槲皮素对博莱霉素致鼠肺纤维化的防治作用
王昌明 黄慧 张珍祥 莫碧文 白晶 曾锦荣 蒋述科 任格 王绩英
摘 要 目的 观察SD大白鼠腹腔内注射槲皮素(200 mg.kg-1)对实验性博莱霉素致肺纤维化的防治作用。方法 通过博莱霉素(5 mg.kg-1)致鼠肺纤维化的动物模型，动态观察各实验组与肺纤维化形成相关的d 3、d 7、d 14、d 28肺组织匀浆内羟脯氨酸、脂质过氧化物(LPO)含量，动态观察肺组织病理学变化及形态学定量测量肺组织中炎症组织数/每高倍视野、肺泡间隔宽度、单位面积肺纤维化灶所占的分面积。结果 与对照组相比，槲皮素组能显著地降低博莱霉素致肺纤维化程度。结论 槲皮素对博莱霉素致肺纤维化有一定的防治作用。
关键词：博莱霉素 槲皮素 肺纤维化
博莱霉素(bleomycin, BLM)是多肽类抗肿瘤药，单次气管内注射可复制出与人肺间质性疾病相似的动物模型[1]，但其发病机制迄今未明。为此我们观察了腹腔内注入槲皮素(quercetin)对BLM所致SD大白鼠肺间质纤维化实验及病理改变的影响，为肺纤维化的防治提供新的治疗手段。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器 博莱霉素A5(平阳霉素，天津河北制药厂)，槲皮素(Sigma产品)，TBA(上海试剂三厂)，四乙氧基丙烷(TEP Aldrich公司)，L-羟脯氨酸(Sigma产品)，ASM68K图像分析系统(德国Leite公司)，721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.2 动物分组与处理方法 体重200～250 g左右SD大白鼠120只，♀♂不拘，随机分组。(1)单纯BLM组(40只)：气管内一次性注入博莱霉素A5(5 mg.kg-1)，随后每只每天腹腔注入生理盐水1 ml，共28 d。(2)quercetin 组(BLM+quercetin，40只)：气管内一次性注入博莱霉素A5(5 mg.kg-1)，随后每只每天腹腔内注射quercetin(200 mg.kg-1)，共28 d。(3)对照组(40只)：气管内一次性注入生理盐水0.2～0.3 ml，随后每只每天腹腔内注射生理盐水1 ml。以上动物分别在注射BLM后d 3、d 7、d 14、d 28天处死(每次每组10只)。
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1.3 方法
1.3.1 动物模型的复制 乙醚全身麻醉后仰卧位固定于大鼠实验台上，将舌拉出，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速将连于1 ml注射器的平端9号针插入气管约4～5 cm，缓慢注入药物，随后将动物直立旋转，尽量使药液在肺内分布均匀，对照组以同样方法注入生理盐水0.2～0.3 ml。
1.3.2 病理标本取材及处理 异丙巴比妥钠(80 mg.kg-1)腹腔注射，麻醉后开胸，结扎左支气管，取左肺备生化测定。自气管向右肺注射体积分数为0.1福尔马林液，内固定1 wk，常规石蜡切片(5 μm)染色。
1.4 观察指标及测定方法
1.4.1 肺组织匀浆脂质过氧化物(LPO)测定(以MDA nmol.g-1肺组织表示) 以1 g肺组织加4 ml生理盐水制成匀浆，参考Ohkawa法[2]，肺组织匀浆0.2 ml加0.28 mol .L-1 SDS 0.2 ml，加3.33 mol.L-1冰乙酸(pH调至3.5)1.5 ml，0.05 mol.L-1 TBA 1.5 ml，双蒸水0.6 ml，混合沸水浴1 h，再加双蒸水1 ml，正丁醇吡啶混合液5 ml，振荡后离心3 500 r.min-1×15 min，取上清液于721型分光光度计532 nm处比色。标准管加入应用液0.2 ml，余操作同上，含量以MDA nmol.g-1肺组织表示。
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1.4.2 肺组织匀浆羟脯氨酸测定 参考Woessners法[3]，稍修改，按1 g肺组织加4 ml生理盐水比例制成匀浆，吸取1 ml匀浆加4 ml 6 mol.L-1 HCl置烘箱内14 h取出，以6 mol.L-1 NaOH中和调至pH 7.0，离心2 000 r.min-1×10 min，取上清液加0.05 mol.L-1 CuSO4 ，2.50 mol.L-1 NaOH各0.5 ml混匀，加1.76 mol.L-1 H2O2 0.5 ml于30℃水浴中10 min，之后加无水乙醇0.5 ml，置30℃水浴中20 min，加6 mol.L-1 HCl及对甲基氨基苯甲醛各1 ml，于70℃中8 min，冷却后于721型分光光度计560 nm处比色，含量以mg.g-1肺组织表示。
