人 IL-2Rα 基因在 CHO 细胞中的稳定整合和表达及其应用
人 IL-2Rα 基因在 CHO 细胞中的稳定整合和表达及其应用
程小款 杜洪震 张玉建 高军萍 衡凤燕 吴宁华 沈珝琲
摘 要 目的 应用本组制备的白细胞介素2受体(IL-2R)，建立一种既安全又简便，并能定量检测白细胞介素2(IL-2)生物活性的方法。 方法 采用 Southern 印迹杂交方法，检测重组分泌型 IL-2Rα 亚基(rsIL-2Rα)基因在高效表达的转染细胞基因组中的稳定整合；以 Western 免疫印迹法测定 rsIL-2Rα 的相对分子质量，建立定量检测人 IL-2 生物活性的受体与抗体夹心酶联免疫吸附测定(rELISA)方法。 结果 (1) Southern 印迹分析表明，rsIL-2Rα 基因已稳定整合到高表达的转染 CHO 细胞基因组中； (2) rsIL-2Rα 的相对分子质量为 40 000 左右； (3) 应用建立的 rELISA 方法测定人 IL-2 标准溶液结果表明， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995)；预先将山羊抗人 IL-2 IgG 与 IL-2 保温后，所得标准曲线的斜率明显降低 (P<0.05)。 结论 与传统测定 IL-2 的方法相比，用 rsIL-2Rα 建立的受体-抗体夹心 rELISA 方法不仅具有准确、特异性强及操作简便的特点，而且，所得结果直接反映了被测样品中具有结合 IL-2R 活性的 IL-2 的水平。
, http://www.100md.com
关键词：分泌型人白细胞介素-2 受体α链 酶联免疫吸附法 白细胞介素-2
白细胞介素2受体(IL-2R)由 α、β 及 γ 3 种亚基组成，其中 β 亚基也是 IL-15 受体的组成成分，γ 亚基又是 IL-4、IL-7 及 IL-9 受体的组成成分，只有 α 亚基与 IL-2 呈特异性结合，其解离常数为 10-8 mol/L[1]。因此，制备重组分泌型 IL-2Rα 链 (rsIL-2Rα) 不仅对研究该蛋白的结构与功能有重要意义，而且，有助于用亲和层析方法纯化 IL-2 及测定人外周血及细胞培养上清中具有生物活性的 IL-2 的水平。本组采用基因工程技术、细胞转染及 G418 筛选建立了一株能分泌高活性 rsIL-2Rα 的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞株[2]。本实验对该株细胞中 rsIL-2Rα 基因的稳定整合状态及其表达产物的相对分子质量进行了鉴定，并应用 rsIL-2Rα 建立了定量检测具有生物活性的 IL-2 的受体与抗体夹心酶联免疫吸附法(rELISA)。
, 百拇医药
材料和方法
材料 限制性内切酶为 Boehringer Mannheim 公司产品，寡核苷酸标记试剂盒及 Oligolablling Kit 及低分子量蛋白标准(LWM)均为 Pharmacia 公司产品，[α-32P]dCTP(1.11×1014Bq/mmol)购自北京亚辉公司，尼龙膜及硝酸纤维膜为 Bio-Rad 公司产品，超滤器及滤膜 PM10 为 Amico 公司产品，DMEM 培养基、CHO-S-SFM Ⅱ 无血清培养基及 trypsin-EDTA 为 Gibco/BRL 公司产品。
质粒 pCMV/sIL-2R 及表达 rsIL-2Rα 的 #17 CHO 细胞株均为本组建立[2]，重组人 IL-2 (2000 U/μl) 为上海第二军医大学陈克明教授惠赠， IL-2 标准品购自北京市药品检定所，山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 为 R&D 公司产品，辣根过氧化物酶(HRP)标记驴抗山羊 IgG 购自北京中山生物制品有限公司，兔抗人 IL-2Rα 单克隆抗体及 HRP 标记羊抗兔 IgG 均购自北京华美生物工程公司，磷苯二胺(OPD)为北京芳草医药工业公司产品，二氨基联苯胺(DAB)为北京旭东制药厂产品，其它试剂均为国产分析纯。
, http://www.100md.com
CHO 细胞培养上清液的收集 将已在液氮中保存3年的、表达 rsIL-2Rα 的 #17 CHO 细胞株复苏后，先在含 400 μg/ml G418 的 DMEM 培养基中培养 10～14 d，再按 3×105 个/ml 细胞的密度在无血清培养基 CHO-S-SFM Ⅱ 中继续培养 72 h，离心收集上清，经超滤浓缩 60～100 倍，分装后-20℃保存。
探针的制备 质粒 pCMV/sIL-2R 经 Hind Ⅲ 酶切后，回收 0.8 kb sIL-2Rα cDNA 片段，按寡核苷酸标记试剂盒提供的方法用 [α-32P] dCTP 进行标记。
