肿瘤坏死因子-α激活ECV304钙激活钾通道及G蛋白的增强效应
肿瘤坏死因子-α激活ECV304钙激活钾通道及G蛋白的增强效应
林琳 郑永芳 屈金河 鲍光宏
摘 要 目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人脐静脉内皮细胞株ECV304钙激活钾通道(BKca)的影响以及G蛋白是否在此过程中起作用。方法 细胞贴附式膜片箝技术。 结果 发现ECV304细胞膜上存在大电导钙激活钾通道(BKca)，它的电导是(202.54±16.62) pS，其活动可被200 U/ml TNF-α增强，G蛋白在此过程中起介导作用。结论 TNF-α作用于内皮细胞，快速激活BKca，促进钾离子大量外流，使细胞膜发生超极化，增大静息钙离子内流的电化学驱动力，开放静息钙通道升高静息胞内钙离子浓度。G蛋白可增强此激活效应。
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关键词：钙激活钾通道 肿瘤坏死因子-α 血管内皮细胞 膜片箝
内皮细胞是大多数心血管致病因子的主要作用部位。当致病因子TNF-α刺激内皮细胞以后，通过升高胞内钙离子浓度([Ca2+]i)，一方面促进白细胞和内皮细胞之间的粘附，导致一系列炎症反应[1～3]；另一方面引起内皮细胞的凋亡[3～5]。[Ca2+]i的升高依赖于细胞外钙的内流和钙库的释放。Ca2+进入内皮细胞主要受控于静息膜电位[6]，因而参与静息膜电位形成和调控膜电位变化的钾通道，尤其是电导颇大的Kca更是倍受注意。本实验选用膜片箝技术观察TNF-α对BKca活动的影响，初步探讨TNF-α引起内皮细胞损害的离子通道机制。据报道，G蛋白在TNF-α发挥效应的信号转导通路中有作用[7]。本研究应用G蛋白的稳定激动剂GTPγS和G蛋白的稳定抑制剂 GDPβS观察G蛋白在 TNF-α影响 Kca过程中可能起的介导作用。
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材料和方法
溶液及药品 溶液：细胞液中含NaCl 145 mmol/L，KCl 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，glucose 11.1 mmol/L；电极液中含NaCl 5 mmol/L，K+-Aspartate 150 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L。以上溶液均为用时现配，并用 0.5 mmol/L NaOH 调至pH7.2。药品：M199，胎牛血清，谷氨酰胺为Gibco BRL 公司产品；青霉素、链霉素为华北制药股份有限公司产品；胰蛋白酶为 Diffico 公司产品；GTPγS，GDPβS 为Boehringer GmBH 公司产品；TNF-α购自北京邦定生物有限公司。
细胞培养 人脐静脉内皮细胞株ECV304(ECACC，Salisbury，Wiltshine，UK)按常规方法复苏后[8]接种于 50 ml塑料培瓶(Costar)里，加入完全M199(100 ml培养基含 10 ml胎牛血清，1 g 谷氨酰胺，100 U/ml 青霉素，100 μg/ml链霉素，用HEPES调至pH7.0～7.2)，在37 ℃，5%CO2孵箱中培养1～2 d，细胞逐渐长成单层融合状。于倒置显微镜下可见细胞呈多边形，核圆，核膜清晰，并表现出典型的卵圆石征[9]。此时的细胞可用于膜片箝实验。首先用胰蛋白酶(2.5 g/L 培养基)室温下消化 10 min，弃酶液加入细胞液吹打使单层细胞分离成单个细胞，然后将细胞悬液置4 ℃保存待用。
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离子通道电流记录 膜片箝细胞贴附式记录单通道电流[10，11]。具体方法如下：有芯毛细玻璃管(GG17，上海脑研究所)经微电极拉制仪(NARISHGE，PP83型)拉制成尖端直径为1～2 μm 左右的微电极。电极经热抛光处理(自制抛光仪)充灌电极液后，电极电阻为 5～10 MΩ。将细胞池(0.5 ml)放在倒置显微镜(OLYMPUS)工作台上，取300 μl细胞悬液和200 μl 细胞液加于池中，待细胞沉淀贴壁后，用液压微操纵器(Narishige，MO-303)推进电极使其尖端和细胞膜片之间形成10～100 GΩ左右的高阻抗封接，即成细胞贴附式模式。形成封接后，应用pclmp5.5.1(Axon，USA)程序控制箝制电压和测试电压，选择箝制电压(HP)为0mV，测试电压(TP)为阶跃脉冲-100～80 mV，每步递增20 mV，共10步。阶跃脉冲波宽200 ms，间隔 1 s。记录到的单通道电流经膜片箝放大器(List L/M EPC-7)放大和滤波，再经过 pclamp5.5.1 软件的数据采集系统接口(Labmaster，model TL-1 interface，Axon， USA)储存在计算机里。采集速度为 100 μs。全过程在21～25 ℃ 下进行。单通道电流经pclamp5.5.1 分析处理。将原始记录中测试电压为60 mV 时的通道活动经计算机处理得出经双指数拟合的通道电流幅值直方图，关闭时和开放时直方图，算出电流幅值I，平均关闭时tc，平均开放时t0，在某一箝制电压下通道处于开放状态的概率P0以及失活速率τi和激活速率τa(τ值代表通道电流变化的时间常数)[12]。再根据电流-电压关系曲线，算出通道的斜率电导。经处理的实验结果与原图的复现分别由打印机打出。
