我国恙虫病立克次体(恙虫病东方体)分型研究近况
郭恒彬
关键词；恙虫病立克次体(恙虫病东方体) 分型 恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi,Rt)是恙虫病病原体，自从1931年定名以来，陆续发现Rt流行株，得到国际公认的有Gilliam，Karp，Kato，TA678，TA686，TA716，TA763和H1877 8个血清型[1]，而Gilliam、Karp、Kato三型作为国际标准参照株。80年代初，日本[2]又分离到Kawasaki、Kuroki和Shimokoshi三型。在病原体的研究中，流行病学专家关注的问题，也就是病原体的分型，病原体的分型方法可分为表型分型和基因分型。有关Rt分型研究作简要叙述。
血清学分型 血清学分型是表型分型方法的一种，在我国自从1983年张海莲[3]报道用间接免疫荧光法(IFA)、补体结合法(CF)等血清学方法对Rt分型以来，一直沿用这些方法用于Rt分型。对我国Rt分型结果表明，恙虫病疫区存在Gilliam,Karp,Kato三株标准参照株Rt外，还存在着Gilliam+Karp,Gilliam+Kato,Karp+Kato,Gilliam+Karp+Kato的混合感染株[5～6]以及未定型株[1，3，6]Rt，各地血清学分型结果见表1。所报道的混合型或未定型流行株Rt的抗原型别就难以肯定是何株型，是新型别还是变异株。血清学分型，在国内应用的抗原均为多克隆抗原，抗体也为多克隆抗体，Kawamura[7]等报道，在CF、IFA试验中Rt抗原与相应抗体均存在交叉反应，只有应用单克隆抗体才有可能克服交叉反应，对型别鉴定有特异性。但他们也发现个别Rt的单抗仍有交叉反应，如Karp、Kato型单抗可与Kuroki型Rt起反应，效价可达320，与其它几型则<40。1993年，内川公人报道[7]单克隆抗体研制成功以后，在日本鉴定81株Rt，都仅具单一的抗原型，而未发现具有复数抗原型Rt，由此，就否定了过去患者和实验动物可由抗原型不同的立克次体株混合感染的报道。那么我国报道的混合型和未定型流行株Rt，是什么型别，能否排除混合感染型和确定未定型Rt的型别，它们的遗传特征是如何，值得深入研究，要查明这些，血清学方法是难以得出正确结论。
, 百拇医药
表1 我国Rt流行性株血清学分型结果
报道时间
报告人
标本来源
分型方法
分型结果
1983
张海莲
海南岛
IFA CF
Kp Kt G h w
1983
, 百拇医药 陈渊民
云南
IFA CF
G Kt Kp TA686 w
1983
于恩庶
福建
IFA CF
G Kp TA716 w
1988
张海莲
广西
IFA CF
, 百拇医药
G Kp h w
1988
陈香蕊
山东
(G)
1988
李光密
湘西
IFA
G
1988
魏晋举
浙江
, 百拇医药
G
1992
于长水
天津
CF
G
1993
郭恒彬
江苏
IFA CF
(G)
1993
胡玲美
, http://www.100md.com
吉林
IFA CF
G
1997
陈渊民
云南
IFA
G
1998
陈香蕊
山西
IFA
(G)
, 百拇医药
IFA：间接免疫荧光 CF：补体结合试验 G：Gilliam Kp：Kap Kt：Kato h：混合型 w：未定型