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1.4.3 肺组织形态定量观察 每高倍视野(HE×400倍)炎性细胞数：每张切片观察10个视野取平均值。平均肺泡间隔宽度(μm):用尺型显微测微器测定肺泡间隔宽度，每张切片测3个视野，取平均值。单位面积上纤维化灶所占的分面积，在HE×100倍下每张切片观察10 个视野,在ASM 68K图像分析仪上测得单位面积上纤维化灶所占的分面积。
2 结果
2.1 各组肺组织匀浆LPO含量变化 由图1，可见单纯BLM组d 3 LPO开始显著升高，d 7达高峰，以后下降，d 28接近正常。quercetin组各组(除d28)MDA含量均较BLM组显著降低，但仍高于正常对照组。
Fig 1 The comparison of LPOS level in
experimental group (X±s, n=10)
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◆—◆：control group； □—□：BLM group；△—△：quercetin group
2.2 各组肺组织匀浆羟脯氨酸含量的变化 由图2可见单纯BLM组d 7羟脯氨酸开始升高，d 28达高峰，而quercetin组同期较单纯BLM组明显降低，但仍高于对照组。
Fig 2 The comparison of hydroxyprolines level
in experimental group (X±s, n=10)
◆—◆：control group；□—□：BLM group；△—△：quercetin group
2.3 病理学变化及形态学定量观察 对照组肺内结构正常，BLM组d 3可见肺泡间隔水肿，炎性细胞浸润，以单核巨噬细胞及中性粒细胞为主，肺泡内亦见少许炎性细胞渗出，d 7肺泡炎扩大，肺间隔内成纤维细胞和毛细血管增生，并出现梭形细胞，胶原基质明显增多，d 28可见肺间质纤维瘢痕形成，而quercetin组同期病变明显减轻，形态学定量观察见表1。
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Tab 1 Index of histology quantitation measure in experimental groups (X±s, n=10)
Inflammtory cell
numbers/HP
Mean widths of alvolar septa
Percentage areas of
pulmonary fibrous scars
3 d
7 d
14 d
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28 d
Control groups
1.50±0.30
1.50±0.30
BLM groups
263±55**
4.21±0.44**
5.21±0.39**
0.71±0.16**
Quercetin groups
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132±19
2.50±0.22△△
3.99±0.44△△
0.31±0.19
**P<0.01 vs quercetin group; △△P<0.01 vs control group
3 讨论
BLM致肺纤维化机制迄今未明，目前的看法包括：①自由基损伤机制；②免疫机制(包括炎症细胞及炎症介质)；③胶原调节失衡。本实验在气管内一次性注射BLM后，d 3肺组织中MDA含量开始上升，d 7达高峰，以后逐渐下降，d 28接近正常；羟脯氨酸d 7开始升高，d 28达高峰，组织病理学d 3～d 7表现为急性损伤性肺泡炎，与MDA高峰期一致，d 28天肺纤维化瘢痕灶形成时，羟脯氨酸达高峰。
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已知BLM在氧分子和铁离子存在下产生活性氧自由基[4]，活性氧不但可引起急性损伤性肺泡炎，还可致DNA解链，同时诱发肺组织产生LPO，使生物膜功能丧失。活性氧可增加磷酸脂酶A2活性，增加花生四烯酸代谢产物的合成，扩大炎症反应，导致肺泡腔内大量以中性粒细胞及单核细胞为主的炎性细胞浸润，其中肺泡巨噬细胞(AM)在肺纤维化中的作用尤为关键。活化的AM能释放许多强有力的促成纤维细胞活化增殖的因子如白介素1(IL-1)，肿瘤坏死因子-a(TNFa)，血小板衍生生长因子(PDGF)等，其中PDGF对成纤维细胞活化增殖具有重要作用[5]，而成纤维细胞又是肺内胶原合成的主要细胞[6]。胶原的沉积是肺纤维化的重要标志，可以用羟脯氨酸的含量来反映。quercetin组其MDA、羟脯氨酸的含量均较同期BLM组低，其各期病变也较BLM组明显减轻，说明quercetin对肺纤维化有一定的防治作用。
quercetin属黄酮类物，其防治肺纤维化作用机制可能包括：①抗自由基损伤作用: quercetin具有清除自由基及膜稳定作用[7]；②抑制成纤维细胞活化、增殖[8]，进而抑制胶原的合成。由于quercetin是酪氨酸蛋白激酶(TPK)特异性抑制剂[8]，通过抑制TPK而使PDGF等生长因子不能与细胞膜受体结合，从而不能调节成纤维细胞增殖。③抑制花生四烯酸的释放[9]：花生四烯酸产物如LTs可直接刺激白细胞产生超氧化物[10]，而白细胞释放的氧自由基在补体参与下可致急性肺损伤，另外LTs也可刺激成纤维细胞增殖。总之我们的结果表示：quercetin可从多种途径抑制肺纤维化的发生，quercetin对BLM致肺纤维化具有防治作用。
