培养的不同分化程度的人大肠癌细胞内质网结构特点
冯树 张福会 苏若萍 李家滨 宋今丹
摘 要 目的：探索培养的人大肠癌细胞内质网膜系统超微结构与其分化程度间的关系。方法：采用透射电镜技术和扫描电镜技术分别观察了培养的高分化和低分化大肠癌细胞系CCL229和CCL227内质网膜微细结构和分布。结果：透射电镜观察结果显示：高分化细胞CCL229内质网较丰富，呈小泡状和扁平囊状分布于核周及质膜下胞质中，其伪足中亦见丰富的内质网。低分化的CCL227细胞中内质网较少，呈小泡状、短管状分布于胞质中。扫描电镜观察两个细胞系内质网立体结构显示：内质网在数量和分布上与透射电镜观察结果相似。结论：培养的人大肠癌细胞内质网的数量和分布与细胞的分化程度有关，高分化细胞的内质网较丰富且分布于整个细胞中。
关键词：内质网 大肠癌细胞 分化
内质网(endoplasmic reticulum, ER)是由膜性小管、小泡及扁平囊连结而成的连续性网状结构，遍布于细胞质中，故称之为内质网膜系统。它是真核细胞中重要的细胞器，在蛋白质合成、脂类合成、物质运输以及细胞其它膜性细胞器的形成等方面均起着重要的作用[1]。细胞发生癌变后，其结构和功能均发生改变。分化程度是肿瘤细胞恶性表型的重要指标[2，3]。迄今，有关培养的不同分化程度的大肠癌细胞ER微细结构的比较研究尚未见报道。本研究利用透射电镜技术和扫描电镜技术，对培养的高、低分化程度的人大肠癌细胞ER的微细结构和三维结构进行了比较研究，以期探讨不同分化程度大肠癌细胞ER的微细结构与分布的特点。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞与细胞培养
高分化人大肠癌细胞系CCL229及低分化人大肠癌细胞系CCL227均由美国哈佛大学Dana-Farber肿瘤所惠赠。细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液(GIBCO)、5%CO2、37℃条件下培养。取对数生长期细胞用于透射电镜观察，用于扫描电镜观察的细胞接种于培养皿内的盖玻片上。
1.2 透射电镜标本制备和观察
取对数生长期细胞，以PBS洗3次，迅速以2.5%戊二醛固定2 h, 二甲砷酸盐缓冲液漂洗后, 用1%锇酸固定30 min，蒸馏水洗去残余锇酸, 经乙醇和丙酮梯度脱水, Epon 812树脂包埋聚合, 超薄切片(LKB 2088型超薄切片机), 用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色, 在透射电镜(日立H 600型)下观察。
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1.3 扫描电镜标本制备和观察
1.3.1 高锰酸钾固定液的制备：根据宋今丹[4]法配制。首先配制柠檬酸纳缓冲液: 60 mmol/L柠檬酸三钠, 25 mmol/L氯化钾, 35 mmol/L氯化镁, pH 7.4～7.8。将高锰酸钾(Sigma)溶于柠檬酸纳缓冲液(终浓度为125 mmol/L), 待全部溶解后即可使用。
1.3.2 扫描电镜标本的制备和观察：取盖玻片培养48 h的细胞, 用上述柠檬酸钠缓冲液漂洗3次, 在高锰酸钾固定液中固定7 min, 用柠檬酸钠缓冲液洗去残余的高锰酸钾固定液, 经30%～100%乙醇梯度脱水, 醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥(日立HCB-2型 临界点干燥仪), 喷金镀膜(BIKO TB-3型离子镀膜机)后, 在扫描电镜(日立S-450型)下观察。
2 结果
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2.1 透射电镜下高、低分化人大肠癌细胞ER的微细结构
透射电镜下，高分化人大肠癌细胞CCL229呈圆形或多边形，表面突起和伪足较多，核大，圆形或椭圆形，核膜较平滑，有切迹，常染色质丰富，可见1～2个致密核仁，细胞质相对较少，游离核糖体随意分布。细胞质中内质网含量较丰富，核周可见许多泡状、短管状内质网，距核较远的胞质中可见平行排列及非平行排列的扁平囊样ER。在细胞伸出的伪足中亦含有丰富的小泡状及扁平囊样ER，沿伪足纵轴方向分布(图1)。胞质中亦可见许多线粒体和大小不等的溶酶体，高尔基体较发达。
图1 透射电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER结构 ×8 000
Fig.1 Ultrastructure of well differentiated colorectal carcinoma cell line CCL229 under TEM ×8 000