基因分型 基因分型是近十几年发展起来的技术和方法，主要包括质粒分析、核酸分子杂交、核苷酸限制性片段长度多态性分析(RFLP)、rRNA分型、PCR技术及核苷酸序列分析等。在Rt基因的分型中，目前报道的主要方法是PCR、PFCR/RFLP分型和目的基因序列测定来判断遗传特征。1993年[8]Furuya等首先构建Rt-56kDa抗原基因序列的5株Rt型引物对，套式PCR扩增分型，分别扩增出各特异的大小不同的5个相应株型的DNA片段，来判断Rt型别研究，并用于临床标本的检测和分型。1995年[2]Kawamura报道用PCR/RFCP分析，对标准参照株Rt和分离株Rt分型研究。他选择Hha Ⅰ、SfaN Ⅰ、Mnl Ⅰ、AlwN Ⅰ、Bgl Ⅱ、Mbo Ⅱ6种核苷酸内切酶对PCR扩增产物的150～168bp DNA片段切割、分型。达到理想分型效果。1997年[9]张海红报道，参照Furuya设计引物，对广东佛山、海南等地Rt的分型结果，表明这两地区Rt的流行株型别均为Karp型。1998年[10]，陈香蕊等报道构建Rt-56kDa抗原基因引物，扩增出1 200bpDNA片段，选择Hae Ⅱ、Hinf Ⅰ、Hha Ⅰ切割DNA片段，结果山西3株分离株Rt的PCR/RFLP电泳图谱一致，但与标准参照株有差异(血清学分型为Gilliam型)，属于何型有待进一步研究。
, 百拇医药
1995年郭恒彬[11]报道参照Furuya构建的引物对江苏分离株Rt进行PCR分型，结果与Gilliam，Karp，Kato和Kuroki型引物无相应扩增带，而只与Kawasaki型引物扩增出相应片段带。1996年[12]又对现场采集的单个小盾纤恙螨体内Rt的检测及分型，为克服恙螨幼虫个体微小，体内立克次体数量也相对少，防止制备悬液提取模板DNA时丢失过多等问题，改用直接在0.5ml塑质离心管中制备悬液和提取模板DNA，分型结果也属Kawasaki型。而后又自行设计构建Rt-56kDa群型引物，对江苏恙虫病疫区的鼠、螨、人中分离的Rt进行PCR，PCR/RFLP分型[13]，选择2株Rt的群引物扩增的产物，对目的基因序列测定[14]。PCR分型结果表明，5株Rt均属Kawasaki型；将群引物扩增的PCR产物选用San BI,Hha Ⅰ,Bgl Ⅱ三种酶切割PCR产物后的PCR/RFLP电泳图谱与Kawasaki型相同，但江苏株Rt相应目的基因片段中无Hha Ⅰ酶切位点，经序列测定结果江苏株核片段的Hha Ⅰ酶切位点碱基序列GCGC变异为GTGC；该片段与Kawasaki型相应片段碱基序列同源性>96.8%，而与其它5株参照株Rt同原性<52%，表明江苏Rt应属于Kawasaki型，但与日本Kawasaki型Rt有遗传差异。1996年对山东蒙阴县分离到的Rt经PCR检测及PCR分型，14份标本均属Kawasaki型[15]。1997年对[16]为福建省南日岛从恙虫病病人分离到2株Rt经PCR分型属Karp型。
, 百拇医药
Rt的基因分型前景 病原体的基因分型与表型分型比较，基因分型更直观，更稳定和分辨率高的特点。特别对同源克隆的鉴别提供了有用的技术方法。如表型分型的混合型和未定型Rt，用基因分型就可以明确Rt的型别、变异株或新型别。但研究表明，任何一种方法均有各自的优点和不足，不是一种基因分型技术完全能达到理想的结果。例如单用PCR对Rt分型，其型引物必定选自目的基因的可变区(不稳定区)，这样所构建的型引物只能用于已知序列的相应株型的Rt，而对变异株或新株型就不能分型或漏型。结合PCR/RFLP分析型别，又可以弥补PCR分型的缺陷，因PCR扩增的引物为群引物，其引物是在目的基因的位点上选自稳定区(不变区)，在该位点上碱基变异机率比可变区少，在检测中不易漏检，选择已知该片段酶切位点的酶，进行RFLP分析，就可判断型别。但单用PCR/RFLP分析来分型，也不易正确定型，因为酶切位点中任何一个碱的改变均不能切割，而该基因所编码的蛋白质不一定改变。江苏株Rt在目的基因中无Hha Ⅰ酶切位点。如山西株Rt的PCR/RFLP电泳图谱与标准参照株均存在明显差异，属于哪一型，还是新型就难以确定，特别是在长片段的RFLP分析中，同一酶的酶切位点多，变异程度更大，更难以确认。目的基因序列测定不易普及应用，但它能较准确反映出流行株遗传特点，与标准参照株序列同源性比较，得出较理想的结论。江苏株Rt经PCR、PCR/RFLP以及目的基因序列测定的结果，基本定为Kawasaki型Rt或Kawasaki型亚型，在我国属首次报道。