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*广西壮族自治区卫生厅青年基金课题，No Q9802
作者简介：王昌明，男，36岁，博士，副教授，主要研究方向为肺纤维化及肺动脉高压；
黄 慧，女，49岁，教授，曾赴澳大利亚研修
王昌明(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
黄慧(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
张珍祥(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
莫碧文(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
白晶(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
, 百拇医药
曾锦荣(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
蒋述科(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
任格(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
王绩英(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
参考文献
1，Clark JG. BLM-induced pulmonary fibrosis in hamster. J Clin Invest, 1983;72: 2082～8
2，Ohkawa H. Assay for Lipid peroxides in animal tissue by thiobarbituic acid reaction. Anal Biochem, 1979;95:351～6
, http://www.100md.com
3，Woessner JF. The determination of hydroxyproline in tissues and protein sample containing small proportion of this amino acid. Arch Bioch, 1961;93:440～9
4，Sausville A. Effect of chelating agents and metal ions the degradation of DNA by BLM. Biochemistry, 1978; 17: 2740～52
5，Antoniades HN, Bravo MA, Rafael AE et al. Platelet-derived growth factor in idopathic pulmonary fibrosis. J Clin Invest, 1990; 86: 1055～62
, 百拇医药
6，Sheppard MN, Harrison NK. Lung injury, inflammatory mediators and fibroblast activation in fibrosing alvelolitis. Thorax, 1992; 47: 1064～74
7，Negre SA, Salvayer R. Quercetin prevent the cytotoxicity of oxidized LDL on lymphoid cell lines. Free Red Biol Med, 1992; 12: 101～6
8，Levitxki A, Gazit A. Tyrosine Kinase inhibition: An approach to drug development. Science, 1995; 267: 1782～7
9，Hirasawa N, Santin F, Beaven MA. Activation of the mitogen activated protein kinase / cytosolic phospholipase A2 pathway in a rat mast cell line. J Immunol, 1995; 154: 5391～402
10，Sumimot H. Superoxide productionofhuman polymorphonu-clear leukocytes stimulated by leukotriene B. Biochi-Biophys-Acta, 1984;803: 271～8, 百拇医药
