男性不育者的支原体感染研究
丁秀原 葛云静 刘会恩
关键词：男性不育症 支原体 感染
男性不育症是泌尿科门诊的常见病之一，据1989年国内统计资料表明，大约有10%的育龄夫妇发生不育，而由男方造成的因素约占40%～50%，在诸多原因中因感染而引起的不育越来越受到人们的重视，现已发现有7种支原体可寄居在泌尿生殖道[1]，我们用聚合酶链反应(PCR)对男性不育者的支原体感染进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 不育组：91例男性均为婚后或配偶曾妊娠后2年以上不育者，性生活规律，无性功能障碍，既往或现在无泌尿生殖系统感染病史者，年龄在25～49岁，不育时间为2～21年。正常对照组：为已婚、生育能力正常，排除各种感染性疾病的健康男性，共20例，年龄在26～38岁。
, 百拇医药
以上两组受检者均按常规方法收集精液标本。
1.2 PCR检测解脲支原体(Ureaplasma ureaplycium,Uu)及生殖支原体(Mycoplasma genitalicum,Mg)。
1.2.1 精液模板DNA的提取 常规方法收集的精液液化后置于3000r/min离心8min，取上清液置-20℃冻存。样品用裂解法进行处理[2]：取精浆150～200μl，12000×g离心10min，沉淀加25μlA液(含10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L KCl,2.5mmol/L MgCl2)混匀10min后，加25μlB液(含10mmol/L Tris-HCl,2.5mmol/L MgCl2,1% Tween-20,1% Triton X-100,160μg/ml蛋白酶K)，55℃保温1.5h，95℃10min，10000×g离心10sec，取上清液做模板。
, 百拇医药
1.2.2 引物 根据文献报道[2，3]，设计解脲支原体引物序列为U4：5’-ACGACGTCCATAAGCAACT-3’，U5：5’-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3’，预期扩增片段长度为429bp。生殖支原体引物为MgPa-1：5’-AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG-3’，MgPa-3：5’-CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC-3’，预期扩增片段为281bp。
1.2.3 PCR反应条件 PCR反应体积25μl，检测Uu的反应中，每种引物为0.4μ mol/L，dNTP 200μ mol/L，标本提取液10μl，加入Taq DNA聚合酶和矿物油后，于DNA扩增仪进行PCR，循环条件为94℃预变性4min后，94℃20sec，62℃1min，72℃1min，35次循环后于72℃再延伸10min。检测Mg的PCR反应中，每种引物为0.2μ mol/L，dNTP 125μ mol/L，其余同上，循环条件为94℃预变性4min后，94℃1min，65℃1min，72℃1min，循环35次后于72℃再延伸6min。在80例不育者标本的检测中，每次试验均设已知阳性及阴性(培养基)样品为对照，以确保试验的可靠性。
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1.2.4 扩增产物检测 取10μl扩增产物与2μl溴酚蓝混合，加样于2%琼脂糖凝胶，为确定特异扩增片段大小，同时上样PBR322/MSPI，电泳100V，30min，紫外灯下观察结果。
1.3 支原体培养 取两组受检者精液标本进行Uu分离培养。
2 结果
2.1 PCR检测结果 按上述方法进行模板DNA制备，PCR扩增，Uu及Mg阳性标本均扩增出单一区带，其片段大小分别为429bp见图1；281bp见图2，与文献报道一致。受检的80名男性不育者精浆标本的Uu及Mg阳性检测率分别为35.1%(29/80)；21.3%(17/80)，两种支原体同时存在者占13.8%(11/80)。
2.2 支原体培养结果 91例不育男性及20例正常男性对照者Uu感染率分别为35.2%(32/91)；10%(2/20)，经统计学分析，P<0.05，提示两组间感染率有显著性差异。
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图1 PCR检测的Uu阳性特异扩增片段
图2 PCR检测的Mg阳性特异扩增片段
3 讨论
支原体(Mgcoplasma)又称类胸膜肺炎微生物，是原核生物中最小、最简单、无细胞壁的一类微生物。众所周知，引起人类泌尿生殖道感染的支原体主要有3种，即人型支原体、解脲支原体和生殖支原体。许多资料表明，生殖道支原体感染与非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、Reiter综合征、前庭大腺脓肿、肾盂肾炎、不育症等疾病有关。近年来，各国有关学者对支原体与男性不育的关系展开了广泛地研究，有资料显示[1，4，5]，不育男性精浆中Uu检出率为40.0%～58%，Uu可侵犯睾丸、导致睾丸生精功能障碍，并发现支原体感染对精子的正常生理功能(如精子数量、活力、穿卵能力、畸形率等)、免疫机制(如抗精子抗体升高；淋巴细胞反应性改变，产生自身免疫反应等)、宿主细胞代谢等均有影响。我们用PCR法对80例不育男性精浆标本的支原体检测，发现有较高的Uu、Mg感染率，分别为35.1%；21.3%，且两种支原体同时感染者占13.8%，与上述文献报道相似，用支原体培养法检测Uu，发现不育者男性Uu感染率明显高于生育力正常的男性，说明支原体感染与男性不育有密切关系。