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图2 透射电镜下低分化大肠癌细胞CCL227 ER结构 ×6 000
Fig.2 Ultrastructure of poorly differentiated colorectal carcinoma cell line CCL227 under TEM ×6 000
图3 扫描电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER结构 ×7 500
Fig.3 Ultrastructure of well differentiated colorectal carcinoma cell line CCL229 under SEM ×7 500
图4 扫描电镜下低分化大肠癌细胞CCL227 ER结构 ×5 500
Fig.4 Ultrastructure of poorly differentiated colorectal carcinoma cell line CCL227 under SEM ×5 500
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低分化大肠癌细胞CCL227较高分化细胞CCL229异形性更为明显，细胞表面突起及伪足较少，核质比较大，核膜有较深的切迹。胞质中ER明显减少，为小泡状、短管状分布于距核较远的胞质中，细管样ER较少。胞质中可见大量的游离多聚核糖体。线粒体较少但较大，高尔基器不发达，溶酶体较少(图2)。
2.2 扫描电镜下高、低分化大肠癌细胞ER立体结构
扫描电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER丰富、密集，为由细管状ER络织而成的网状结构，以核周为中心向外伸展，贯穿整个胞质直达伪足，ER小管末端可见囊泡样膨大(图3)。低分化大肠癌细胞CCL227 ER较稀疏，为细管状和小囊样ER连接接而成的网状结构(图4)。
3 讨论
以往对ER微细结构的研究多限于光镜及透射电镜下常规切片的观察，但这些方法均不能揭示内质网的全貌性结构与分布。宋今丹建立了高锰酸钾固定技术和喹啉蓝DioC6[3]荧光染色法成功地在相差显微镜、荧光显微镜、共焦激光扫描显微镜、透射电镜和扫描电镜下全貌性地显示正常培养细胞及癌变细胞的整装ER结构[3～6]，使人们对正常和癌变细胞内ER的分布有了进一步的认识。
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本研究中，透射电镜下观察的结果表明，培养的高分化人大肠癌细胞CCL229 ER较丰富，呈小泡状、短管状、扁平囊状分布于核周及质膜下胞质中，在伪足中亦可观察到丰富的ER。低分化大肠癌细胞CCL227中，ER较CCL229细胞少， 多为小泡状、短管状分布于胞质中， 胞质中有大量的游离核糖体。鉴于常规电镜方法只能观察到ER的局部结构而无法全貌性地显示ER的立体结构，故又应用宋今丹建立的高锰酸钾扫描电镜技术对上述两个细胞系细胞的整装ER立体结构进行了观察比较。结果亦显示，高分化细胞CCL229 中ER较丰富、密集，由细管状ER络织成三维网状结构，以核为中心向外延展，并伸入伪足；低分化细胞CCL227 ER较稀疏，为细管状和小囊泡状ER连接而成的网状结构， 与透射电镜下观察的结果相吻合，充分表明高分化人大肠癌细胞CCL229 的ER比低分化细胞CCL227丰富。
内质网是一种高度特化的具有合成分泌蛋白功能的细胞器，其发达程度被看作是细胞分化和功能状态的表征。本研究观察到，低分化大肠癌细胞CCL227的ER不如高分化细胞CCL229的丰富。且见大量游离多聚核糖体，反映出低分化大肠癌细胞能较活跃地合成细胞生长和增殖所必需的内源性蛋白质，而合成功能性分泌蛋白的能力较小。 CCL229为高分化、高侵袭性大肠癌细胞系[7]，其高侵袭性亦与其细胞超微结构有关。高进[8]等曾通过光镜和电镜观察发现，癌细胞的伪足在其侵袭过程中具有重要作用。癌细胞侵袭时通过丝状伪足抓住靶器官表面的突起物，进而以丝状伪足为前导向器官内侵入。这种侵入过程要求癌细胞不断释放蛋白溶解酶以破坏基底膜等屏障。本研究观察到CCL229细胞具有大量的突起和伪足，突起和伪足中含大量ER，这可能为其高侵袭性的结构基础。
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国家自然科学基金重大资助项目，3904005
冯树，研究生，现在中国科学院沈阳应用生态研究所