摘 要 目的 观察SD大白鼠腹腔内注射槲皮素(200 mg.kg-1)对实验性博莱霉素致肺纤维化的防治作用。方法 通过博莱霉素(5 mg.kg-1)致鼠肺纤维化的动物模型，动态观察各实验组与肺纤维化形成相关的d 3、d 7、d 14、d 28肺组织匀浆内羟脯氨酸、脂质过氧化物(LPO)含量，动态观察肺组织病理学变化及形态学定量测量肺组织中炎症组织数/每高倍视野、肺泡间隔宽度、单位面积肺纤维化灶所占的分面积。结果 与对照组相比，槲皮素组能显著地降低博莱霉素致肺纤维化程度。结论 槲皮素对博莱霉素致肺纤维化有一定的防治作用。
关键词：博莱霉素 槲皮素 肺纤维化
博莱霉素(bleomycin, BLM)是多肽类抗肿瘤药，单次气管内注射可复制出与人肺间质性疾病相似的动物模型[1]，但其发病机制迄今未明。为此我们观察了腹腔内注入槲皮素(quercetin)对BLM所致SD大白鼠肺间质纤维化实验及病理改变的影响，为肺纤维化的防治提供新的治疗手段。
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1 材料与方法
1.1 试剂及仪器 博莱霉素A5(平阳霉素，天津河北制药厂)，槲皮素(Sigma产品)，TBA(上海试剂三厂)，四乙氧基丙烷(TEP Aldrich公司)，L-羟脯氨酸(Sigma产品)，ASM68K图像分析系统(德国Leite公司)，721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.2 动物分组与处理方法 体重200～250 g左右SD大白鼠120只，♀♂不拘，随机分组。(1)单纯BLM组(40只)：气管内一次性注入博莱霉素A5(5 mg.kg-1)，随后每只每天腹腔注入生理盐水1 ml，共28 d。(2)quercetin 组(BLM+quercetin，40只)：气管内一次性注入博莱霉素A5(5 mg.kg-1)，随后每只每天腹腔内注射quercetin(200 mg.kg-1)，共28 d。(3)对照组(40只)：气管内一次性注入生理盐水0.2～0.3 ml，随后每只每天腹腔内注射生理盐水1 ml。以上动物分别在注射BLM后d 3、d 7、d 14、d 28天处死(每次每组10只)。
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1.3 方法
1.3.1 动物模型的复制 乙醚全身麻醉后仰卧位固定于大鼠实验台上，将舌拉出，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速将连于1 ml注射器的平端9号针插入气管约4～5 cm，缓慢注入药物，随后将动物直立旋转，尽量使药液在肺内分布均匀，对照组以同样方法注入生理盐水0.2～0.3 ml。
1.3.2 病理标本取材及处理 异丙巴比妥钠(80 mg.kg-1)腹腔注射，麻醉后开胸，结扎左支气管，取左肺备生化测定。自气管向右肺注射体积分数为0.1福尔马林液，内固定1 wk，常规石蜡切片(5 μm)染色。
1.4 观察指标及测定方法
1.4.1 肺组织匀浆脂质过氧化物(LPO)测定(以MDA nmol.g-1肺组织表示) 以1 g肺组织加4 ml生理盐水制成匀浆，参考Ohkawa法[2]，肺组织匀浆0.2 ml加0.28 mol .L-1 SDS 0.2 ml，加3.33 mol.L-1冰乙酸(pH调至3.5)1.5 ml，0.05 mol.L-1 TBA 1.5 ml，双蒸水0.6 ml，混合沸水浴1 h，再加双蒸水1 ml，正丁醇吡啶混合液5 ml，振荡后离心3 500 r.min-1×15 min，取上清液于721型分光光度计532 nm处比色。标准管加入应用液0.2 ml，余操作同上，含量以MDA nmol.g-1肺组织表示。
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1.4.2 肺组织匀浆羟脯氨酸测定 参考Woessners法[3]，稍修改，按1 g肺组织加4 ml生理盐水比例制成匀浆，吸取1 ml匀浆加4 ml 6 mol.L-1 HCl置烘箱内14 h取出，以6 mol.L-1 NaOH中和调至pH 7.0，离心2 000 r.min-1×10 min，取上清液加0.05 mol.L-1 CuSO4 ，2.50 mol.L-1 NaOH各0.5 ml混匀，加1.76 mol.L-1 H2O2 0.5 ml于30℃水浴中10 min，之后加无水乙醇0.5 ml，置30℃水浴中20 min，加6 mol.L-1 HCl及对甲基氨基苯甲醛各1 ml，于70℃中8 min，冷却后于721型分光光度计560 nm处比色，含量以mg.g-1肺组织表示。
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1.4.3 肺组织形态定量观察 每高倍视野(HE×400倍)炎性细胞数：每张切片观察10个视野取平均值。平均肺泡间隔宽度(μm):用尺型显微测微器测定肺泡间隔宽度，每张切片测3个视野，取平均值。单位面积上纤维化灶所占的分面积，在HE×100倍下每张切片观察10 个视野,在ASM 68K图像分析仪上测得单位面积上纤维化灶所占的分面积。