Southern 印迹杂交[3] 首先分别提取 #17 CHO 细胞及转染空载体的 CHO 细胞基因组 DNA，经 EcoR Ⅰ 水解后，以 0.7% 琼脂糖凝胶进行电泳，然后将 DNA 转移至尼龙膜上， 68℃ 预杂交 2 h，加入 sIL-2Rα cDNA 探针 (740 Bq/ml)，杂交过夜，再依次用 6×SSC-0.5% SDS、1×SSC-0.5% SDS 及 0.1×SSC-0.5% SDS 洗膜后，进行放射自显影。
, 百拇医药
Western 免疫印迹[4] 30 μl 细胞培养上清浓缩液经 12.6% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分离的蛋白转至硝酸纤维膜上。 LMW 蛋白标准用氨基黑染色，样品蛋白经含 5% 脱脂奶粉的 TBS (0.9% NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4) 在 4℃ 封闭，放置过夜或室温放置 2 h 后，以 TBS 洗 3 次(每次 10 min)；再与 1∶40 兔抗人 IL-2Rα 抗体在 37℃ 反应 2 h， TBS 洗 3次后，用 1∶50 HRP 标记的羊抗兔 IgG 反应 1～2 h，再以 TBS 洗 3 次；加 DAB 显色液，室温反应 2～3 min 后观察结果。
rELISA 方法检测 IL-2 的活性 向酶标板孔内加 20 μl CHO 细胞培养上清浓缩液和 80 μl 0.05 mol/L 碳酸缓冲液 (pH 9.6)， 4℃ 包被过夜；弃包被液后，再加 200 μl 1% BSA 的 PBS 缓冲液，在 37℃ 放置 2 h后，用 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液(PBS-T)洗 3 次(每次 5 min)，然后加 IL-2 标准品或待测样品后，放置 37℃ 2 h 或 4℃ 过夜；再用 PBS-T 洗 3 次，加 100 μl 1∶200 山羊抗人 IL-2 IgG，在 37℃ 反应 2 h， PBS-T 洗 3 次；加 100 μl 1∶500 HRP 标记驴抗山羊 IgG， 37℃ 反应 1～2 h，PBS-T 洗 3 次后，加 100 μl OPD 显色液，避光室温反应 10～15 min，加 50 μl 2 mol/L H2SO4 终止反应后测定光密度(波长 490 nm)。 在特异性抑制实验中，预先将 2000 U IL-2 分别与 10 μg 山羊抗人 IL-2 IgG 及正常山羊血清 IgG 在 37℃ 保温 30 min，稀释成不同浓度，再按上述步骤进行测定。每次每份样品均作双份测定。
, http://www.100md.com
结果
rsIL-2Rα 基因在 CHO 细胞中的稳定整合 Southern 印迹分析显示，经 EcoR Ⅰ 酶切后的 #17 CHO 细胞株 DNA 在 2.3～4.3 kb 之间呈现 3～4 条杂交带，表明 rsIL-2Rα 基因已稳定整合到该细胞株的基因组中(图1)。
图 1 CHO 细胞基因组 DNA 与 [α-32P] dCTP 标记的rIL-2Rα 基因的
Southern 印迹杂交图谱
Fig 1 Southern blotting of genomic DNA of CHO cells probed by [α-32P]
, http://www.100md.com
dCTP-labeled rIL-2Rα cDNA
A. 0.7% agarose gel electrophoresis; B. Southern blot hybridization;
M. λDNA/Hind Ⅲ P. #17 CHO cells; C. CHO cells transfected with mock vector
rsIL-2R 的相对分子质量 Western 免疫印迹显示，#17CHO 细胞培养上清液在相对分子质量 40 000 处出现数条结合带，而转染空载体的细胞上清则未见相应结合带(图2)。
rsIL-2Rα 与 IL-2 结合活性的鉴定 采用 rELISA 方法检测含有不同活性单位的人 IL-2 标准溶液，结果显示， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995) (图3)，表明 #17 细胞株培养上清液具有结合人 IL-2 的生物活性。转染空载体的细胞株培养上清液不能与 IL-2 结合(结果略)。
, http://www.100md.com