冯树(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
张福会(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
苏若萍(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
李家滨(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
宋今丹(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
参考文献
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1，宋今丹，主编.医学细胞生物学. 北京：人民卫生出版社，1993.107～117
2，Liotta LA. Cancer cell invasion and metastasis. Scientific Am, 1992, 266(2): 34-41
3，Song JD, Lee C, Lin CS, et al. Electron microscopic studies of the endoplasmic reticulum in whole-mount cultured cells fixed with potassium permanganate. J strut Bio， 1991， 107-109
4，朱亚勤，宋今丹.致癌药物作用后内质网膜系统和亚显微结构的改变. 中华物理医学杂志，1993，15(1)：22～24
, 百拇医药
5，李旦，宋今丹. 癌基因转染后的细胞内质网膜系统超微结构的变化. 中华物理医学杂志，1995，18(1)：1～3
6，孙宝栋，宋今丹.大肠癌细胞体外侵袭力和相关生物学特性的比较研究. 细胞生物学杂志， 1996，18(4)：185～188
7，Stephen J, Bradley S J. Increased expression of the epidermal growth factor on human colon carcinoma cells. Arch Surg, 1986，121:1242-1246
8，高进. 肿瘤细胞侵袭性的研究. 见：王蘅文主编，实验肿瘤学基础.北京：人民卫生出版社，1992.195～209, http://www.100md.com
摘 要 目的：探索培养的人大肠癌细胞内质网膜系统超微结构与其分化程度间的关系。方法：采用透射电镜技术和扫描电镜技术分别观察了培养的高分化和低分化大肠癌细胞系CCL229和CCL227内质网膜微细结构和分布。结果：透射电镜观察结果显示：高分化细胞CCL229内质网较丰富，呈小泡状和扁平囊状分布于核周及质膜下胞质中，其伪足中亦见丰富的内质网。低分化的CCL227细胞中内质网较少，呈小泡状、短管状分布于胞质中。扫描电镜观察两个细胞系内质网立体结构显示：内质网在数量和分布上与透射电镜观察结果相似。结论：培养的人大肠癌细胞内质网的数量和分布与细胞的分化程度有关，高分化细胞的内质网较丰富且分布于整个细胞中。
关键词：内质网 大肠癌细胞 分化
内质网(endoplasmic reticulum, ER)是由膜性小管、小泡及扁平囊连结而成的连续性网状结构，遍布于细胞质中，故称之为内质网膜系统。它是真核细胞中重要的细胞器，在蛋白质合成、脂类合成、物质运输以及细胞其它膜性细胞器的形成等方面均起着重要的作用[1]。细胞发生癌变后，其结构和功能均发生改变。分化程度是肿瘤细胞恶性表型的重要指标[2，3]。迄今，有关培养的不同分化程度的大肠癌细胞ER微细结构的比较研究尚未见报道。本研究利用透射电镜技术和扫描电镜技术，对培养的高、低分化程度的人大肠癌细胞ER的微细结构和三维结构进行了比较研究，以期探讨不同分化程度大肠癌细胞ER的微细结构与分布的特点。
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1 材料与方法
1.1 细胞与细胞培养
高分化人大肠癌细胞系CCL229及低分化人大肠癌细胞系CCL227均由美国哈佛大学Dana-Farber肿瘤所惠赠。细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液(GIBCO)、5%CO2、37℃条件下培养。取对数生长期细胞用于透射电镜观察，用于扫描电镜观察的细胞接种于培养皿内的盖玻片上。
1.2 透射电镜标本制备和观察