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研究证明[1，6]，支原体对四环素、红霉素等大环内酯类抗生素敏感，经此类药物治疗，有明显疗效或治疗后支原体转阴，并观察到不仅可明显改善支原体感染者精液质量，而且可以使其受孕率明显提高。因此，对男性不育者进行支原体检测，以便进行治疗尤为重要。PCR法与其他方法相比(如分离培养法，需培养观察3～7天，同时要避免或除外细菌污染所致的假阳性等)，具有简便、快速、敏感、特异等优点，可用于临床，进行早期及时诊断，以便采取有效的治疗措施。
丁秀原(首都儿科研究所 北京，100020)
葛云静(首都儿科研究所 北京，100020)
刘会恩(北京医科大学第三临床医学院)
参考文献
1，徐晨，王一飞.支原体与男性不育研究进展〔J〕.男性学杂志，1992，6(1)∶54.
, 百拇医药
2，Blanchard A,Hentschel J,Duffy L,et al.Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults,in Amniotic fluid,and in the respiratory tract of newborns〔J〕.Clin Infect Dis,1993,17∶148.
3，Jensen JS,Sondergard-Andersen J,Uldum SA,et al.Polymerase chain reaction fordetection of mycoplasma genitalium in clinical samples〔J〕.J Clin Microbiol，1991,29∶46.
4，Limb DI.Mycoplasma of human genital tract[J].Medical Laboratory Science.1989,46∶146.
5，Fowlkes DM,Macleod J,Oleary WM.T-Mycoplasmas and human infertility〔J〕.Fertil Steril,1975,26∶1212.
6，McCormack WM.Susceptibility of mycoplasmas to antimicrobial agents:clinical implications〔J〕.Clin Infect Dis,1993,17(suppl I):s200., 百拇医药
关键词：男性不育症 支原体 感染
男性不育症是泌尿科门诊的常见病之一，据1989年国内统计资料表明，大约有10%的育龄夫妇发生不育，而由男方造成的因素约占40%～50%，在诸多原因中因感染而引起的不育越来越受到人们的重视，现已发现有7种支原体可寄居在泌尿生殖道[1]，我们用聚合酶链反应(PCR)对男性不育者的支原体感染进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 不育组：91例男性均为婚后或配偶曾妊娠后2年以上不育者，性生活规律，无性功能障碍，既往或现在无泌尿生殖系统感染病史者，年龄在25～49岁，不育时间为2～21年。正常对照组：为已婚、生育能力正常，排除各种感染性疾病的健康男性，共20例，年龄在26～38岁。
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以上两组受检者均按常规方法收集精液标本。
1.2 PCR检测解脲支原体(Ureaplasma ureaplycium,Uu)及生殖支原体(Mycoplasma genitalicum,Mg)。
1.2.1 精液模板DNA的提取 常规方法收集的精液液化后置于3000r/min离心8min，取上清液置-20℃冻存。样品用裂解法进行处理[2]：取精浆150～200μl，12000×g离心10min，沉淀加25μlA液(含10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L KCl,2.5mmol/L MgCl2)混匀10min后，加25μlB液(含10mmol/L Tris-HCl,2.5mmol/L MgCl2,1% Tween-20,1% Triton X-100,160μg/ml蛋白酶K)，55℃保温1.5h，95℃10min，10000×g离心10sec，取上清液做模板。
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1.2.2 引物 根据文献报道[2，3]，设计解脲支原体引物序列为U4：5’-ACGACGTCCATAAGCAACT-3’，U5：5’-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3’，预期扩增片段长度为429bp。生殖支原体引物为MgPa-1：5’-AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG-3’，MgPa-3：5’-CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC-3’，预期扩增片段为281bp。