rsIL-2Rα 与 IL-2 结合特异性 预先将 IL-2 与山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 保温后，再与包被了 #17 细胞株培养上清浓缩液的酶标板进行 rELISA 测定。结果测得的标准曲线的斜率明显小于未经抗体处理的 IL-2 的标准曲线 (P<0.05)，而培养上清液与经正常山羊血清 IgG 处理的 IL-2 的结合活性的差异无统计学意义(P>0.1)(图4)，说明上清液中的 rsIL-2Rα 与人 IL-2 呈特异性结合。
图 2 CHO 细胞培养上清液的 Western 免疫印迹杂交图谱
Fig 2 Western blotting of culture supernatant of CHO cells
, 百拇医药
A. #17 CHO cells; B. CHO cells transfected with mock vector; M. low molecular weight protein standard
图 3 rsIL-2Rα-ELISA 方法测定不同活性 IL-2 的结果
Fig 3 IL-2 activities determined by using rsIL-2Rα-ELISA method
A. development of ELISA， 1～6 IL-2 content in each well is 0, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 U respectively； B. standard curve of IL-2 activities； OD: optical density
, http://www.100md.com
图 4 抗 IL-2 抗体对以 rsIL-2Rα-ELISA 检测 IL-2 活性的标准曲线的影响
Fig 4 Effect of antibody against IL-2 on standard curve of IL-2 activities detected by rsIL-2Rα-ELISA
a: untreated IL-2; b: IL-2 pre-treated with normal goat serum IgG; c: IL-2 pre-treated with goat IgG anti-human IL-2
讨论
检测人外周血中 IL-2 水平是判断机体免疫状态的重要指标之一。经典的方法是通过测定 3H-TdR 在 IL-2 依赖细胞株 CTLL 中的掺入量来反映被测样品中具有生物活性的 IL-2 水平[5]。但是，此方法需用放射性同位素及细胞培养，操作较复杂，所需时间长；利用双抗体夹心原理建立的定量测定 IL-2 的 ELISA 方法所获得的结果不能反映样品中的 IL-2 是否具有结合 IL-2R 的活性[6]。虽然组成 IL-2R 的 3 种亚基中 α 亚基与 IL-2 的亲和力相对较低，但是，只有 α 亚基与 IL-2 呈特异性结合，它与 IL-2 的亲和力常数仍可达 10-8 mol/L。 因此，IL-2Rα 可被用于测定或纯化具有生物活性的 IL-2。 本实验依次采用基因重组及真核细胞转染技术、 G418 抗性筛选，获得了可分泌高活性 rsIL-2Rα 的 CHO 细胞株[2]。 本研究证实 rsIL-2Rα 基因已稳定整合到 #17 CHO 细胞株的基因组 DNA 中。在Southern印迹杂交中出现3条区带，这可能与rsIL-2Rα DNA 整合在不同部位的基因组DNA 中或 EcoR Ⅰ 酶解不完全有关。由于 rsIL-2Rα 分子的糖基化程度不同，因此，在 Western 免疫印迹实验中 #17 CHO 细胞分泌的 rsIL-2Rα 出现数条蛋白带。在检查特异性实验中，本研究还曾用包被了 #17 细胞株培养上清浓缩液的酶标板测定了经不同浓度山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 处理后的 IL-2，结果光密度(波长 490 nm) 随预反应体系中 IgG 的增加而递减(结果略)。因此，以上结果表明，本组制备的 rsIL-2Rα 能与人 IL-2 呈特异性结合。用此 rsIL-2Rα 建立的测定 IL-2 的 rELISA 方法，所得结果能直接反映被测样品中具有结合 IL-2R 活性的 IL-2 的水平，并用双盲法进行了验证(结果略)。有关采用 rsIL-2Rα 受体与抗体夹心 ELISA 方法测定 IL-2 水平，目前尚未见有类似的报道。
, http://www.100md.com
卫生部基金(94-1-0070)资助
