异搏定对白血病K562细胞耐药性的逆转作用
尚世丽 刘云鹏 罗颖 卢香兰 张敬东 车晓芳 翟明
摘 要 目的：研究异搏定对P-糖蛋白(Pgp)介导的人类白血病K562细胞多药耐药作用。方法：用台盼蓝拒染法检测药物敏感性及异搏定对细胞耐药性的影响，用免疫组织化学法检测Pgp的表达，用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素(DNR)积聚。结果：DNR诱导的耐药细胞K562/D对DNR、长春新碱(VCR)、高三尖杉脂碱(HHT)、鬼臼乙叉甙(VP16)、米托恩醌(MIT)交叉耐药。DNR诱导了K562/D细胞的Pgp过度表达。异搏定使K562/D细胞内药物积聚增加，明显地逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT、HHT、VP-16的耐药性，而对敏感细胞K562/S的耐药性无影响。结论：DNR诱导了K562/D细胞的Pgp过度表达，异搏定通过抑制Pgp功能逆转了Pgp介导的K562/D 细胞的多药耐药性。
关键词：多药耐药性 P-糖蛋白 异搏定
, http://www.100md.com 肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是化疗失败的重要原因，严重影响肿瘤的预后。MDR形成机理复杂，其中多药耐药基因mdrl过度表达是导致MDR的重要原因之一。研究表明，有些对化疗固有耐药及化疗后复发的人类恶性肿瘤中Pgp及mdrl的mRNA水平增高[1]，并且Pgp过表达的病人缓解率低，缓解时间短[2]。mdrl基因编码的P-糖蛋白(Pgp)可增加药物的外排作用导致细胞内药物积聚减少。Massart等报告钙离子拮抗剂异搏定可以逆转Pgp介导的MDR[3]。本研究为进一步探讨异搏定逆转Pgp介导的MDR的机理，及异搏定在临床逆转耐药方面的合理应用，测定了人类髓系白血病K562多药耐药细胞及其敏感细胞对柔红霉素(DNR) 、长春新碱(VCR)、阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉脂碱(HHT)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、米托恩醌(MIT)的药物敏感性及Pgp的表达，以及异搏定对耐药细胞对DNR的细胞内积聚和细胞耐药性影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞培养 人类髓系白血病K562细胞的DNR耐药株K562/D及其敏感株K562/S(日本福井医科大学溥崎芳正先生惠赠，在含有10%小牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中，5%CO2，95%空气，饱和湿度，37℃条件下传代培养。K562所有实验用细胞均处于对数生长期。
1.2 药品与试剂 DNR(意大利爱宝大药厂)，VCR(上海华联制药有限公司)，Ara-C(法玛西亚普强医药公司)，HHT(北京协和药厂)，VP-16(上海医药工业研究院实验药厂)，MIT(浙江省浙南制药厂)，异搏定(SIGMA)，mdrl抗体(兔IgG多抗，Calbiochem)。
1.3 药物敏感性测定 将K562/D及K562/S细胞置于24孔培养板中，分别加入不同浓度的DNR、VCR、Ara-C、HHT、VP-16、MIT，培养72 h后，用台盼蓝拒染法计算细胞的生长率(加处理因素后的活细胞数/对照活细胞数×100)，绘制生长曲线。为测定异搏定对细胞耐药性的影响，同时加入异搏定，终浓度为5μmol/L，观察添加异搏定前后K562/D耐药性的变化。
, 百拇医药
1.4 Pgp的检测 将K562/D及K562/S 细胞离心涂片，4℃丙酮固定10 min，自然干燥。室温下用非特异血清封闭后，加mdrl抗体，4℃过夜。PBS清洗后，加生物素化的抗mdrl抗体，室温孵育60 min。PBS清洗后，SAP复合物孵育60 min。PBS清洗后，加显色剂(LAB-SA SYSTEM试剂盒)室温孵育10 min，苏木素复染2 min，封片。光学显微镜下，胞膜周围呈红色颗粒者为Pgp阳性。
1.5 细胞内DNR积聚的检测 取K562/D及K562/S细胞(1×106个细胞/ml)，加入异搏定，终浓度为5μmol/L，培养60 min后，加入DNR，终浓度为1 μmol/L，37℃孵育15 min，用流式细胞仪(Facscan, Becton Dickinson)检测细胞内DNR的荧光强度。
1.6 统计学处理 实验结果以均值±标准差表示，显著性检验用t检验，P<0.05为有意义。
, 百拇医药
2 结果
2.1 K562/D细胞的耐药性质
K562/S及K562/D细胞培养液中分别加入DNR、VCR、HHT、VP-16、MIT、Ara-C培养72 h后，这些药物均对两种细胞的增殖产生了不同程度的抑制作用，比较K562/S与K562/D的IC50(抑制细胞增殖50%的药物浓度)，K562/D细胞对DNR、VCR、HHT、VP-16、MIT的相对耐药性在14～132倍之间，其中，对VCR耐药性最强，为132倍，对MIT耐药性最弱，为15.43倍，但对Ara-C未产生耐药性(表1)。
表1 K562细胞的药物敏感性(IC50)
Tab. 1 Drug sensitivities of K562/S and K562/D
, 百拇医药