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统计学处理 所得数据均以均值±标准差(X±s)表示，组间比较采用t检验作统计学分析。
结 果
人脐静脉内皮细胞株 ECV304 Bkca的启闭特性 在形成细胞贴附式后即给予电压箝制，当细胞液中含2 mmol/L Ca2+时，未记录到通道活动。往细胞浴池中加入终浓度为22 mmol/L Ca2+后，给予同样的箝制电压和测试电压，可明显激活ECV304的通道电流，该通道电流随测试电压幅值的增大而增大，呈现良好的电压依赖性(图 1A)。1 mmol/L 四乙胺(TEA)可将其活动完全抑制(图 1B)。以测试电压为横坐标，通道开放时的电流大小为纵坐标绘制出电流-电压关系曲线，由此求出该通道的斜率电导为(202.54±16.62) pS(n=4)，反转电位近0 mV(图2)。这些特征符合BKca的特性。测试电压在60 mV时，ECV304 BKca的平均电流幅值为(4.70±0.03) pA，平均关闭时为(60.33±9.31) ms，平均开放时为(6.08±1.97) ms，电压箝制于60 mV时通道处于开放状态的概率P0是(0.09±0.02)。失活速率为τi1(8.59±2.31) ms，τi2(334.08±0.89) ms。激活速率为τa1(1.69±0.40 )ms，τa2(12.48±4.05 )ms。
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图1 细胞贴附式下ECV304 BKca 的活动
Fig 1 BKca activity in cell-attached patch from ECV304
A.control; B.inhibition of tetraethy1-ammonium(TEA，1mmol/L)
on BKca activity HP：0 mV，TP：-100 mV～80 mV，20 mV per step
图2 ECV304 大电导钙激活钾通道电流-电压关系曲线
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Fig 2 Currents-voltage relationship for the BKca activity obtained in cell attached patches from ECV304(n=4)
The conductance appeared(202.54±16.62)pS and the reversal potential was around 0 mV
TNF-α对ECV304 BKca活动的激活效应 按上述相同的实验程序，当细胞浴液含22 mmol/L Ca2+时，再往细胞浴液中加入终浓度为200 U/ml 的TNF-α，60 s后可显著增强BKca的活动。在相同测试电压下其电流幅值明显大于加入TNF-α前。箝制电压为60 mV 时，BKca的平均电流幅值为(8.67±2.56) pA，平均关闭时(30.97±4.63) ms，平均开放时(7.83±0.79) ms，此时的开放概率P0是(0.20±0.04)。失活速率τi1(12.47±2.70) ms，τi2(119.68±24.88) ms，激活速率τa1(3.29±0.22) ms，τa2(72.55±16.44) ms。TNF-α组的动力学特征指标与未加TNF-α的对照组进行比较，差异均具有显著性，P<0.05(n=3)。