程小款(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
杜洪震(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
张玉建(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
高军萍(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
衡凤燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
, 百拇医药 吴宁华(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
沈珝琲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
参考文献
1，Smith KA. The Interleukin-2 Receptor. Ann Rev Cell Biol, 1989, 5: 397-425
2，程小款，杜 恺，衡凤燕，等. 人分泌型白细胞介素-2受体α链基因克隆及其在真核细胞中的表达. 中国医学科学院学报， 1995， 17： 326-332
3，Sambrook J, Fritsh EF, Manaiatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. New York:Clod Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.16-9.17
, 百拇医药
4，Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76: 4350-4354
5，Gillis S, Ferm MM, OU W, et al. T cell growth factor: Parameters of procedure of production and a quantitative microassay for activity. 1978, 120: 2027-2032
6，Mosmann TR, Fong TAT. Specific assay for cytokine production by T cell. J Immunol Meth, 1989, 116: 151-158, 百拇医药
程小款 杜洪震 张玉建 高军萍 衡凤燕 吴宁华 沈珝琲
摘 要 目的 应用本组制备的白细胞介素2受体(IL-2R)，建立一种既安全又简便，并能定量检测白细胞介素2(IL-2)生物活性的方法。 方法 采用 Southern 印迹杂交方法，检测重组分泌型 IL-2Rα 亚基(rsIL-2Rα)基因在高效表达的转染细胞基因组中的稳定整合；以 Western 免疫印迹法测定 rsIL-2Rα 的相对分子质量，建立定量检测人 IL-2 生物活性的受体与抗体夹心酶联免疫吸附测定(rELISA)方法。 结果 (1) Southern 印迹分析表明，rsIL-2Rα 基因已稳定整合到高表达的转染 CHO 细胞基因组中； (2) rsIL-2Rα 的相对分子质量为 40 000 左右； (3) 应用建立的 rELISA 方法测定人 IL-2 标准溶液结果表明， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995)；预先将山羊抗人 IL-2 IgG 与 IL-2 保温后，所得标准曲线的斜率明显降低 (P<0.05)。 结论 与传统测定 IL-2 的方法相比，用 rsIL-2Rα 建立的受体-抗体夹心 rELISA 方法不仅具有准确、特异性强及操作简便的特点，而且，所得结果直接反映了被测样品中具有结合 IL-2R 活性的 IL-2 的水平。
, http://www.100md.com
关键词：分泌型人白细胞介素-2 受体α链 酶联免疫吸附法 白细胞介素-2
白细胞介素2受体(IL-2R)由 α、β 及 γ 3 种亚基组成，其中 β 亚基也是 IL-15 受体的组成成分，γ 亚基又是 IL-4、IL-7 及 IL-9 受体的组成成分，只有 α 亚基与 IL-2 呈特异性结合，其解离常数为 10-8 mol/L[1]。因此，制备重组分泌型 IL-2Rα 链 (rsIL-2Rα) 不仅对研究该蛋白的结构与功能有重要意义，而且，有助于用亲和层析方法纯化 IL-2 及测定人外周血及细胞培养上清中具有生物活性的 IL-2 的水平。本组采用基因工程技术、细胞转染及 G418 筛选建立了一株能分泌高活性 rsIL-2Rα 的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞株[2]。本实验对该株细胞中 rsIL-2Rα 基因的稳定整合状态及其表达产物的相对分子质量进行了鉴定，并应用 rsIL-2Rα 建立了定量检测具有生物活性的 IL-2 的受体与抗体夹心酶联免疫吸附法(rELISA)。