, http://www.100md.com
在流行病学调查的病原体分型中，血清学分型方法也是不可缺少，但对于充分了解流行株Rt的遗传特征、变异程度、新型别的发现提供可靠的本质性的理论依据，必须采用基因分型，才能较准确地判断分离株Rt的型别。因此，在我国Rt分型研究中基因分型值得推广应用，提高我国Rt研究整体水平。
郭恒彬(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
参考文献
1，魏 曦主编.医用立克次体〔M〕.上海：上海科学技术出版社，1984，280～283.
2，Kawamura,A,Hiroshi Tanaka,Jr.Tamura,A.Tsutsugamushi Disease 〔M〕.university of Tokyo Press,1995,64～69.
, 百拇医药
3，张海莲，邵兰，赵树萱，等.应用微量间接免疫荧光试验进行恙虫病立克次体血清分型〔C〕.立克次体 衣原体 弓形体专辑，1983，65.
4，范明远.中国立克次体病研究概述〔J〕.中国人兽共患病杂志，1991，7(2)∶16.
5，张海莲，刘玉瑛，王树声，等.广西地区恙虫病立克次体的血清学分型和生物学特性研究〔J〕.中华流行病学杂志，1989，10(特刊3号)∶76.
6，陈渊民，冯锡光，雷亚民.云南恙虫病立克次体血清分型〔J〕.中国人兽共患病杂志，1997，13(1)∶13.
7，内川公人.亚洲恙虫病的最近研究.医学动物防制〔J〕.1993，9(1)∶5.
8，Furuya,Y.,Yoshida,Y.,Katayama,T.,et al.Serotype-specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by nested Polymerase chain reaction〔J〕.J Clini Microiol，1993，31(16)∶1637.
, 百拇医药
9，张海红，黎家灿.分子技术鉴定恙螨鼠宿主和患者恙虫病立克次体流行株型的实验研究〔C〕.广东寄生虫学会年报，1997，19∶20.
10，陈香蕊，牛华，张永国，等.山西恙虫病立克次体分型及其56kD蛋白基因序列分析〔J〕.中国人兽共患病杂志，1998，14(3)∶21.
11，郭恒彬，吴光华，唐家琪，等.应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体〔J〕.中国人兽共患病杂志，1995，11(2)∶22.
12，郭恒彬，吴光华，潘秀珍，等.用PCR检测现场单个小盾纤恙螨体内恙虫病立克次体的研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1996，12(1)∶10.
13，郭恒彬，唐家琪，李先富，等.PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究〔J〕.临床检验杂志，1998，16(2)∶71.
14，郭恒彬，唐家琪，李先富，等.我国新型恙虫病立克次体目标基因的PCR/RFLP和序列分析研究〔J〕.中国公共卫生学报，1997，16(4)∶193.
15，王均利，郭恒彬，唐家琪，等.山东蒙阴县恙虫病立克次体的PCR检测和分型研究〔J〕.现代预防医学，1998，25(2)；156.
