反义人骨形态发生蛋白2基因逆转录病毒表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞生物学行为的影响
作者：岳文 杨连甲 晏伟 李鑫 朱峰 董绍忠 张殿忠 范清宇
单位：杨连甲、李鑫、董绍忠(710032西安，第四军医大学口腔医学院病理科)；岳文(现调入北京军事医学科学院第三研究所肿瘤分子室)；晏伟、朱峰(病理教研室)；张殿忠、范清宇(第四军医大学唐都医院骨肿瘤实验室)
关键词：骨形态发生蛋白质类；骨肉瘤；DNA，反义；诱变，插入；遗传载体
中华骨科杂志000904
【摘要】目的从分子水平探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因对骨肉瘤生物学行为的影响，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论依据。方法将人BMP-2基因约1.0kb的cDNA片段反向插入逆转录病毒表达载体PDOR,构建人BMP-2基因的反义逆转录表达载体，然后用脂质体将重组的PDOR-BMP-2质粒转染至人的骨肉瘤细胞OS-9901，经G418筛选并获得阳性克隆。用免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶(ABC)方法检测肿瘤细胞中BMP和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。应用流式细胞仪分析肿瘤细胞增殖周期并对其进行电镜观察。结果转染后，OS-9901肿瘤细胞的内源性BMP表达明显下降(t=24.01,P<0.01)，PCNA表达降低(t=26.09,P<0.01)。流式细胞仪分析结果表明，转染导致G1期细胞比例增加，占59.1%，S期细胞比例降低，占22.7%;而转染空载体组G1期细胞占51.2%，S期细胞占39.7%。电镜观察发现，转染后肿瘤细胞中溶酶体增加，有染色质断裂现象。结论反义BMP-2基因的逆转录病毒表达载体可降低骨肉瘤细胞中BMP的表达并导致肿瘤细胞增殖活性降低。
, http://www.100md.com
Construction of human antisense BMP-2 retrovirus expression vectors and its biological effects on human osteosarcoma cells
YUE Wen ,YANG Lianjia, YAN Wei, et al.
(Department of Oral Pathology, Stomatological College of the Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032，China)
【Abstract】Objective To probe into the mechanisms of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in osteosarcoma and to provide basis for gene therapy. Methods A 1.0 kb cDNA fragment of human BMP-2 gene was inserted reversely into PDOR and Human antisense BMP-2 retrovirus expression vector was constructed. The recombinant retroviral vector was transfected into human osteosarcoma cells OS-9901 with liposome AMINE that expressed abundant BMP. Positive cell clones were selected with G 418. The expression of BMP and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was determined by immunohistochemical ABC methods. The osteosarcoma cell cycle was analysed by flowcytometry, and the changes were observed by electronmicroscope. Results The expression of cellular BMP and PCNA in the transfected osteosarcoma cells decreased obviously (t=24.01， 26.09, respectively, P<0.01). Flowcytometry analysis showed that proportion of G 1 phase cells increased in the transfected group but cells in S phase decreased, accounted for 59.1% and 22.7% , respectively, in the controlled group 51.2% cells were in G 1 phase, 39.7% cells were in S phase. Lysosome increased while chromatin in some cells fell into pieces under electronmicroscope. Conclusion Transfection of antisense BMP 2 decreased the expression of BMP and proliferating activity of osteosarcoma cells.