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GTPγS和GDPβS对TNF-α增强ECV304BKca活动效应的影响 细胞浴液及电极液均不变，电压箝制在60 mV，连续200次采样。在加入终浓度为200 U/ml TNF-α的基础上又加入终浓度为100 μmol/L 的G蛋白稳定激动剂GTPγS，可使ECV304BKca电流进一步被激活(图3)。将加入GTPγS 前的TNF-α组 (n=3)的电流幅值I，平均开放时t0，平均关闭时tc，开放概率P0以及失活速率τi，激活速率τa作为1，那么加入 GTPγS 后的TNF-α+GTPγS 组(n=3)的I为1.33±0.02，t0为3.81±0.66，tc为3.49±0.70，P0为1.25±0.25，τi1为4.23±0.10，τi2为4.44±0.24，τal为1.78±0.14，τa2为0.90±0.25。GTPγS+TNF-α组的I，t0，tc，τi1，τi2均显著高于TNF-α组，P<0.05(n=3)(图4)。为了进一步确定GTPγS的作用，保持实验条件不变，加入100 μmol/L GTPγS 后 3～5 min 再加入 200 U/ml TNF-α，ECV 304 BKca 电流也被进一步激活，显示GTPγS 增强 TNF-α的效应。
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图3 GTPγS 增强TNF-α激活 ECV304 大电导钙激活钾通道的效应
Fig 3 Potentiated effect of GTPγS on TNF-α activition of ECV304 BKca activity
A. control current traces； B.current traces obtained after ECV304 exposed to 200 U/ml TNF-α，60 s； C.current traces obtained from ECV304 post 3～5 min exposed to 100 μmol/L GTPγS after addition of TNF-α， TP=60 mV
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图4 TNF-α与TNF-α+GTPγS 作用下ECV304 BKca 电流的特性差异
Fig 4 Characteristic differences of cell attached BKca currents of ECV304 between TNF-α (200 U/ml) group and TNF-α+GTPγS(100 μmol/L) groups (X±s，n=3)
*P<0.05，TNF-α+GTPγS vs TNF-α tc：closed time； to： open time； P0：open probability； I：current am plitude； τi1：inactivation time constant；τa ：activation time constant
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按照观察 GTPγS 作用的相同实验条件，观察G蛋白稳定抑制剂 GDPβS 对TNF-α效应的影响。在加入TNF-α的基础上再加入300 μmol/L GDPβS，ECV304 BKca 的活动被明显抑制。将加入 GDPβS 前的 TNF-α组(n=3)的电流幅值I，平均开放时t0，平均关闭时tc，开放概率P0作为1，那么加入 GDPβS 后的 TNF-α+GDPβS组(n=3)的 I 为0.24±0.06，t0为0.26±0.06，tc为0.51±0.11，P0为0.51±0.04。GDPβS+TNF-α组的I，t0，tc，P0均显著低于 TNF-α组，P<0.05(n=3)。
讨 论
本实验中记录到的通道活动不仅可被胞内钙激活而且其电流大小随测试电压幅值的增大而增大，说明该通道的活动具有胞内钙浓度和电压依赖性。除此之外，在电极液和细胞浴液K+浓度为 150： 5 mmol/L 的条件下，该通道电导为(202.54±16.62) pS及反转电位近0 mV，而且1 mmol/L TEA可将BKca活动特异地抑制，这些特征符合 BKca 的特性[13～15]。由此可以确定，内皮细胞株ECV304 细胞膜上存在BKca。
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200 U/ml TNF-α可快速(60 s) 增强 BKca 的活动，在相同测试电压下其电流幅度明显大于添加 TNF-α 前。提示 TNF-α增强 BKca 的活动实际上是通过增加 BKca 单通道开放的电流幅度，延长开放时间，缩短关闭时间并增加开放概率来完成的。但在相同膜电位下，TNF-α 使 ECV304 BKca 开启速率减慢，而通道一旦开放，其关闭速率亦变慢(τi2除外)。
本实验应用 G-蛋白激动剂 GTPγS和抑制剂GDPβS从正反两个方面证明，G-蛋白参与了TNF-α增强ECV304 BKca活动的作用。100 μmol/L GTPγS 可以在TNF-α 的基础上进一步激活 BKca，主要表现是在相同测试电压时，BKca 单通道开放的平均电流幅值显著增大，关闭时和开放时都显著延长，失活速率显著变慢，激活速率以及开放概率也有增大的趋势，但差异无显著性。由此推测，在GTPγS 作用下通道一旦开放，其单位时间内涌出的K+将大大增加。实验条件不变，300 μmol/L GDPβS 可抑制 TNF-α对BKca 的增强效应。