16，黄昭穗，郭恒彬，刘开源，等.南日岛恙虫病流行病学调查与病原分型〔J〕.南京部队医药，1998，2∶17., 百拇医药
关键词；恙虫病立克次体(恙虫病东方体) 分型 恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi,Rt)是恙虫病病原体，自从1931年定名以来，陆续发现Rt流行株，得到国际公认的有Gilliam，Karp，Kato，TA678，TA686，TA716，TA763和H1877 8个血清型[1]，而Gilliam、Karp、Kato三型作为国际标准参照株。80年代初，日本[2]又分离到Kawasaki、Kuroki和Shimokoshi三型。在病原体的研究中，流行病学专家关注的问题，也就是病原体的分型，病原体的分型方法可分为表型分型和基因分型。有关Rt分型研究作简要叙述。
血清学分型 血清学分型是表型分型方法的一种，在我国自从1983年张海莲[3]报道用间接免疫荧光法(IFA)、补体结合法(CF)等血清学方法对Rt分型以来，一直沿用这些方法用于Rt分型。对我国Rt分型结果表明，恙虫病疫区存在Gilliam,Karp,Kato三株标准参照株Rt外，还存在着Gilliam+Karp,Gilliam+Kato,Karp+Kato,Gilliam+Karp+Kato的混合感染株[5～6]以及未定型株[1，3，6]Rt，各地血清学分型结果见表1。所报道的混合型或未定型流行株Rt的抗原型别就难以肯定是何株型，是新型别还是变异株。血清学分型，在国内应用的抗原均为多克隆抗原，抗体也为多克隆抗体，Kawamura[7]等报道，在CF、IFA试验中Rt抗原与相应抗体均存在交叉反应，只有应用单克隆抗体才有可能克服交叉反应，对型别鉴定有特异性。但他们也发现个别Rt的单抗仍有交叉反应，如Karp、Kato型单抗可与Kuroki型Rt起反应，效价可达320，与其它几型则<40。1993年，内川公人报道[7]单克隆抗体研制成功以后，在日本鉴定81株Rt，都仅具单一的抗原型，而未发现具有复数抗原型Rt，由此，就否定了过去患者和实验动物可由抗原型不同的立克次体株混合感染的报道。那么我国报道的混合型和未定型流行株Rt，是什么型别，能否排除混合感染型和确定未定型Rt的型别，它们的遗传特征是如何，值得深入研究，要查明这些，血清学方法是难以得出正确结论。
, 百拇医药
表1 我国Rt流行性株血清学分型结果
报道时间
报告人
标本来源
分型方法
分型结果
1983
张海莲
海南岛
IFA CF
Kp Kt G h w
1983
, 百拇医药 陈渊民
云南
IFA CF
G Kt Kp TA686 w
1983
于恩庶
福建
IFA CF
G Kp TA716 w
1988
张海莲
广西
IFA CF
, 百拇医药
G Kp h w
1988
陈香蕊
山东
(G)
1988
李光密
湘西
IFA
G
1988
魏晋举
浙江
, 百拇医药
G
1992
于长水
天津
CF
G
1993
郭恒彬
江苏
IFA CF
(G)
1993
胡玲美
, http://www.100md.com
吉林
IFA CF
G
1997
陈渊民
云南
IFA
G
1998
陈香蕊
山西
IFA
(G)
, 百拇医药
IFA：间接免疫荧光 CF：补体结合试验 G：Gilliam Kp：Kap Kt：Kato h：混合型 w：未定型
