎的婴儿HBV基因结构的研究。结果表明前C区终止码突变。C区T-1762和A-1760突变以及前S2启动码变可能是暴发性肝炎发生的原因。因此，利用全长HBV PCR可进行HBV全长序列与HBV复制，表达的研究及从基因水平入手，进行乙型肝炎致病因素与传播机理的探索，并可从总体上把握致病基因间的相互关系。可以预料，HBV全长PCR将大大推进对HBV毒株结构和功能的研究。
, http://www.100md.com
自全长PCR技术开展以来，已陆续的用于多种病毒基因结构的研究。1995年Salminen等[13]首次用此技术直接扩增来自不同组织的HIV 1全长DNA，并构建了具有完全复制能力的HIV I病毒克隆，为HIV的研究提供了新的方法。全长PCR在人类乳头瘤病毒[14]，HAV[15]等基因结构的研究都取得了良好的效果。但由于全长基因扩增的技术困难较大，影响因素较多，目前还很难应用在其它病毒方面。随着PCR技术的提高，全长基因扩增将会有更广泛的应用。
参考文献
1 Buckwold V, et al. J Virol ,1996;70(9):5848-5851
2 Sato S, et al. Ann lntern med ,1995(3):122:241-246
, http://www.100md.com
3 Netter H, et al. J Gen Virol,1997;78(7):1707-1718
4 Gunther S, et al. J Virol,1995 l69(9):5437-5444
5 Tellier R, et al. J Clin Microbiol ,1996;34(12):3085-3091
6 Kwok S, et al. Nature ,1989,339(18):237-238
7 Gunther S et al. J Clin Microbiol 1998;36(2):531-538
8 D' Aquaila R, et al. Nucleic Acids Research ,1991;19(13):3749
, 百拇医药
9 Chou Q, et al. Nucleic Acids Research,1992;20(7):1717
10 Sommer G, et al. Virology,1997;239(2):402-412
11 Gunther S, et al. Virology ,1997 ;238(2);363-371
12 Sterneck M,et al. JID,1998;177(5):1378-1381
13 Salminen M, et al. Virology 1995;213(1):80-86
14 Stewart A, et al. Genome Res, 1995;5(1):79-88
15 Tellier R, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93(11):4370-4373, 百拇医药