2 结果
2.1 各组肺组织匀浆LPO含量变化 由图1，可见单纯BLM组d 3 LPO开始显著升高，d 7达高峰，以后下降，d 28接近正常。quercetin组各组(除d28)MDA含量均较BLM组显著降低，但仍高于正常对照组。
Fig 1 The comparison of LPOS level in
experimental group (X±s, n=10)
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◆—◆：control group； □—□：BLM group；△—△：quercetin group
2.2 各组肺组织匀浆羟脯氨酸含量的变化 由图2可见单纯BLM组d 7羟脯氨酸开始升高，d 28达高峰，而quercetin组同期较单纯BLM组明显降低，但仍高于对照组。
Fig 2 The comparison of hydroxyprolines level
in experimental group (X±s, n=10)
◆—◆：control group；□—□：BLM group；△—△：quercetin group
2.3 病理学变化及形态学定量观察 对照组肺内结构正常，BLM组d 3可见肺泡间隔水肿，炎性细胞浸润，以单核巨噬细胞及中性粒细胞为主，肺泡内亦见少许炎性细胞渗出，d 7肺泡炎扩大，肺间隔内成纤维细胞和毛细血管增生，并出现梭形细胞，胶原基质明显增多，d 28可见肺间质纤维瘢痕形成，而quercetin组同期病变明显减轻，形态学定量观察见表1。
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Tab 1 Index of histology quantitation measure in experimental groups (X±s, n=10)
Inflammtory cell
numbers/HP
Mean widths of alvolar septa
Percentage areas of
pulmonary fibrous scars
3 d
7 d
14 d
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28 d
Control groups
1.50±0.30
1.50±0.30
BLM groups
263±55**
4.21±0.44**
5.21±0.39**
0.71±0.16**
Quercetin groups
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132±19
2.50±0.22△△
3.99±0.44△△
0.31±0.19
**P<0.01 vs quercetin group; △△P<0.01 vs control group
3 讨论
BLM致肺纤维化机制迄今未明，目前的看法包括：①自由基损伤机制；②免疫机制(包括炎症细胞及炎症介质)；③胶原调节失衡。本实验在气管内一次性注射BLM后，d 3肺组织中MDA含量开始上升，d 7达高峰，以后逐渐下降，d 28接近正常；羟脯氨酸d 7开始升高，d 28达高峰，组织病理学d 3～d 7表现为急性损伤性肺泡炎，与MDA高峰期一致，d 28天肺纤维化瘢痕灶形成时，羟脯氨酸达高峰。
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已知BLM在氧分子和铁离子存在下产生活性氧自由基[4]，活性氧不但可引起急性损伤性肺泡炎，还可致DNA解链，同时诱发肺组织产生LPO，使生物膜功能丧失。活性氧可增加磷酸脂酶A2活性，增加花生四烯酸代谢产物的合成，扩大炎症反应，导致肺泡腔内大量以中性粒细胞及单核细胞为主的炎性细胞浸润，其中肺泡巨噬细胞(AM)在肺纤维化中的作用尤为关键。活化的AM能释放许多强有力的促成纤维细胞活化增殖的因子如白介素1(IL-1)，肿瘤坏死因子-a(TNFa)，血小板衍生生长因子(PDGF)等，其中PDGF对成纤维细胞活化增殖具有重要作用[5]，而成纤维细胞又是肺内胶原合成的主要细胞[6]。胶原的沉积是肺纤维化的重要标志，可以用羟脯氨酸的含量来反映。quercetin组其MDA、羟脯氨酸的含量均较同期BLM组低，其各期病变也较BLM组明显减轻，说明quercetin对肺纤维化有一定的防治作用。
quercetin属黄酮类物，其防治肺纤维化作用机制可能包括：①抗自由基损伤作用: quercetin具有清除自由基及膜稳定作用[7]；②抑制成纤维细胞活化、增殖[8]，进而抑制胶原的合成。由于quercetin是酪氨酸蛋白激酶(TPK)特异性抑制剂[8]，通过抑制TPK而使PDGF等生长因子不能与细胞膜受体结合，从而不能调节成纤维细胞增殖。③抑制花生四烯酸的释放[9]：花生四烯酸产物如LTs可直接刺激白细胞产生超氧化物[10]，而白细胞释放的氧自由基在补体参与下可致急性肺损伤，另外LTs也可刺激成纤维细胞增殖。总之我们的结果表示：quercetin可从多种途径抑制肺纤维化的发生，quercetin对BLM致肺纤维化具有防治作用。