, 百拇医药
【Key words】Bone morphogenetic proteins; Osteosarcoma; DNA,antisense; Mutagenesis,insertional; Genetic vectors
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是机体内的多肽生长因子之一，属于转化因子β超家族。其家族成员具有诱导骨(软)母细胞成熟分化的作用，在胚胎发育及骨骼形成过程中有重要意义。此外还有研究表明，BMP与机体骨肉瘤的发生、发展存在着密切关系，BMP不仅在骨肉瘤中表达丰富，而且与骨肉瘤的不良预后明显相关[1]。在所有的BMP家族成员中，BMP-2被认为与骨肉瘤关系最为密切，作用亦最为重要。为进一步探讨BMP-2基因在骨肉瘤中的作用，我们构建了反义人BMP-2的逆转录病毒表达载体，用脂质体将其转染至人骨肉瘤细胞OS-9901，观察转染对骨肉瘤细胞生物学活性的影响。
材料与方法
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一、材料
(一)酶及主要试剂:限制性内切酶SalⅠ、SmalⅠ、EcoRⅠ、T4DNA连接酶均购自美国Promega公司。脂质体转染试剂盒LipofectAMINE及G418(Geneticin)购自美国Gibco公司。免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶(avidin-biotin-peroxidasecomplex,ABC)试剂盒购自美国DAKO公司。
(二)BMP-2基因质粒、载体和受体菌:人BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒由美国基因研究所Wozney博士馈赠，宿主菌为JM109。PGEM-3Z(+)与PDOR-neo质粒为第四军医大学生物化学教研室朱峰博士馈赠，宿主菌为DH5α。
(三)人骨肉瘤细胞系OS-9901由第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究室张殿忠老师和范清宇教授提供。经过鉴定OS-9901细胞中有BMP-2的基因扩增及蛋白表达。
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二、方法
(一)人BMP-2逆转录病毒表达载体的构建:分别对人BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒、PGEM-3Z(+)质粒与表达载体质粒PDOR-neo进行提取、纯化和鉴定。BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒和PGEM-3Z(+)质粒经SalⅠ和SmalⅠ酶切、电泳后分别回收1.0kb的BMP-2cDNA片段和2.7kb的PGEM-3Z(+)片段,然后T4DNA酶连接,16°C反应过夜。将连接产物转化DH5α细胞，挑取阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定，获得重组的PGEM-3Z(+)BMP-2亚克隆。PGEM-3Z(+)BMP-2质粒和PDOR-neo质粒经SalⅠ和EcoRⅠ酶切、电泳后分别回收1.0kb的BMP-2cDNA片段和2.7kb的PDOR-neo片段，T4DNA酶连接,16°C反应过夜。将连接产物转化DH5α细胞，挑取阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定。
(二)基因转染及克隆筛选:用脂质体将重组的PDOR-BMP-2质粒转染人骨肉瘤细胞系OS-9901细胞，取对数生长期的细胞6×106个，将细胞等分为3组，即(1)转染组，转入脂质体+PDOR-antisense BMP-2；(2)转染空载体组，转入脂质体+PDOR(对照组)；(3)未转染组，不转染任何质粒，仅加入脂质体(亲本组)。转染3d后用G418筛选，2周收集G418抗性的细胞克隆，扩大细胞培养检测指标。
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(三)检测转染后肿瘤细胞中BMP的表达:用免疫组织化学ABC方法检测BMP的表达。首先将细胞甩片经H2O2、正常羊血清处理后加入BMP-2单抗，4℃过夜，再加入生物素化的羊抗鼠IgG以及ABC复合物，DAB显色、脱水、透明、封片。然后利用图像分析系统计数每组细胞中BMP的平均染色灰度值，以确定细胞中BMP的相对含量。
(四)检测转染后肿瘤细胞中增殖细胞核抗原的表达:用同样的免疫组织化学ABC方法检测肿瘤细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达，并确定其细胞中PCNA的相对含量。
(五)细胞电镜学观察:取细胞1×106个,PBS漂洗后用体积分数为4%的戊二醛-多聚甲醛固定，常规脱水包埋，超薄切片，制作透射电镜标本，行铅铀染色。
(六)流式细胞仪分析:取5×105个细胞，经过-20℃预冷、体积分数为95%的乙醇固定2h，用PBS漂洗2次，加入溴化丙啶1ml,4℃闭光染色30min,进行流式细胞仪分析。
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三、统计学分析