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综上，笔者认为TNF-α作用于内皮细胞，快速激活 BKca，引起K+大量外流，使膜发生超极化，增大静息钙内流的电化学驱动力；同时开放背景钙通道，升高胞内基础钙浓度。一旦其它钙入胞的机制亦被启动，将在静息高钙的基础上大大增加胞内钙浓度，一方面激活 MAPK或 Ca/CaM 依赖的蛋白激酶，进而活化 NF-κB，使其由胞浆易位到胞核，加强粘附分子和细胞因子的转录和表达，另一方面胞内钙浓度的增加还能加强凋亡基因的表达并激活蛋白酶和核酸内切酶而破坏 DNA，导致内皮细胞的功能障碍[1～5]。本研究看到，TNF-α 对 BKca 的增强效应是在短时间内发生的，且G-蛋白可增强 TNF-α 对 BKca 的激活效应，这些结果提供了 TNF-α致内皮细胞损害过程的较早期变化情况。
最后需要指出的是，GTPγS 和 GDPβS 分别是G-蛋白的非水解性刺激物和抑制物，通常从胞内施加以上两种物质进行观察。本实验室已往的工作发现从胞外施加 GTPγS和GDPβS 对血管平滑肌细胞的钡电流分别产生激动和抑制效应[16]，只是作用慢于胞内施加。说明 GTPγS 和GDPβS 跨膜需要一定时间，而并非不能跨膜。本实验进一步支持上述观点，GTPγS和GDPβS 可以跨内皮细胞膜对 ECV304 BKca 产生相应的激活和抑制效应。
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国家自然科学基金重点项目(39730220)资助
林琳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
郑永芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
屈金河(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
鲍光宏(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
参考文献
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林琳 郑永芳 屈金河 鲍光宏
摘 要 目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人脐静脉内皮细胞株ECV304钙激活钾通道(BKca)的影响以及G蛋白是否在此过程中起作用。方法 细胞贴附式膜片箝技术。 结果 发现ECV304细胞膜上存在大电导钙激活钾通道(BKca)，它的电导是(202.54±16.62) pS，其活动可被200 U/ml TNF-α增强，G蛋白在此过程中起介导作用。结论 TNF-α作用于内皮细胞，快速激活BKca，促进钾离子大量外流，使细胞膜发生超极化，增大静息钙离子内流的电化学驱动力，开放静息钙通道升高静息胞内钙离子浓度。G蛋白可增强此激活效应。
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关键词：钙激活钾通道 肿瘤坏死因子-α 血管内皮细胞 膜片箝
内皮细胞是大多数心血管致病因子的主要作用部位。当致病因子TNF-α刺激内皮细胞以后，通过升高胞内钙离子浓度([Ca2+]i)，一方面促进白细胞和内皮细胞之间的粘附，导致一系列炎症反应[1～3]；另一方面引起内皮细胞的凋亡[3～5]。[Ca2+]i的升高依赖于细胞外钙的内流和钙库的释放。Ca2+进入内皮细胞主要受控于静息膜电位[6]，因而参与静息膜电位形成和调控膜电位变化的钾通道，尤其是电导颇大的Kca更是倍受注意。本实验选用膜片箝技术观察TNF-α对BKca活动的影响，初步探讨TNF-α引起内皮细胞损害的离子通道机制。据报道，G蛋白在TNF-α发挥效应的信号转导通路中有作用[7]。本研究应用G蛋白的稳定激动剂GTPγS和G蛋白的稳定抑制剂 GDPβS观察G蛋白在 TNF-α影响 Kca过程中可能起的介导作用。
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材料和方法
溶液及药品 溶液：细胞液中含NaCl 145 mmol/L，KCl 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，glucose 11.1 mmol/L；电极液中含NaCl 5 mmol/L，K+-Aspartate 150 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L。以上溶液均为用时现配，并用 0.5 mmol/L NaOH 调至pH7.2。药品：M199，胎牛血清，谷氨酰胺为Gibco BRL 公司产品；青霉素、链霉素为华北制药股份有限公司产品；胰蛋白酶为 Diffico 公司产品；GTPγS，GDPβS 为Boehringer GmBH 公司产品；TNF-α购自北京邦定生物有限公司。