基因分型 基因分型是近十几年发展起来的技术和方法，主要包括质粒分析、核酸分子杂交、核苷酸限制性片段长度多态性分析(RFLP)、rRNA分型、PCR技术及核苷酸序列分析等。在Rt基因的分型中，目前报道的主要方法是PCR、PFCR/RFLP分型和目的基因序列测定来判断遗传特征。1993年[8]Furuya等首先构建Rt-56kDa抗原基因序列的5株Rt型引物对，套式PCR扩增分型，分别扩增出各特异的大小不同的5个相应株型的DNA片段，来判断Rt型别研究，并用于临床标本的检测和分型。1995年[2]Kawamura报道用PCR/RFCP分析，对标准参照株Rt和分离株Rt分型研究。他选择Hha Ⅰ、SfaN Ⅰ、Mnl Ⅰ、AlwN Ⅰ、Bgl Ⅱ、Mbo Ⅱ6种核苷酸内切酶对PCR扩增产物的150～168bp DNA片段切割、分型。达到理想分型效果。1997年[9]张海红报道，参照Furuya设计引物，对广东佛山、海南等地Rt的分型结果，表明这两地区Rt的流行株型别均为Karp型。1998年[10]，陈香蕊等报道构建Rt-56kDa抗原基因引物，扩增出1 200bpDNA片段，选择Hae Ⅱ、Hinf Ⅰ、Hha Ⅰ切割DNA片段，结果山西3株分离株Rt的PCR/RFLP电泳图谱一致，但与标准参照株有差异(血清学分型为Gilliam型)，属于何型有待进一步研究。
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1995年郭恒彬[11]报道参照Furuya构建的引物对江苏分离株Rt进行PCR分型，结果与Gilliam，Karp，Kato和Kuroki型引物无相应扩增带，而只与Kawasaki型引物扩增出相应片段带。1996年[12]又对现场采集的单个小盾纤恙螨体内Rt的检测及分型，为克服恙螨幼虫个体微小，体内立克次体数量也相对少，防止制备悬液提取模板DNA时丢失过多等问题，改用直接在0.5ml塑质离心管中制备悬液和提取模板DNA，分型结果也属Kawasaki型。而后又自行设计构建Rt-56kDa群型引物，对江苏恙虫病疫区的鼠、螨、人中分离的Rt进行PCR，PCR/RFLP分型[13]，选择2株Rt的群引物扩增的产物，对目的基因序列测定[14]。PCR分型结果表明，5株Rt均属Kawasaki型；将群引物扩增的PCR产物选用San BI,Hha Ⅰ,Bgl Ⅱ三种酶切割PCR产物后的PCR/RFLP电泳图谱与Kawasaki型相同，但江苏株Rt相应目的基因片段中无Hha Ⅰ酶切位点，经序列测定结果江苏株核片段的Hha Ⅰ酶切位点碱基序列GCGC变异为GTGC；该片段与Kawasaki型相应片段碱基序列同源性>96.8%，而与其它5株参照株Rt同原性<52%，表明江苏Rt应属于Kawasaki型，但与日本Kawasaki型Rt有遗传差异。1996年对山东蒙阴县分离到的Rt经PCR检测及PCR分型，14份标本均属Kawasaki型[15]。1997年对[16]为福建省南日岛从恙虫病病人分离到2株Rt经PCR分型属Karp型。
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Rt的基因分型前景 病原体的基因分型与表型分型比较，基因分型更直观，更稳定和分辨率高的特点。特别对同源克隆的鉴别提供了有用的技术方法。如表型分型的混合型和未定型Rt，用基因分型就可以明确Rt的型别、变异株或新型别。但研究表明，任何一种方法均有各自的优点和不足，不是一种基因分型技术完全能达到理想的结果。例如单用PCR对Rt分型，其型引物必定选自目的基因的可变区(不稳定区)，这样所构建的型引物只能用于已知序列的相应株型的Rt，而对变异株或新株型就不能分型或漏型。结合PCR/RFLP分析型别，又可以弥补PCR分型的缺陷，因PCR扩增的引物为群引物，其引物是在目的基因的位点上选自稳定区(不变区)，在该位点上碱基变异机率比可变区少，在检测中不易漏检，选择已知该片段酶切位点的酶，进行RFLP分析，就可判断型别。但单用PCR/RFLP分析来分型，也不易正确定型，因为酶切位点中任何一个碱的改变均不能切割，而该基因所编码的蛋白质不一定改变。江苏株Rt在目的基因中无Hha Ⅰ酶切位点。如山西株Rt的PCR/RFLP电泳图谱与标准参照株均存在明显差异，属于哪一型，还是新型就难以确定，特别是在长片段的RFLP分析中，同一酶的酶切位点多，变异程度更大，更难以确认。目的基因序列测定不易普及应用，但它能较准确反映出流行株遗传特点，与标准参照株序列同源性比较，得出较理想的结论。江苏株Rt经PCR、PCR/RFLP以及目的基因序列测定的结果，基本定为Kawasaki型Rt或Kawasaki型亚型，在我国属首次报道。