组间比较行t检验。
结果
一、人BMP-2反义表达载体的鉴定
亚克隆PGEM-3Z(+)BMP-2重组质粒经SalⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定后获1.0kb的片段，证明亚克隆成功。重组PDOR-BMP-2克隆经SalⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定后得到1.0kb片段，证明载体构建成功，获得反义的重组表达载体PDOR-antisenseBMP-2(图1)。
图1 人BMP-2反义逆转录表达载体的鉴定
二、转染后肿瘤细胞形态的变化及G418筛选结果
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转染PDOR-antisense BMP-2细胞48h后观察发现，转染组与其他两组比较肿瘤细胞形态不规则，数量较少。经G418筛选鉴定后，转染组和转染空载体组(对照组)均在2周后得到肿瘤细胞抗性克隆，而未转染组亲本细胞在2周内全部死亡。初步证明基因转染成功。
三、免疫组织化学检测结果
由表1显示，转染组BMP的染色灰度值高于未转染空载体组，表明转染组BMP表达下降(P<0.01，图2)。以同样的方法检测PCNA的表达，结果显示转染PDOR-antisense BMP-2后，肿瘤细胞PCNA的表达降低，与仅转染了空载体的肿瘤细胞相比差异有显著性意义(P<0.01，图3)。
图2 转染反义人BMP-2表达载体后，骨肉瘤细胞中的BMP表达下降，BMP细胞质染色阳性免疫组织化学ABC法×400a转染空载体组b转染组
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图3 转染反义人BMP-2表达载体后，骨肉瘤细胞中的PCNA表达
下降免疫组织化学ABC法×400a转染空载体组b转染组
表1 转染组和转染空载体组BMP-2、PCNA的表达结果(
±s)
组 别
BMP-2
PCNA
n
染色灰度值
n
染色灰度值
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转染组
20
219.84± 8.51
22
197.30±3.22
空载体组
18
141.40±10.84
20
151.90±7.86
t值
24.01
, http://www.100md.com 26.09*
四、电镜观察结果
在转染了PDOR-antisenseBMP-2的肿瘤细胞基质中，溶酶体增多，个别细胞还出现染色质断裂现象(图4)。
图4 透射电镜观察所见a转染反义人BMP-2表达载体后，肿瘤细胞中溶酶体增加铅铀染色×6000b转染反义人BMP-2表达载体后，肿瘤细胞中出现染色质断裂现象铅铀染色×4000
五、流式细胞仪检测结果
流式细胞仪检测结果表明(表2)，转染空载体组G1期细胞占51.2%，S期细胞占39.7%；而转染PDOR-antisense BMP-2的肿瘤细胞，G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低。说明PDOR-antisense BMP-2抑制了骨肉瘤细胞的增殖。
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表2 转染组和转染空载体组的流式细胞仪分析结果(%)
组 别
n
G1期
G2期
S期
转染组
5×10 5
59.1
18.2
22.7
空载体组
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5×10 5
51.2
10.8
39.7
讨论
BMP作为多肽生长因子之一，参与了机体胚胎的骨骼发育并在骨创伤的修复愈合方面发挥着非常重要的作用。此外，BMP在机体疾病尤其在肿瘤中的作用已引起关注。骨肉瘤是与BMP关系最为密切的肿瘤之一，1973年Amitani等[2]在冻干的骨肉瘤组织中发现并提取出BMP。Yoshikawa等[3]对BMP在骨肉瘤中的病理作用机制进行了大量研究，他认为有BMP表达的骨肉瘤患者五年生存率明显低于无BMP表达者，而且有BMP表达者对化疗药物阿霉素和大剂量氨甲喋呤的敏感性也较差，容易发生远处转移，并且复发率较高。
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我们曾应用免疫组织化学和原位杂交方法检测BMP-2在骨肉瘤中的基因扩增和表达，并结合临床资料进行分析，结果证明BMP-2的表达与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤部位以及组织学分型无关，但与肿瘤患者的预后有关[4]。提示BMP-2可作为临床判断肿瘤预后的辅助性生物学指标。
BMP的表达与肿瘤患者的不良预后相关,可以有两种不同的解释，一是BMP的表达仅是反映肿瘤分化程度的一项指标；二是BMP通过某种生物学途径和作用机制影响了肿瘤细胞的生物学特性。我们曾经应用BMP单抗作用于人骨肉瘤细胞OS-732,结果显示，经BMP单抗作用后肿瘤细胞的裸鼠致瘤性明显降低，证明BMP通过某种机制影响了肿瘤患者的预后。