, 百拇医药
材料和方法
材料 限制性内切酶为 Boehringer Mannheim 公司产品，寡核苷酸标记试剂盒及 Oligolablling Kit 及低分子量蛋白标准(LWM)均为 Pharmacia 公司产品，[α-32P]dCTP(1.11×1014Bq/mmol)购自北京亚辉公司，尼龙膜及硝酸纤维膜为 Bio-Rad 公司产品，超滤器及滤膜 PM10 为 Amico 公司产品，DMEM 培养基、CHO-S-SFM Ⅱ 无血清培养基及 trypsin-EDTA 为 Gibco/BRL 公司产品。
质粒 pCMV/sIL-2R 及表达 rsIL-2Rα 的 #17 CHO 细胞株均为本组建立[2]，重组人 IL-2 (2000 U/μl) 为上海第二军医大学陈克明教授惠赠， IL-2 标准品购自北京市药品检定所，山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 为 R&D 公司产品，辣根过氧化物酶(HRP)标记驴抗山羊 IgG 购自北京中山生物制品有限公司，兔抗人 IL-2Rα 单克隆抗体及 HRP 标记羊抗兔 IgG 均购自北京华美生物工程公司，磷苯二胺(OPD)为北京芳草医药工业公司产品，二氨基联苯胺(DAB)为北京旭东制药厂产品，其它试剂均为国产分析纯。
, http://www.100md.com
CHO 细胞培养上清液的收集 将已在液氮中保存3年的、表达 rsIL-2Rα 的 #17 CHO 细胞株复苏后，先在含 400 μg/ml G418 的 DMEM 培养基中培养 10～14 d，再按 3×105 个/ml 细胞的密度在无血清培养基 CHO-S-SFM Ⅱ 中继续培养 72 h，离心收集上清，经超滤浓缩 60～100 倍，分装后-20℃保存。
探针的制备 质粒 pCMV/sIL-2R 经 Hind Ⅲ 酶切后，回收 0.8 kb sIL-2Rα cDNA 片段，按寡核苷酸标记试剂盒提供的方法用 [α-32P] dCTP 进行标记。
Southern 印迹杂交[3] 首先分别提取 #17 CHO 细胞及转染空载体的 CHO 细胞基因组 DNA，经 EcoR Ⅰ 水解后，以 0.7% 琼脂糖凝胶进行电泳，然后将 DNA 转移至尼龙膜上， 68℃ 预杂交 2 h，加入 sIL-2Rα cDNA 探针 (740 Bq/ml)，杂交过夜，再依次用 6×SSC-0.5% SDS、1×SSC-0.5% SDS 及 0.1×SSC-0.5% SDS 洗膜后，进行放射自显影。
, 百拇医药
Western 免疫印迹[4] 30 μl 细胞培养上清浓缩液经 12.6% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分离的蛋白转至硝酸纤维膜上。 LMW 蛋白标准用氨基黑染色，样品蛋白经含 5% 脱脂奶粉的 TBS (0.9% NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4) 在 4℃ 封闭，放置过夜或室温放置 2 h 后，以 TBS 洗 3 次(每次 10 min)；再与 1∶40 兔抗人 IL-2Rα 抗体在 37℃ 反应 2 h， TBS 洗 3次后，用 1∶50 HRP 标记的羊抗兔 IgG 反应 1～2 h，再以 TBS 洗 3 次；加 DAB 显色液，室温反应 2～3 min 后观察结果。
rELISA 方法检测 IL-2 的活性 向酶标板孔内加 20 μl CHO 细胞培养上清浓缩液和 80 μl 0.05 mol/L 碳酸缓冲液 (pH 9.6)， 4℃ 包被过夜；弃包被液后，再加 200 μl 1% BSA 的 PBS 缓冲液，在 37℃ 放置 2 h后，用 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液(PBS-T)洗 3 次(每次 5 min)，然后加 IL-2 标准品或待测样品后，放置 37℃ 2 h 或 4℃ 过夜；再用 PBS-T 洗 3 次，加 100 μl 1∶200 山羊抗人 IL-2 IgG，在 37℃ 反应 2 h， PBS-T 洗 3 次；加 100 μl 1∶500 HRP 标记驴抗山羊 IgG， 37℃ 反应 1～2 h，PBS-T 洗 3 次后，加 100 μl OPD 显色液，避光室温反应 10～15 min，加 50 μl 2 mol/L H2SO4 终止反应后测定光密度(波长 490 nm)。 在特异性抑制实验中，预先将 2000 U IL-2 分别与 10 μg 山羊抗人 IL-2 IgG 及正常山羊血清 IgG 在 37℃ 保温 30 min，稀释成不同浓度，再按上述步骤进行测定。每次每份样品均作双份测定。