cells (IC50)
药物
IC50(μmol/L)
相对耐药性
(K562/D/K562/S)
K562/S
K562/D
DNR
0.016
1.09
68.13
HHT
, 百拇医药
0.011
0.32
29.09
VCR
0.02
2.64
132
MIT
0.07
1.08
15.43
VP-16
0.11
, http://www.100md.com
6.97
63.36
Ara-C
0.006
0.011
1.83
培养时间： 72 h数据为3次实验的均值(P<0.05)
2.2 K562/D细胞的Pgp的表达
免疫组织化学检测表明，K562/D细胞有Pgp的过度表达，而K562/S细胞无Pgp表达(图1，2)，提示K562/D的多药耐药性与Pgp过表达有关。
2.3 异搏定对K562细胞耐药性影响
, http://www.100md.com
图1 K562/S细胞，细胞呈Pgp阴性反应 × 400
Fig. 1 Expression of Pgp in K562/S cells
图2 K562/D细胞，细胞呈Pgp阳性反应 × 400
Fig. 2 Expression of Pgp in K562/D cells
在细胞培养液中，分别加入不同的抗癌药物，同时加入异搏定，终浓度为5 μmol/L。异搏定显著地逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT的耐药性，耐药倍数分别降至3.08、1.12、2.5倍，部分逆转了对HHT、VP-16的耐药性，耐药倍数分别降至10、10.44倍，(P<0.05)。对K562/S细胞的耐药性无影响(表2)。
, 百拇医药
2.4 异搏定对K562细胞内DNR积聚的影响
流式细胞仪检测表明，5 μmol/L异搏定对K562/S细胞内DNR积聚无影响，但同一浓度的异搏定使K562/D细胞内DNR积聚增加，DNR荧光强度增加4.9倍。
表2 异搏定对K562细胞的药物敏感性(IC50)的影响
Tab. 2 Effect of Verapamil on drug sensitivities in
K562/S and K562/D cells
药物
IC50(μmol/L)
相对耐药性
, http://www.100md.com
(K562/D/K562/S)
K562/S
K562/D
DNR
0.013
0.04
3.08
HHT
0.009
0.09
10
VCR
0.017
, 百拇医药
0.019
1.12
MIT
0.06
0.15
2.5
VP-16
0.09
0.97
10.44
Ara-C
0.006
0.011
, 百拇医药
1.8
培养时间： 72 h数据为3次实验的均值,P<0.05
图3 异搏定对K562/D细胞内DNR积聚的影响
VER： 5μmol/L，异搏定60 min
Fig. 3 Effect of verapamil on DNR accumulation in K562/D cells
VER: 5 μmol/L, Verapmil 60 min
3 讨论
, 百拇医药 近年来，急性白血病的化疗缓解率日益提高，但仍有许多患者复发，主要原因是白血病细胞产生了原发性或获得性耐药。部分病人肿瘤细胞化疗前也可检测到Pgp，但在多数Pgp阴性病人的肿瘤细胞反复接触化疗药后，可诱导Pgp的过度表达。本研究所采用的MDR细胞为敏感型K562细胞长期接触DNR，并不断提高DNR浓度获得的耐药细胞，免疫组化检测表明，K562/D细胞存在Pgp的过度表达。目前的研究表明，Pgp介导的MDR表现为肿瘤细胞对一种药物产生耐药后 ，对结构各异、作用机制不同的许多化疗药物交叉耐药。本实验中K562/D细胞除对DNR耐药之外，对VCR、VP-16、MIT、HHT均有交叉耐药，但对Ara-C无交叉耐药，与文献报告相似[4]，提示K562/D细胞的多药耐药性与Pgp有密切关系。
与Pgp介导的耐药相关的化疗药物靠浓度梯度进入细胞后与Pgp结合，同时Pgp的核苷酸结合位点结合ATP，随即ATP水解，释放能量，将药物自胞内转至胞外，使细胞产生MDR。钙离子拮抗剂可通过抑制Pgp功能逆转耐药。本实验中5 μmol/L异搏定使K562/D细胞内DNR积聚增多，显著逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT的耐药性，部分逆转了K562/D细胞对VP-16、HHT的耐药性，而对K562/S细胞的药物敏感性无影响，证实了异搏定通过抑制Pgp的功能逆转K562/D的耐药性。
, 百拇医药
目前，异搏定已用于临床逆转耐药[5]，但由于异搏定能够引起心率失常等副作用，需在心电监护下应用。特异性更强、心脏副作用更小的异搏定异构体正在研制之中。这些结果对认识Pgp作用机理、寻找逆转Pgp药物及异搏定的临床应用可能具有一定意义。
辽宁省自然科学基金资助项目，962303
尚世丽(研究生，鞍钢铁东医院血液科)
刘云鹏(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
罗颖(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
卢香兰(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
张敬东(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