1.2.3 PCR反应条件 PCR反应体积25μl，检测Uu的反应中，每种引物为0.4μ mol/L，dNTP 200μ mol/L，标本提取液10μl，加入Taq DNA聚合酶和矿物油后，于DNA扩增仪进行PCR，循环条件为94℃预变性4min后，94℃20sec，62℃1min，72℃1min，35次循环后于72℃再延伸10min。检测Mg的PCR反应中，每种引物为0.2μ mol/L，dNTP 125μ mol/L，其余同上，循环条件为94℃预变性4min后，94℃1min，65℃1min，72℃1min，循环35次后于72℃再延伸6min。在80例不育者标本的检测中，每次试验均设已知阳性及阴性(培养基)样品为对照，以确保试验的可靠性。
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1.2.4 扩增产物检测 取10μl扩增产物与2μl溴酚蓝混合，加样于2%琼脂糖凝胶，为确定特异扩增片段大小，同时上样PBR322/MSPI，电泳100V，30min，紫外灯下观察结果。
1.3 支原体培养 取两组受检者精液标本进行Uu分离培养。
2 结果
2.1 PCR检测结果 按上述方法进行模板DNA制备，PCR扩增，Uu及Mg阳性标本均扩增出单一区带，其片段大小分别为429bp见图1；281bp见图2，与文献报道一致。受检的80名男性不育者精浆标本的Uu及Mg阳性检测率分别为35.1%(29/80)；21.3%(17/80)，两种支原体同时存在者占13.8%(11/80)。
2.2 支原体培养结果 91例不育男性及20例正常男性对照者Uu感染率分别为35.2%(32/91)；10%(2/20)，经统计学分析，P<0.05，提示两组间感染率有显著性差异。
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图1 PCR检测的Uu阳性特异扩增片段
图2 PCR检测的Mg阳性特异扩增片段
3 讨论
支原体(Mgcoplasma)又称类胸膜肺炎微生物，是原核生物中最小、最简单、无细胞壁的一类微生物。众所周知，引起人类泌尿生殖道感染的支原体主要有3种，即人型支原体、解脲支原体和生殖支原体。许多资料表明，生殖道支原体感染与非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、Reiter综合征、前庭大腺脓肿、肾盂肾炎、不育症等疾病有关。近年来，各国有关学者对支原体与男性不育的关系展开了广泛地研究，有资料显示[1，4，5]，不育男性精浆中Uu检出率为40.0%～58%，Uu可侵犯睾丸、导致睾丸生精功能障碍，并发现支原体感染对精子的正常生理功能(如精子数量、活力、穿卵能力、畸形率等)、免疫机制(如抗精子抗体升高；淋巴细胞反应性改变，产生自身免疫反应等)、宿主细胞代谢等均有影响。我们用PCR法对80例不育男性精浆标本的支原体检测，发现有较高的Uu、Mg感染率，分别为35.1%；21.3%，且两种支原体同时感染者占13.8%，与上述文献报道相似，用支原体培养法检测Uu，发现不育者男性Uu感染率明显高于生育力正常的男性，说明支原体感染与男性不育有密切关系。
, http://www.100md.com
研究证明[1，6]，支原体对四环素、红霉素等大环内酯类抗生素敏感，经此类药物治疗，有明显疗效或治疗后支原体转阴，并观察到不仅可明显改善支原体感染者精液质量，而且可以使其受孕率明显提高。因此，对男性不育者进行支原体检测，以便进行治疗尤为重要。PCR法与其他方法相比(如分离培养法，需培养观察3～7天，同时要避免或除外细菌污染所致的假阳性等)，具有简便、快速、敏感、特异等优点，可用于临床，进行早期及时诊断，以便采取有效的治疗措施。
丁秀原(首都儿科研究所 北京，100020)
葛云静(首都儿科研究所 北京，100020)
刘会恩(北京医科大学第三临床医学院)
参考文献
1，徐晨，王一飞.支原体与男性不育研究进展〔J〕.男性学杂志，1992，6(1)∶54.
, 百拇医药
2，Blanchard A,Hentschel J,Duffy L,et al.Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults,in Amniotic fluid,and in the respiratory tract of newborns〔J〕.Clin Infect Dis,1993,17∶148.
3，Jensen JS,Sondergard-Andersen J,Uldum SA,et al.Polymerase chain reaction fordetection of mycoplasma genitalium in clinical samples〔J〕.J Clin Microbiol，1991,29∶46.
4，Limb DI.Mycoplasma of human genital tract[J].Medical Laboratory Science.1989,46∶146.
5，Fowlkes DM,Macleod J,Oleary WM.T-Mycoplasmas and human infertility〔J〕.Fertil Steril,1975,26∶1212.
6，McCormack WM.Susceptibility of mycoplasmas to antimicrobial agents:clinical implications〔J〕.Clin Infect Dis,1993,17(suppl I):s200., 百拇医药