, http://www.100md.com
结果
rsIL-2Rα 基因在 CHO 细胞中的稳定整合 Southern 印迹分析显示，经 EcoR Ⅰ 酶切后的 #17 CHO 细胞株 DNA 在 2.3～4.3 kb 之间呈现 3～4 条杂交带，表明 rsIL-2Rα 基因已稳定整合到该细胞株的基因组中(图1)。
图 1 CHO 细胞基因组 DNA 与 [α-32P] dCTP 标记的rIL-2Rα 基因的
Southern 印迹杂交图谱
Fig 1 Southern blotting of genomic DNA of CHO cells probed by [α-32P]
, http://www.100md.com
dCTP-labeled rIL-2Rα cDNA
A. 0.7% agarose gel electrophoresis; B. Southern blot hybridization;
M. λDNA/Hind Ⅲ P. #17 CHO cells; C. CHO cells transfected with mock vector
rsIL-2R 的相对分子质量 Western 免疫印迹显示，#17CHO 细胞培养上清液在相对分子质量 40 000 处出现数条结合带，而转染空载体的细胞上清则未见相应结合带(图2)。
rsIL-2Rα 与 IL-2 结合活性的鉴定 采用 rELISA 方法检测含有不同活性单位的人 IL-2 标准溶液，结果显示， IL-2 的标准曲线范围为 31.25～500.00 U (r=0.9995) (图3)，表明 #17 细胞株培养上清液具有结合人 IL-2 的生物活性。转染空载体的细胞株培养上清液不能与 IL-2 结合(结果略)。
, http://www.100md.com
rsIL-2Rα 与 IL-2 结合特异性 预先将 IL-2 与山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 保温后，再与包被了 #17 细胞株培养上清浓缩液的酶标板进行 rELISA 测定。结果测得的标准曲线的斜率明显小于未经抗体处理的 IL-2 的标准曲线 (P<0.05)，而培养上清液与经正常山羊血清 IgG 处理的 IL-2 的结合活性的差异无统计学意义(P>0.1)(图4)，说明上清液中的 rsIL-2Rα 与人 IL-2 呈特异性结合。
图 2 CHO 细胞培养上清液的 Western 免疫印迹杂交图谱
Fig 2 Western blotting of culture supernatant of CHO cells
, 百拇医药
A. #17 CHO cells; B. CHO cells transfected with mock vector; M. low molecular weight protein standard
图 3 rsIL-2Rα-ELISA 方法测定不同活性 IL-2 的结果
Fig 3 IL-2 activities determined by using rsIL-2Rα-ELISA method
A. development of ELISA， 1～6 IL-2 content in each well is 0, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 U respectively； B. standard curve of IL-2 activities； OD: optical density
, http://www.100md.com
图 4 抗 IL-2 抗体对以 rsIL-2Rα-ELISA 检测 IL-2 活性的标准曲线的影响
Fig 4 Effect of antibody against IL-2 on standard curve of IL-2 activities detected by rsIL-2Rα-ELISA
a: untreated IL-2; b: IL-2 pre-treated with normal goat serum IgG; c: IL-2 pre-treated with goat IgG anti-human IL-2
讨论