, 百拇医药
车晓芳(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
翟明(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
参考文献
1，Weinstein RS, Jakate SM, Dominguez JM, et al. Relationship of the expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human colon carcinoma to local tumor aggressiveness and lymph node metastasis. Cancer Res, 1991,51:2720-2726
2，Michieli M, Damiani D, Ermacora A, et al. P-glycoprotein, lung resistance-related protein and multidrug resistance associated protein in de novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implications. Br J Haematol, 1999,104:328-335
, 百拇医药
3，Massatrt C, Gibassier J, Lucas C, et al. Expression of the MDR1 gene in five human cell lines of medullary thyroid cancer and reversion of the resistance to doxorubicine by cylosporin A and verapamil. Bull Cancer, 1996,83:39-45
4，Urasaki Y, Ueda T, Yoshida A, et al. Establishment of a daunorubicin-resistant cell line which shows multi-drug resistance by multifactorial mechanism. Anticancer Res., 1996,16:709-714
5，Arvelo F, Poupon MF, Bichat F, et al. Adding a reverser (verapamil) to combined chemotherapy overrides resistance in small cell lung cancer xenografts. Eur J Cancer, 1995,31A:1862-1868, 百拇医药
摘 要 目的：研究异搏定对P-糖蛋白(Pgp)介导的人类白血病K562细胞多药耐药作用。方法：用台盼蓝拒染法检测药物敏感性及异搏定对细胞耐药性的影响，用免疫组织化学法检测Pgp的表达，用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素(DNR)积聚。结果：DNR诱导的耐药细胞K562/D对DNR、长春新碱(VCR)、高三尖杉脂碱(HHT)、鬼臼乙叉甙(VP16)、米托恩醌(MIT)交叉耐药。DNR诱导了K562/D细胞的Pgp过度表达。异搏定使K562/D细胞内药物积聚增加，明显地逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT、HHT、VP-16的耐药性，而对敏感细胞K562/S的耐药性无影响。结论：DNR诱导了K562/D细胞的Pgp过度表达，异搏定通过抑制Pgp功能逆转了Pgp介导的K562/D 细胞的多药耐药性。
关键词：多药耐药性 P-糖蛋白 异搏定
, http://www.100md.com 肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是化疗失败的重要原因，严重影响肿瘤的预后。MDR形成机理复杂，其中多药耐药基因mdrl过度表达是导致MDR的重要原因之一。研究表明，有些对化疗固有耐药及化疗后复发的人类恶性肿瘤中Pgp及mdrl的mRNA水平增高[1]，并且Pgp过表达的病人缓解率低，缓解时间短[2]。mdrl基因编码的P-糖蛋白(Pgp)可增加药物的外排作用导致细胞内药物积聚减少。Massart等报告钙离子拮抗剂异搏定可以逆转Pgp介导的MDR[3]。本研究为进一步探讨异搏定逆转Pgp介导的MDR的机理，及异搏定在临床逆转耐药方面的合理应用，测定了人类髓系白血病K562多药耐药细胞及其敏感细胞对柔红霉素(DNR) 、长春新碱(VCR)、阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉脂碱(HHT)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、米托恩醌(MIT)的药物敏感性及Pgp的表达，以及异搏定对耐药细胞对DNR的细胞内积聚和细胞耐药性影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞培养 人类髓系白血病K562细胞的DNR耐药株K562/D及其敏感株K562/S(日本福井医科大学溥崎芳正先生惠赠，在含有10%小牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中，5%CO2，95%空气，饱和湿度，37℃条件下传代培养。K562所有实验用细胞均处于对数生长期。