为了进一步研究BMP-2在骨肉瘤中的作用机制，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论基础，我们构建了反义人BMP-2基因的逆转录病毒表达载体，将其转染至有BMP高表达的骨肉瘤细胞OS-9901，并从细胞增殖活性、细胞周期以及电镜观察几个方面，分析反义BMP-2表达载体对骨肉瘤细胞生物学活性的影响。结果显示，转染反义BMP-2表达载体后，肿瘤细胞的BMP染色灰度值明显升高，由于BMP的相对含量与染色灰度值之间呈反向关系，因此可以认为，反义BMP-2表达载体可造成肿瘤细胞的BMP表达下降。证明利用反义表达载体封闭或降低肿瘤细胞中的BMP表达是可行的，这为进一步的实验研究奠定了基础。
, 百拇医药
PCNA是DNA合成过程中不可缺少的因子，主要表达于细胞的G1期，它可以准确地反映细胞的增殖状况。由于PCNA的检测方法经济、省时、省力，目前已被广泛应用于对肿瘤细胞和非肿瘤细胞增殖活性的检测[5]。在本实验中，我们以PCNA为指标分析肿瘤细胞的增殖活性，表明BMP在肿瘤细胞中表达的降低可以引起肿瘤细胞增殖活性的下降。流式细胞仪分析结果表明，BMP表达下降使G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降，而且电镜观察也发现肿瘤细胞出现较多凋亡倾向，诸如溶酶体增加、染色质断裂等。上述实验结果均进一步证实了骨肉瘤细胞中存在的BMP对肿瘤细胞的增殖有促进作用，这也可能是BMP高表达造成肿瘤患者预后不良的原因之一。
在本实验中，我们首次应用构建的反义BMP-2表达载体转染骨肉瘤细胞，为明确BMP在机体肿瘤中的病理作用机制奠定了基础，并为反义BMP基因应用于骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。
参考文献
, 百拇医药
1，Yoshikawa H, Takaoka K, Masuhara K, et al. Prognostic significance of bone morphogenetic activity in osteosarcoma tissue. Cancer, 1988， 61:569-573.
2，Amitani K， Nakata Y. Studies on a factor responsible for new bone formation from osteosarcoma in mice. Calcif Tissue Res，1975，17:139-150.
3，Yoshikawa H, Takaoka K, Hamada H, et al. Clinical significance of bone morphogenetic activity in osteosarcoma:a study of 20 cases. Cancer,1985，56:1682-1687.
4，岳文，杨连甲，金岩.BMP在颌骨骨肉瘤中的表达、临床意义及应用的基础研究.中华口腔医学杂志，1999，34:174.
5，岳文，凌涤生，龙彦，等.口腔粘膜上皮癌前及癌变过程中PN和P53的表达.实用口腔医学杂志，1998，1:19-21.
(收稿日期:1999-12-08)
(本文编辑:万瑜), 百拇医药
单位：杨连甲、李鑫、董绍忠(710032西安，第四军医大学口腔医学院病理科)；岳文(现调入北京军事医学科学院第三研究所肿瘤分子室)；晏伟、朱峰(病理教研室)；张殿忠、范清宇(第四军医大学唐都医院骨肿瘤实验室)
关键词：骨形态发生蛋白质类；骨肉瘤；DNA，反义；诱变，插入；遗传载体
中华骨科杂志000904
【摘要】目的从分子水平探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因对骨肉瘤生物学行为的影响，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论依据。方法将人BMP-2基因约1.0kb的cDNA片段反向插入逆转录病毒表达载体PDOR,构建人BMP-2基因的反义逆转录表达载体，然后用脂质体将重组的PDOR-BMP-2质粒转染至人的骨肉瘤细胞OS-9901，经G418筛选并获得阳性克隆。用免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶(ABC)方法检测肿瘤细胞中BMP和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。应用流式细胞仪分析肿瘤细胞增殖周期并对其进行电镜观察。结果转染后，OS-9901肿瘤细胞的内源性BMP表达明显下降(t=24.01,P<0.01)，PCNA表达降低(t=26.09,P<0.01)。流式细胞仪分析结果表明，转染导致G1期细胞比例增加，占59.1%，S期细胞比例降低，占22.7%;而转染空载体组G1期细胞占51.2%，S期细胞占39.7%。电镜观察发现，转染后肿瘤细胞中溶酶体增加，有染色质断裂现象。结论反义BMP-2基因的逆转录病毒表达载体可降低骨肉瘤细胞中BMP的表达并导致肿瘤细胞增殖活性降低。
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Construction of human antisense BMP-2 retrovirus expression vectors and its biological effects on human osteosarcoma cells
YUE Wen ,YANG Lianjia, YAN Wei, et al.