细胞培养 人脐静脉内皮细胞株ECV304(ECACC，Salisbury，Wiltshine，UK)按常规方法复苏后[8]接种于 50 ml塑料培瓶(Costar)里，加入完全M199(100 ml培养基含 10 ml胎牛血清，1 g 谷氨酰胺，100 U/ml 青霉素，100 μg/ml链霉素，用HEPES调至pH7.0～7.2)，在37 ℃，5%CO2孵箱中培养1～2 d，细胞逐渐长成单层融合状。于倒置显微镜下可见细胞呈多边形，核圆，核膜清晰，并表现出典型的卵圆石征[9]。此时的细胞可用于膜片箝实验。首先用胰蛋白酶(2.5 g/L 培养基)室温下消化 10 min，弃酶液加入细胞液吹打使单层细胞分离成单个细胞，然后将细胞悬液置4 ℃保存待用。
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离子通道电流记录 膜片箝细胞贴附式记录单通道电流[10，11]。具体方法如下：有芯毛细玻璃管(GG17，上海脑研究所)经微电极拉制仪(NARISHGE，PP83型)拉制成尖端直径为1～2 μm 左右的微电极。电极经热抛光处理(自制抛光仪)充灌电极液后，电极电阻为 5～10 MΩ。将细胞池(0.5 ml)放在倒置显微镜(OLYMPUS)工作台上，取300 μl细胞悬液和200 μl 细胞液加于池中，待细胞沉淀贴壁后，用液压微操纵器(Narishige，MO-303)推进电极使其尖端和细胞膜片之间形成10～100 GΩ左右的高阻抗封接，即成细胞贴附式模式。形成封接后，应用pclmp5.5.1(Axon，USA)程序控制箝制电压和测试电压，选择箝制电压(HP)为0mV，测试电压(TP)为阶跃脉冲-100～80 mV，每步递增20 mV，共10步。阶跃脉冲波宽200 ms，间隔 1 s。记录到的单通道电流经膜片箝放大器(List L/M EPC-7)放大和滤波，再经过 pclamp5.5.1 软件的数据采集系统接口(Labmaster，model TL-1 interface，Axon， USA)储存在计算机里。采集速度为 100 μs。全过程在21～25 ℃ 下进行。单通道电流经pclamp5.5.1 分析处理。将原始记录中测试电压为60 mV 时的通道活动经计算机处理得出经双指数拟合的通道电流幅值直方图，关闭时和开放时直方图，算出电流幅值I，平均关闭时tc，平均开放时t0，在某一箝制电压下通道处于开放状态的概率P0以及失活速率τi和激活速率τa(τ值代表通道电流变化的时间常数)[12]。再根据电流-电压关系曲线，算出通道的斜率电导。经处理的实验结果与原图的复现分别由打印机打出。
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统计学处理 所得数据均以均值±标准差(X±s)表示，组间比较采用t检验作统计学分析。
结 果
人脐静脉内皮细胞株 ECV304 Bkca的启闭特性 在形成细胞贴附式后即给予电压箝制，当细胞液中含2 mmol/L Ca2+时，未记录到通道活动。往细胞浴池中加入终浓度为22 mmol/L Ca2+后，给予同样的箝制电压和测试电压，可明显激活ECV304的通道电流，该通道电流随测试电压幅值的增大而增大，呈现良好的电压依赖性(图 1A)。1 mmol/L 四乙胺(TEA)可将其活动完全抑制(图 1B)。以测试电压为横坐标，通道开放时的电流大小为纵坐标绘制出电流-电压关系曲线，由此求出该通道的斜率电导为(202.54±16.62) pS(n=4)，反转电位近0 mV(图2)。这些特征符合BKca的特性。测试电压在60 mV时，ECV304 BKca的平均电流幅值为(4.70±0.03) pA，平均关闭时为(60.33±9.31) ms，平均开放时为(6.08±1.97) ms，电压箝制于60 mV时通道处于开放状态的概率P0是(0.09±0.02)。失活速率为τi1(8.59±2.31) ms，τi2(334.08±0.89) ms。激活速率为τa1(1.69±0.40 )ms，τa2(12.48±4.05 )ms。
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图1 细胞贴附式下ECV304 BKca 的活动
Fig 1 BKca activity in cell-attached patch from ECV304
A.control; B.inhibition of tetraethy1-ammonium(TEA，1mmol/L)