1.2 药品与试剂 DNR(意大利爱宝大药厂)，VCR(上海华联制药有限公司)，Ara-C(法玛西亚普强医药公司)，HHT(北京协和药厂)，VP-16(上海医药工业研究院实验药厂)，MIT(浙江省浙南制药厂)，异搏定(SIGMA)，mdrl抗体(兔IgG多抗，Calbiochem)。
1.3 药物敏感性测定 将K562/D及K562/S细胞置于24孔培养板中，分别加入不同浓度的DNR、VCR、Ara-C、HHT、VP-16、MIT，培养72 h后，用台盼蓝拒染法计算细胞的生长率(加处理因素后的活细胞数/对照活细胞数×100)，绘制生长曲线。为测定异搏定对细胞耐药性的影响，同时加入异搏定，终浓度为5μmol/L，观察添加异搏定前后K562/D耐药性的变化。
, 百拇医药
1.4 Pgp的检测 将K562/D及K562/S 细胞离心涂片，4℃丙酮固定10 min，自然干燥。室温下用非特异血清封闭后，加mdrl抗体，4℃过夜。PBS清洗后，加生物素化的抗mdrl抗体，室温孵育60 min。PBS清洗后，SAP复合物孵育60 min。PBS清洗后，加显色剂(LAB-SA SYSTEM试剂盒)室温孵育10 min，苏木素复染2 min，封片。光学显微镜下，胞膜周围呈红色颗粒者为Pgp阳性。
1.5 细胞内DNR积聚的检测 取K562/D及K562/S细胞(1×106个细胞/ml)，加入异搏定，终浓度为5μmol/L，培养60 min后，加入DNR，终浓度为1 μmol/L，37℃孵育15 min，用流式细胞仪(Facscan, Becton Dickinson)检测细胞内DNR的荧光强度。
1.6 统计学处理 实验结果以均值±标准差表示，显著性检验用t检验，P<0.05为有意义。
, 百拇医药
2 结果
2.1 K562/D细胞的耐药性质
K562/S及K562/D细胞培养液中分别加入DNR、VCR、HHT、VP-16、MIT、Ara-C培养72 h后，这些药物均对两种细胞的增殖产生了不同程度的抑制作用，比较K562/S与K562/D的IC50(抑制细胞增殖50%的药物浓度)，K562/D细胞对DNR、VCR、HHT、VP-16、MIT的相对耐药性在14～132倍之间，其中，对VCR耐药性最强，为132倍，对MIT耐药性最弱，为15.43倍，但对Ara-C未产生耐药性(表1)。
表1 K562细胞的药物敏感性(IC50)
Tab. 1 Drug sensitivities of K562/S and K562/D
, 百拇医药
cells (IC50)
药物
IC50(μmol/L)
相对耐药性
(K562/D/K562/S)
K562/S
K562/D
DNR
0.016
1.09
68.13
HHT
, 百拇医药
0.011
0.32
29.09
VCR
0.02
2.64
132
MIT
0.07
1.08
15.43
VP-16
0.11
, http://www.100md.com
6.97
63.36
Ara-C
0.006
0.011
1.83
培养时间： 72 h数据为3次实验的均值(P<0.05)
2.2 K562/D细胞的Pgp的表达
免疫组织化学检测表明，K562/D细胞有Pgp的过度表达，而K562/S细胞无Pgp表达(图1，2)，提示K562/D的多药耐药性与Pgp过表达有关。
2.3 异搏定对K562细胞耐药性影响
, http://www.100md.com
图1 K562/S细胞，细胞呈Pgp阴性反应 × 400
Fig. 1 Expression of Pgp in K562/S cells
图2 K562/D细胞，细胞呈Pgp阳性反应 × 400
Fig. 2 Expression of Pgp in K562/D cells
在细胞培养液中，分别加入不同的抗癌药物，同时加入异搏定，终浓度为5 μmol/L。异搏定显著地逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT的耐药性，耐药倍数分别降至3.08、1.12、2.5倍，部分逆转了对HHT、VP-16的耐药性，耐药倍数分别降至10、10.44倍，(P<0.05)。对K562/S细胞的耐药性无影响(表2)。
, 百拇医药
2.4 异搏定对K562细胞内DNR积聚的影响
流式细胞仪检测表明，5 μmol/L异搏定对K562/S细胞内DNR积聚无影响，但同一浓度的异搏定使K562/D细胞内DNR积聚增加，DNR荧光强度增加4.9倍。
表2 异搏定对K562细胞的药物敏感性(IC50)的影响
Tab. 2 Effect of Verapamil on drug sensitivities in
K562/S and K562/D cells
药物
IC50(μmol/L)
相对耐药性
, http://www.100md.com
(K562/D/K562/S)
K562/S
K562/D
DNR
0.013
0.04
3.08
HHT
0.009
0.09
10
VCR
0.017
, 百拇医药
0.019
1.12
MIT
0.06
0.15
2.5
VP-16
0.09
0.97
10.44
Ara-C
0.006
0.011
, 百拇医药
1.8
培养时间： 72 h数据为3次实验的均值,P<0.05