(Department of Oral Pathology, Stomatological College of the Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032，China)
【Abstract】Objective To probe into the mechanisms of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in osteosarcoma and to provide basis for gene therapy. Methods A 1.0 kb cDNA fragment of human BMP-2 gene was inserted reversely into PDOR and Human antisense BMP-2 retrovirus expression vector was constructed. The recombinant retroviral vector was transfected into human osteosarcoma cells OS-9901 with liposome AMINE that expressed abundant BMP. Positive cell clones were selected with G 418. The expression of BMP and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was determined by immunohistochemical ABC methods. The osteosarcoma cell cycle was analysed by flowcytometry, and the changes were observed by electronmicroscope. Results The expression of cellular BMP and PCNA in the transfected osteosarcoma cells decreased obviously (t=24.01， 26.09, respectively, P<0.01). Flowcytometry analysis showed that proportion of G 1 phase cells increased in the transfected group but cells in S phase decreased, accounted for 59.1% and 22.7% , respectively, in the controlled group 51.2% cells were in G 1 phase, 39.7% cells were in S phase. Lysosome increased while chromatin in some cells fell into pieces under electronmicroscope. Conclusion Transfection of antisense BMP 2 decreased the expression of BMP and proliferating activity of osteosarcoma cells.
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【Key words】Bone morphogenetic proteins; Osteosarcoma; DNA,antisense; Mutagenesis,insertional; Genetic vectors
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是机体内的多肽生长因子之一，属于转化因子β超家族。其家族成员具有诱导骨(软)母细胞成熟分化的作用，在胚胎发育及骨骼形成过程中有重要意义。此外还有研究表明，BMP与机体骨肉瘤的发生、发展存在着密切关系，BMP不仅在骨肉瘤中表达丰富，而且与骨肉瘤的不良预后明显相关[1]。在所有的BMP家族成员中，BMP-2被认为与骨肉瘤关系最为密切，作用亦最为重要。为进一步探讨BMP-2基因在骨肉瘤中的作用，我们构建了反义人BMP-2的逆转录病毒表达载体，用脂质体将其转染至人骨肉瘤细胞OS-9901，观察转染对骨肉瘤细胞生物学活性的影响。
材料与方法
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一、材料
(一)酶及主要试剂:限制性内切酶SalⅠ、SmalⅠ、EcoRⅠ、T4DNA连接酶均购自美国Promega公司。脂质体转染试剂盒LipofectAMINE及G418(Geneticin)购自美国Gibco公司。免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶(avidin-biotin-peroxidasecomplex,ABC)试剂盒购自美国DAKO公司。
(二)BMP-2基因质粒、载体和受体菌:人BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒由美国基因研究所Wozney博士馈赠，宿主菌为JM109。PGEM-3Z(+)与PDOR-neo质粒为第四军医大学生物化学教研室朱峰博士馈赠，宿主菌为DH5α。
(三)人骨肉瘤细胞系OS-9901由第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究室张殿忠老师和范清宇教授提供。经过鉴定OS-9901细胞中有BMP-2的基因扩增及蛋白表达。