取对数生长期细胞，以PBS洗3次，迅速以2.5%戊二醛固定2 h, 二甲砷酸盐缓冲液漂洗后, 用1%锇酸固定30 min，蒸馏水洗去残余锇酸, 经乙醇和丙酮梯度脱水, Epon 812树脂包埋聚合, 超薄切片(LKB 2088型超薄切片机), 用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色, 在透射电镜(日立H 600型)下观察。
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1.3 扫描电镜标本制备和观察
1.3.1 高锰酸钾固定液的制备：根据宋今丹[4]法配制。首先配制柠檬酸纳缓冲液: 60 mmol/L柠檬酸三钠, 25 mmol/L氯化钾, 35 mmol/L氯化镁, pH 7.4～7.8。将高锰酸钾(Sigma)溶于柠檬酸纳缓冲液(终浓度为125 mmol/L), 待全部溶解后即可使用。
1.3.2 扫描电镜标本的制备和观察：取盖玻片培养48 h的细胞, 用上述柠檬酸钠缓冲液漂洗3次, 在高锰酸钾固定液中固定7 min, 用柠檬酸钠缓冲液洗去残余的高锰酸钾固定液, 经30%～100%乙醇梯度脱水, 醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥(日立HCB-2型 临界点干燥仪), 喷金镀膜(BIKO TB-3型离子镀膜机)后, 在扫描电镜(日立S-450型)下观察。
2 结果
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2.1 透射电镜下高、低分化人大肠癌细胞ER的微细结构
透射电镜下，高分化人大肠癌细胞CCL229呈圆形或多边形，表面突起和伪足较多，核大，圆形或椭圆形，核膜较平滑，有切迹，常染色质丰富，可见1～2个致密核仁，细胞质相对较少，游离核糖体随意分布。细胞质中内质网含量较丰富，核周可见许多泡状、短管状内质网，距核较远的胞质中可见平行排列及非平行排列的扁平囊样ER。在细胞伸出的伪足中亦含有丰富的小泡状及扁平囊样ER，沿伪足纵轴方向分布(图1)。胞质中亦可见许多线粒体和大小不等的溶酶体，高尔基体较发达。
图1 透射电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER结构 ×8 000
Fig.1 Ultrastructure of well differentiated colorectal carcinoma cell line CCL229 under TEM ×8 000
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图2 透射电镜下低分化大肠癌细胞CCL227 ER结构 ×6 000
Fig.2 Ultrastructure of poorly differentiated colorectal carcinoma cell line CCL227 under TEM ×6 000
图3 扫描电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER结构 ×7 500
Fig.3 Ultrastructure of well differentiated colorectal carcinoma cell line CCL229 under SEM ×7 500
图4 扫描电镜下低分化大肠癌细胞CCL227 ER结构 ×5 500
Fig.4 Ultrastructure of poorly differentiated colorectal carcinoma cell line CCL227 under SEM ×5 500
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低分化大肠癌细胞CCL227较高分化细胞CCL229异形性更为明显，细胞表面突起及伪足较少，核质比较大，核膜有较深的切迹。胞质中ER明显减少，为小泡状、短管状分布于距核较远的胞质中，细管样ER较少。胞质中可见大量的游离多聚核糖体。线粒体较少但较大，高尔基器不发达，溶酶体较少(图2)。
2.2 扫描电镜下高、低分化大肠癌细胞ER立体结构
扫描电镜下高分化大肠癌细胞CCL229 ER丰富、密集，为由细管状ER络织而成的网状结构，以核周为中心向外伸展，贯穿整个胞质直达伪足，ER小管末端可见囊泡样膨大(图3)。低分化大肠癌细胞CCL227 ER较稀疏，为细管状和小囊样ER连接接而成的网状结构(图4)。
3 讨论
以往对ER微细结构的研究多限于光镜及透射电镜下常规切片的观察，但这些方法均不能揭示内质网的全貌性结构与分布。宋今丹建立了高锰酸钾固定技术和喹啉蓝DioC6[3]荧光染色法成功地在相差显微镜、荧光显微镜、共焦激光扫描显微镜、透射电镜和扫描电镜下全貌性地显示正常培养细胞及癌变细胞的整装ER结构[3～6]，使人们对正常和癌变细胞内ER的分布有了进一步的认识。