图3 异搏定对K562/D细胞内DNR积聚的影响
VER： 5μmol/L，异搏定60 min
Fig. 3 Effect of verapamil on DNR accumulation in K562/D cells
VER: 5 μmol/L, Verapmil 60 min
3 讨论
, 百拇医药 近年来，急性白血病的化疗缓解率日益提高，但仍有许多患者复发，主要原因是白血病细胞产生了原发性或获得性耐药。部分病人肿瘤细胞化疗前也可检测到Pgp，但在多数Pgp阴性病人的肿瘤细胞反复接触化疗药后，可诱导Pgp的过度表达。本研究所采用的MDR细胞为敏感型K562细胞长期接触DNR，并不断提高DNR浓度获得的耐药细胞，免疫组化检测表明，K562/D细胞存在Pgp的过度表达。目前的研究表明，Pgp介导的MDR表现为肿瘤细胞对一种药物产生耐药后 ，对结构各异、作用机制不同的许多化疗药物交叉耐药。本实验中K562/D细胞除对DNR耐药之外，对VCR、VP-16、MIT、HHT均有交叉耐药，但对Ara-C无交叉耐药，与文献报告相似[4]，提示K562/D细胞的多药耐药性与Pgp有密切关系。
与Pgp介导的耐药相关的化疗药物靠浓度梯度进入细胞后与Pgp结合，同时Pgp的核苷酸结合位点结合ATP，随即ATP水解，释放能量，将药物自胞内转至胞外，使细胞产生MDR。钙离子拮抗剂可通过抑制Pgp功能逆转耐药。本实验中5 μmol/L异搏定使K562/D细胞内DNR积聚增多，显著逆转了K562/D细胞对DNR、VCR、MIT的耐药性，部分逆转了K562/D细胞对VP-16、HHT的耐药性，而对K562/S细胞的药物敏感性无影响，证实了异搏定通过抑制Pgp的功能逆转K562/D的耐药性。
, 百拇医药
目前，异搏定已用于临床逆转耐药[5]，但由于异搏定能够引起心率失常等副作用，需在心电监护下应用。特异性更强、心脏副作用更小的异搏定异构体正在研制之中。这些结果对认识Pgp作用机理、寻找逆转Pgp药物及异搏定的临床应用可能具有一定意义。
辽宁省自然科学基金资助项目，962303
尚世丽(研究生，鞍钢铁东医院血液科)
刘云鹏(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
罗颖(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
卢香兰(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
张敬东(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
, 百拇医药
车晓芳(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
翟明(中国医科大学第一临床学院血液科，沈阳 110001)
参考文献
1，Weinstein RS, Jakate SM, Dominguez JM, et al. Relationship of the expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human colon carcinoma to local tumor aggressiveness and lymph node metastasis. Cancer Res, 1991,51:2720-2726
2，Michieli M, Damiani D, Ermacora A, et al. P-glycoprotein, lung resistance-related protein and multidrug resistance associated protein in de novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implications. Br J Haematol, 1999,104:328-335
, 百拇医药
3，Massatrt C, Gibassier J, Lucas C, et al. Expression of the MDR1 gene in five human cell lines of medullary thyroid cancer and reversion of the resistance to doxorubicine by cylosporin A and verapamil. Bull Cancer, 1996,83:39-45
4，Urasaki Y, Ueda T, Yoshida A, et al. Establishment of a daunorubicin-resistant cell line which shows multi-drug resistance by multifactorial mechanism. Anticancer Res., 1996,16:709-714
5，Arvelo F, Poupon MF, Bichat F, et al. Adding a reverser (verapamil) to combined chemotherapy overrides resistance in small cell lung cancer xenografts. Eur J Cancer, 1995,31A:1862-1868, 百拇医药