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二、方法
(一)人BMP-2逆转录病毒表达载体的构建:分别对人BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒、PGEM-3Z(+)质粒与表达载体质粒PDOR-neo进行提取、纯化和鉴定。BMP-2psp65-bmp2cDNA质粒和PGEM-3Z(+)质粒经SalⅠ和SmalⅠ酶切、电泳后分别回收1.0kb的BMP-2cDNA片段和2.7kb的PGEM-3Z(+)片段,然后T4DNA酶连接,16°C反应过夜。将连接产物转化DH5α细胞，挑取阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定，获得重组的PGEM-3Z(+)BMP-2亚克隆。PGEM-3Z(+)BMP-2质粒和PDOR-neo质粒经SalⅠ和EcoRⅠ酶切、电泳后分别回收1.0kb的BMP-2cDNA片段和2.7kb的PDOR-neo片段，T4DNA酶连接,16°C反应过夜。将连接产物转化DH5α细胞，挑取阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定。
(二)基因转染及克隆筛选:用脂质体将重组的PDOR-BMP-2质粒转染人骨肉瘤细胞系OS-9901细胞，取对数生长期的细胞6×106个，将细胞等分为3组，即(1)转染组，转入脂质体+PDOR-antisense BMP-2；(2)转染空载体组，转入脂质体+PDOR(对照组)；(3)未转染组，不转染任何质粒，仅加入脂质体(亲本组)。转染3d后用G418筛选，2周收集G418抗性的细胞克隆，扩大细胞培养检测指标。
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(三)检测转染后肿瘤细胞中BMP的表达:用免疫组织化学ABC方法检测BMP的表达。首先将细胞甩片经H2O2、正常羊血清处理后加入BMP-2单抗，4℃过夜，再加入生物素化的羊抗鼠IgG以及ABC复合物，DAB显色、脱水、透明、封片。然后利用图像分析系统计数每组细胞中BMP的平均染色灰度值，以确定细胞中BMP的相对含量。
(四)检测转染后肿瘤细胞中增殖细胞核抗原的表达:用同样的免疫组织化学ABC方法检测肿瘤细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达，并确定其细胞中PCNA的相对含量。
(五)细胞电镜学观察:取细胞1×106个,PBS漂洗后用体积分数为4%的戊二醛-多聚甲醛固定，常规脱水包埋，超薄切片，制作透射电镜标本，行铅铀染色。
(六)流式细胞仪分析:取5×105个细胞，经过-20℃预冷、体积分数为95%的乙醇固定2h，用PBS漂洗2次，加入溴化丙啶1ml,4℃闭光染色30min,进行流式细胞仪分析。
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三、统计学分析
组间比较行t检验。
结果
一、人BMP-2反义表达载体的鉴定
亚克隆PGEM-3Z(+)BMP-2重组质粒经SalⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定后获1.0kb的片段，证明亚克隆成功。重组PDOR-BMP-2克隆经SalⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定后得到1.0kb片段，证明载体构建成功，获得反义的重组表达载体PDOR-antisenseBMP-2(图1)。
图1 人BMP-2反义逆转录表达载体的鉴定
二、转染后肿瘤细胞形态的变化及G418筛选结果
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转染PDOR-antisense BMP-2细胞48h后观察发现，转染组与其他两组比较肿瘤细胞形态不规则，数量较少。经G418筛选鉴定后，转染组和转染空载体组(对照组)均在2周后得到肿瘤细胞抗性克隆，而未转染组亲本细胞在2周内全部死亡。初步证明基因转染成功。
三、免疫组织化学检测结果
由表1显示，转染组BMP的染色灰度值高于未转染空载体组，表明转染组BMP表达下降(P<0.01，图2)。以同样的方法检测PCNA的表达，结果显示转染PDOR-antisense BMP-2后，肿瘤细胞PCNA的表达降低，与仅转染了空载体的肿瘤细胞相比差异有显著性意义(P<0.01，图3)。
图2 转染反义人BMP-2表达载体后，骨肉瘤细胞中的BMP表达下降，BMP细胞质染色阳性免疫组织化学ABC法×400a转染空载体组b转染组
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图3 转染反义人BMP-2表达载体后，骨肉瘤细胞中的PCNA表达
下降免疫组织化学ABC法×400a转染空载体组b转染组
表1 转染组和转染空载体组BMP-2、PCNA的表达结果(
±s)组 别
BMP-2
PCNA
n
染色灰度值
n
染色灰度值
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转染组
20
219.84± 8.51
22
197.30±3.22
空载体组
18
141.40±10.84
20
151.90±7.86
t值
24.01
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四、电镜观察结果
在转染了PDOR-antisenseBMP-2的肿瘤细胞基质中，溶酶体增多，个别细胞还出现染色质断裂现象(图4)。
图4 透射电镜观察所见a转染反义人BMP-2表达载体后，肿瘤细胞中溶酶体增加铅铀染色×6000b转染反义人BMP-2表达载体后，肿瘤细胞中出现染色质断裂现象铅铀染色×4000