检测人外周血中 IL-2 水平是判断机体免疫状态的重要指标之一。经典的方法是通过测定 3H-TdR 在 IL-2 依赖细胞株 CTLL 中的掺入量来反映被测样品中具有生物活性的 IL-2 水平[5]。但是，此方法需用放射性同位素及细胞培养，操作较复杂，所需时间长；利用双抗体夹心原理建立的定量测定 IL-2 的 ELISA 方法所获得的结果不能反映样品中的 IL-2 是否具有结合 IL-2R 的活性[6]。虽然组成 IL-2R 的 3 种亚基中 α 亚基与 IL-2 的亲和力相对较低，但是，只有 α 亚基与 IL-2 呈特异性结合，它与 IL-2 的亲和力常数仍可达 10-8 mol/L。 因此，IL-2Rα 可被用于测定或纯化具有生物活性的 IL-2。 本实验依次采用基因重组及真核细胞转染技术、 G418 抗性筛选，获得了可分泌高活性 rsIL-2Rα 的 CHO 细胞株[2]。 本研究证实 rsIL-2Rα 基因已稳定整合到 #17 CHO 细胞株的基因组 DNA 中。在Southern印迹杂交中出现3条区带，这可能与rsIL-2Rα DNA 整合在不同部位的基因组DNA 中或 EcoR Ⅰ 酶解不完全有关。由于 rsIL-2Rα 分子的糖基化程度不同，因此，在 Western 免疫印迹实验中 #17 CHO 细胞分泌的 rsIL-2Rα 出现数条蛋白带。在检查特异性实验中，本研究还曾用包被了 #17 细胞株培养上清浓缩液的酶标板测定了经不同浓度山羊抗人 IL-2 多克隆抗体 IgG 处理后的 IL-2，结果光密度(波长 490 nm) 随预反应体系中 IgG 的增加而递减(结果略)。因此，以上结果表明，本组制备的 rsIL-2Rα 能与人 IL-2 呈特异性结合。用此 rsIL-2Rα 建立的测定 IL-2 的 rELISA 方法，所得结果能直接反映被测样品中具有结合 IL-2R 活性的 IL-2 的水平，并用双盲法进行了验证(结果略)。有关采用 rsIL-2Rα 受体与抗体夹心 ELISA 方法测定 IL-2 水平，目前尚未见有类似的报道。
, http://www.100md.com
卫生部基金(94-1-0070)资助
程小款(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
杜洪震(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
张玉建(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
高军萍(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
衡凤燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
, 百拇医药 吴宁华(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
沈珝琲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)
参考文献
1，Smith KA. The Interleukin-2 Receptor. Ann Rev Cell Biol, 1989, 5: 397-425
2，程小款，杜 恺，衡凤燕，等. 人分泌型白细胞介素-2受体α链基因克隆及其在真核细胞中的表达. 中国医学科学院学报， 1995， 17： 326-332
3，Sambrook J, Fritsh EF, Manaiatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. New York:Clod Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.16-9.17
, 百拇医药
4，Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76: 4350-4354
5，Gillis S, Ferm MM, OU W, et al. T cell growth factor: Parameters of procedure of production and a quantitative microassay for activity. 1978, 120: 2027-2032
6，Mosmann TR, Fong TAT. Specific assay for cytokine production by T cell. J Immunol Meth, 1989, 116: 151-158, 百拇医药