on BKca activity HP：0 mV，TP：-100 mV～80 mV，20 mV per step
图2 ECV304 大电导钙激活钾通道电流-电压关系曲线
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Fig 2 Currents-voltage relationship for the BKca activity obtained in cell attached patches from ECV304(n=4)
The conductance appeared(202.54±16.62)pS and the reversal potential was around 0 mV
TNF-α对ECV304 BKca活动的激活效应 按上述相同的实验程序，当细胞浴液含22 mmol/L Ca2+时，再往细胞浴液中加入终浓度为200 U/ml 的TNF-α，60 s后可显著增强BKca的活动。在相同测试电压下其电流幅值明显大于加入TNF-α前。箝制电压为60 mV 时，BKca的平均电流幅值为(8.67±2.56) pA，平均关闭时(30.97±4.63) ms，平均开放时(7.83±0.79) ms，此时的开放概率P0是(0.20±0.04)。失活速率τi1(12.47±2.70) ms，τi2(119.68±24.88) ms，激活速率τa1(3.29±0.22) ms，τa2(72.55±16.44) ms。TNF-α组的动力学特征指标与未加TNF-α的对照组进行比较，差异均具有显著性，P<0.05(n=3)。
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GTPγS和GDPβS对TNF-α增强ECV304BKca活动效应的影响 细胞浴液及电极液均不变，电压箝制在60 mV，连续200次采样。在加入终浓度为200 U/ml TNF-α的基础上又加入终浓度为100 μmol/L 的G蛋白稳定激动剂GTPγS，可使ECV304BKca电流进一步被激活(图3)。将加入GTPγS 前的TNF-α组 (n=3)的电流幅值I，平均开放时t0，平均关闭时tc，开放概率P0以及失活速率τi，激活速率τa作为1，那么加入 GTPγS 后的TNF-α+GTPγS 组(n=3)的I为1.33±0.02，t0为3.81±0.66，tc为3.49±0.70，P0为1.25±0.25，τi1为4.23±0.10，τi2为4.44±0.24，τal为1.78±0.14，τa2为0.90±0.25。GTPγS+TNF-α组的I，t0，tc，τi1，τi2均显著高于TNF-α组，P<0.05(n=3)(图4)。为了进一步确定GTPγS的作用，保持实验条件不变，加入100 μmol/L GTPγS 后 3～5 min 再加入 200 U/ml TNF-α，ECV 304 BKca 电流也被进一步激活，显示GTPγS 增强 TNF-α的效应。
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图3 GTPγS 增强TNF-α激活 ECV304 大电导钙激活钾通道的效应
Fig 3 Potentiated effect of GTPγS on TNF-α activition of ECV304 BKca activity
A. control current traces； B.current traces obtained after ECV304 exposed to 200 U/ml TNF-α，60 s； C.current traces obtained from ECV304 post 3～5 min exposed to 100 μmol/L GTPγS after addition of TNF-α， TP=60 mV
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图4 TNF-α与TNF-α+GTPγS 作用下ECV304 BKca 电流的特性差异
Fig 4 Characteristic differences of cell attached BKca currents of ECV304 between TNF-α (200 U/ml) group and TNF-α+GTPγS(100 μmol/L) groups (X±s，n=3)
*P<0.05，TNF-α+GTPγS vs TNF-α tc：closed time； to： open time； P0：open probability； I：current am plitude； τi1：inactivation time constant；τa ：activation time constant