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*广西壮族自治区卫生厅青年基金课题，No Q9802
作者简介：王昌明，男，36岁，博士，副教授，主要研究方向为肺纤维化及肺动脉高压；
黄 慧，女，49岁，教授，曾赴澳大利亚研修
王昌明(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
黄慧(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
张珍祥(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
莫碧文(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
白晶(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
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曾锦荣(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
蒋述科(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
任格(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
王绩英(广西桂林医学院附属医院呼吸内科，桂林 541001)
参考文献
1，Clark JG. BLM-induced pulmonary fibrosis in hamster. J Clin Invest, 1983;72: 2082～8
2，Ohkawa H. Assay for Lipid peroxides in animal tissue by thiobarbituic acid reaction. Anal Biochem, 1979;95:351～6
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3，Woessner JF. The determination of hydroxyproline in tissues and protein sample containing small proportion of this amino acid. Arch Bioch, 1961;93:440～9
4，Sausville A. Effect of chelating agents and metal ions the degradation of DNA by BLM. Biochemistry, 1978; 17: 2740～52
5，Antoniades HN, Bravo MA, Rafael AE et al. Platelet-derived growth factor in idopathic pulmonary fibrosis. J Clin Invest, 1990; 86: 1055～62
, 百拇医药
6，Sheppard MN, Harrison NK. Lung injury, inflammatory mediators and fibroblast activation in fibrosing alvelolitis. Thorax, 1992; 47: 1064～74
7，Negre SA, Salvayer R. Quercetin prevent the cytotoxicity of oxidized LDL on lymphoid cell lines. Free Red Biol Med, 1992; 12: 101～6
8，Levitxki A, Gazit A. Tyrosine Kinase inhibition: An approach to drug development. Science, 1995; 267: 1782～7
9，Hirasawa N, Santin F, Beaven MA. Activation of the mitogen activated protein kinase / cytosolic phospholipase A2 pathway in a rat mast cell line. J Immunol, 1995; 154: 5391～402
10，Sumimot H. Superoxide productionofhuman polymorphonu-clear leukocytes stimulated by leukotriene B. Biochi-Biophys-Acta, 1984;803: 271～8, 百拇医药