五、流式细胞仪检测结果
流式细胞仪检测结果表明(表2)，转染空载体组G1期细胞占51.2%，S期细胞占39.7%；而转染PDOR-antisense BMP-2的肿瘤细胞，G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低。说明PDOR-antisense BMP-2抑制了骨肉瘤细胞的增殖。
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表2 转染组和转染空载体组的流式细胞仪分析结果(%)
组 别
n
G1期
G2期
S期
转染组
5×10 5
59.1
18.2
22.7
空载体组
, 百拇医药
5×10 5
51.2
10.8
39.7
讨论
BMP作为多肽生长因子之一，参与了机体胚胎的骨骼发育并在骨创伤的修复愈合方面发挥着非常重要的作用。此外，BMP在机体疾病尤其在肿瘤中的作用已引起关注。骨肉瘤是与BMP关系最为密切的肿瘤之一，1973年Amitani等[2]在冻干的骨肉瘤组织中发现并提取出BMP。Yoshikawa等[3]对BMP在骨肉瘤中的病理作用机制进行了大量研究，他认为有BMP表达的骨肉瘤患者五年生存率明显低于无BMP表达者，而且有BMP表达者对化疗药物阿霉素和大剂量氨甲喋呤的敏感性也较差，容易发生远处转移，并且复发率较高。
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我们曾应用免疫组织化学和原位杂交方法检测BMP-2在骨肉瘤中的基因扩增和表达，并结合临床资料进行分析，结果证明BMP-2的表达与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤部位以及组织学分型无关，但与肿瘤患者的预后有关[4]。提示BMP-2可作为临床判断肿瘤预后的辅助性生物学指标。
BMP的表达与肿瘤患者的不良预后相关,可以有两种不同的解释，一是BMP的表达仅是反映肿瘤分化程度的一项指标；二是BMP通过某种生物学途径和作用机制影响了肿瘤细胞的生物学特性。我们曾经应用BMP单抗作用于人骨肉瘤细胞OS-732,结果显示，经BMP单抗作用后肿瘤细胞的裸鼠致瘤性明显降低，证明BMP通过某种机制影响了肿瘤患者的预后。
为了进一步研究BMP-2在骨肉瘤中的作用机制，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论基础，我们构建了反义人BMP-2基因的逆转录病毒表达载体，将其转染至有BMP高表达的骨肉瘤细胞OS-9901，并从细胞增殖活性、细胞周期以及电镜观察几个方面，分析反义BMP-2表达载体对骨肉瘤细胞生物学活性的影响。结果显示，转染反义BMP-2表达载体后，肿瘤细胞的BMP染色灰度值明显升高，由于BMP的相对含量与染色灰度值之间呈反向关系，因此可以认为，反义BMP-2表达载体可造成肿瘤细胞的BMP表达下降。证明利用反义表达载体封闭或降低肿瘤细胞中的BMP表达是可行的，这为进一步的实验研究奠定了基础。
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PCNA是DNA合成过程中不可缺少的因子，主要表达于细胞的G1期，它可以准确地反映细胞的增殖状况。由于PCNA的检测方法经济、省时、省力，目前已被广泛应用于对肿瘤细胞和非肿瘤细胞增殖活性的检测[5]。在本实验中，我们以PCNA为指标分析肿瘤细胞的增殖活性，表明BMP在肿瘤细胞中表达的降低可以引起肿瘤细胞增殖活性的下降。流式细胞仪分析结果表明，BMP表达下降使G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降，而且电镜观察也发现肿瘤细胞出现较多凋亡倾向，诸如溶酶体增加、染色质断裂等。上述实验结果均进一步证实了骨肉瘤细胞中存在的BMP对肿瘤细胞的增殖有促进作用，这也可能是BMP高表达造成肿瘤患者预后不良的原因之一。
在本实验中，我们首次应用构建的反义BMP-2表达载体转染骨肉瘤细胞，为明确BMP在机体肿瘤中的病理作用机制奠定了基础，并为反义BMP基因应用于骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。
参考文献
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1，Yoshikawa H, Takaoka K, Masuhara K, et al. Prognostic significance of bone morphogenetic activity in osteosarcoma tissue. Cancer, 1988， 61:569-573.
2，Amitani K， Nakata Y. Studies on a factor responsible for new bone formation from osteosarcoma in mice. Calcif Tissue Res，1975，17:139-150.
3，Yoshikawa H, Takaoka K, Hamada H, et al. Clinical significance of bone morphogenetic activity in osteosarcoma:a study of 20 cases. Cancer,1985，56:1682-1687.
4，岳文，杨连甲，金岩.BMP在颌骨骨肉瘤中的表达、临床意义及应用的基础研究.中华口腔医学杂志，1999，34:174.
5，岳文，凌涤生，龙彦，等.口腔粘膜上皮癌前及癌变过程中PN和P53的表达.实用口腔医学杂志，1998，1:19-21.
(收稿日期:1999-12-08)
(本文编辑:万瑜), 百拇医药