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按照观察 GTPγS 作用的相同实验条件，观察G蛋白稳定抑制剂 GDPβS 对TNF-α效应的影响。在加入TNF-α的基础上再加入300 μmol/L GDPβS，ECV304 BKca 的活动被明显抑制。将加入 GDPβS 前的 TNF-α组(n=3)的电流幅值I，平均开放时t0，平均关闭时tc，开放概率P0作为1，那么加入 GDPβS 后的 TNF-α+GDPβS组(n=3)的 I 为0.24±0.06，t0为0.26±0.06，tc为0.51±0.11，P0为0.51±0.04。GDPβS+TNF-α组的I，t0，tc，P0均显著低于 TNF-α组，P<0.05(n=3)。
讨 论
本实验中记录到的通道活动不仅可被胞内钙激活而且其电流大小随测试电压幅值的增大而增大，说明该通道的活动具有胞内钙浓度和电压依赖性。除此之外，在电极液和细胞浴液K+浓度为 150： 5 mmol/L 的条件下，该通道电导为(202.54±16.62) pS及反转电位近0 mV，而且1 mmol/L TEA可将BKca活动特异地抑制，这些特征符合 BKca 的特性[13～15]。由此可以确定，内皮细胞株ECV304 细胞膜上存在BKca。
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200 U/ml TNF-α可快速(60 s) 增强 BKca 的活动，在相同测试电压下其电流幅度明显大于添加 TNF-α 前。提示 TNF-α增强 BKca 的活动实际上是通过增加 BKca 单通道开放的电流幅度，延长开放时间，缩短关闭时间并增加开放概率来完成的。但在相同膜电位下，TNF-α 使 ECV304 BKca 开启速率减慢，而通道一旦开放，其关闭速率亦变慢(τi2除外)。
本实验应用 G-蛋白激动剂 GTPγS和抑制剂GDPβS从正反两个方面证明，G-蛋白参与了TNF-α增强ECV304 BKca活动的作用。100 μmol/L GTPγS 可以在TNF-α 的基础上进一步激活 BKca，主要表现是在相同测试电压时，BKca 单通道开放的平均电流幅值显著增大，关闭时和开放时都显著延长，失活速率显著变慢，激活速率以及开放概率也有增大的趋势，但差异无显著性。由此推测，在GTPγS 作用下通道一旦开放，其单位时间内涌出的K+将大大增加。实验条件不变，300 μmol/L GDPβS 可抑制 TNF-α对BKca 的增强效应。
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综上，笔者认为TNF-α作用于内皮细胞，快速激活 BKca，引起K+大量外流，使膜发生超极化，增大静息钙内流的电化学驱动力；同时开放背景钙通道，升高胞内基础钙浓度。一旦其它钙入胞的机制亦被启动，将在静息高钙的基础上大大增加胞内钙浓度，一方面激活 MAPK或 Ca/CaM 依赖的蛋白激酶，进而活化 NF-κB，使其由胞浆易位到胞核，加强粘附分子和细胞因子的转录和表达，另一方面胞内钙浓度的增加还能加强凋亡基因的表达并激活蛋白酶和核酸内切酶而破坏 DNA，导致内皮细胞的功能障碍[1～5]。本研究看到，TNF-α 对 BKca 的增强效应是在短时间内发生的，且G-蛋白可增强 TNF-α 对 BKca 的激活效应，这些结果提供了 TNF-α致内皮细胞损害过程的较早期变化情况。
最后需要指出的是，GTPγS 和 GDPβS 分别是G-蛋白的非水解性刺激物和抑制物，通常从胞内施加以上两种物质进行观察。本实验室已往的工作发现从胞外施加 GTPγS和GDPβS 对血管平滑肌细胞的钡电流分别产生激动和抑制效应[16]，只是作用慢于胞内施加。说明 GTPγS 和GDPβS 跨膜需要一定时间，而并非不能跨膜。本实验进一步支持上述观点，GTPγS和GDPβS 可以跨内皮细胞膜对 ECV304 BKca 产生相应的激活和抑制效应。
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国家自然科学基金重点项目(39730220)资助
林琳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
郑永芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
屈金河(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
鲍光宏(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京 100005)
参考文献
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