, http://www.100md.com
在流行病学调查的病原体分型中，血清学分型方法也是不可缺少，但对于充分了解流行株Rt的遗传特征、变异程度、新型别的发现提供可靠的本质性的理论依据，必须采用基因分型，才能较准确地判断分离株Rt的型别。因此，在我国Rt分型研究中基因分型值得推广应用，提高我国Rt研究整体水平。
郭恒彬(南京军区军事医学研究所 南京，210002)
参考文献
1，魏 曦主编.医用立克次体〔M〕.上海：上海科学技术出版社，1984，280～283.
2，Kawamura,A,Hiroshi Tanaka,Jr.Tamura,A.Tsutsugamushi Disease 〔M〕.university of Tokyo Press,1995,64～69.
, 百拇医药
3，张海莲，邵兰，赵树萱，等.应用微量间接免疫荧光试验进行恙虫病立克次体血清分型〔C〕.立克次体 衣原体 弓形体专辑，1983，65.
4，范明远.中国立克次体病研究概述〔J〕.中国人兽共患病杂志，1991，7(2)∶16.
5，张海莲，刘玉瑛，王树声，等.广西地区恙虫病立克次体的血清学分型和生物学特性研究〔J〕.中华流行病学杂志，1989，10(特刊3号)∶76.
6，陈渊民，冯锡光，雷亚民.云南恙虫病立克次体血清分型〔J〕.中国人兽共患病杂志，1997，13(1)∶13.
7，内川公人.亚洲恙虫病的最近研究.医学动物防制〔J〕.1993，9(1)∶5.
8，Furuya,Y.,Yoshida,Y.,Katayama,T.,et al.Serotype-specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by nested Polymerase chain reaction〔J〕.J Clini Microiol，1993，31(16)∶1637.
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9，张海红，黎家灿.分子技术鉴定恙螨鼠宿主和患者恙虫病立克次体流行株型的实验研究〔C〕.广东寄生虫学会年报，1997，19∶20.
10，陈香蕊，牛华，张永国，等.山西恙虫病立克次体分型及其56kD蛋白基因序列分析〔J〕.中国人兽共患病杂志，1998，14(3)∶21.
11，郭恒彬，吴光华，唐家琪，等.应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体〔J〕.中国人兽共患病杂志，1995，11(2)∶22.
12，郭恒彬，吴光华，潘秀珍，等.用PCR检测现场单个小盾纤恙螨体内恙虫病立克次体的研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1996，12(1)∶10.
13，郭恒彬，唐家琪，李先富，等.PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究〔J〕.临床检验杂志，1998，16(2)∶71.
14，郭恒彬，唐家琪，李先富，等.我国新型恙虫病立克次体目标基因的PCR/RFLP和序列分析研究〔J〕.中国公共卫生学报，1997，16(4)∶193.
15，王均利，郭恒彬，唐家琪，等.山东蒙阴县恙虫病立克次体的PCR检测和分型研究〔J〕.现代预防医学，1998，25(2)；156.
16，黄昭穗，郭恒彬，刘开源，等.南日岛恙虫病流行病学调查与病原分型〔J〕.南京部队医药，1998，2∶17., 百拇医药