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本研究中，透射电镜下观察的结果表明，培养的高分化人大肠癌细胞CCL229 ER较丰富，呈小泡状、短管状、扁平囊状分布于核周及质膜下胞质中，在伪足中亦可观察到丰富的ER。低分化大肠癌细胞CCL227中，ER较CCL229细胞少， 多为小泡状、短管状分布于胞质中， 胞质中有大量的游离核糖体。鉴于常规电镜方法只能观察到ER的局部结构而无法全貌性地显示ER的立体结构，故又应用宋今丹建立的高锰酸钾扫描电镜技术对上述两个细胞系细胞的整装ER立体结构进行了观察比较。结果亦显示，高分化细胞CCL229 中ER较丰富、密集，由细管状ER络织成三维网状结构，以核为中心向外延展，并伸入伪足；低分化细胞CCL227 ER较稀疏，为细管状和小囊泡状ER连接而成的网状结构， 与透射电镜下观察的结果相吻合，充分表明高分化人大肠癌细胞CCL229 的ER比低分化细胞CCL227丰富。
内质网是一种高度特化的具有合成分泌蛋白功能的细胞器，其发达程度被看作是细胞分化和功能状态的表征。本研究观察到，低分化大肠癌细胞CCL227的ER不如高分化细胞CCL229的丰富。且见大量游离多聚核糖体，反映出低分化大肠癌细胞能较活跃地合成细胞生长和增殖所必需的内源性蛋白质，而合成功能性分泌蛋白的能力较小。 CCL229为高分化、高侵袭性大肠癌细胞系[7]，其高侵袭性亦与其细胞超微结构有关。高进[8]等曾通过光镜和电镜观察发现，癌细胞的伪足在其侵袭过程中具有重要作用。癌细胞侵袭时通过丝状伪足抓住靶器官表面的突起物，进而以丝状伪足为前导向器官内侵入。这种侵入过程要求癌细胞不断释放蛋白溶解酶以破坏基底膜等屏障。本研究观察到CCL229细胞具有大量的突起和伪足，突起和伪足中含大量ER，这可能为其高侵袭性的结构基础。
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国家自然科学基金重大资助项目，3904005
冯树，研究生，现在中国科学院沈阳应用生态研究所
冯树(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
张福会(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
苏若萍(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
李家滨(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
宋今丹(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
参考文献
, 百拇医药
1，宋今丹，主编.医学细胞生物学. 北京：人民卫生出版社，1993.107～117
2，Liotta LA. Cancer cell invasion and metastasis. Scientific Am, 1992, 266(2): 34-41
3，Song JD, Lee C, Lin CS, et al. Electron microscopic studies of the endoplasmic reticulum in whole-mount cultured cells fixed with potassium permanganate. J strut Bio， 1991， 107-109
4，朱亚勤，宋今丹.致癌药物作用后内质网膜系统和亚显微结构的改变. 中华物理医学杂志，1993，15(1)：22～24
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5，李旦，宋今丹. 癌基因转染后的细胞内质网膜系统超微结构的变化. 中华物理医学杂志，1995，18(1)：1～3
6，孙宝栋，宋今丹.大肠癌细胞体外侵袭力和相关生物学特性的比较研究. 细胞生物学杂志， 1996，18(4)：185～188
7，Stephen J, Bradley S J. Increased expression of the epidermal growth factor on human colon carcinoma cells. Arch Surg, 1986，121:1242-1246
8，高进. 肿瘤细胞侵袭性的研究. 见：王蘅文主编，实验肿瘤学基础.北京：人民卫生出版社，1992.195～209, http://www.100md.com