雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用及其作用机制
雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用及其作用机制
王岚 叶惟三 惠玲 刘霄 郭燕
摘 要 目的 研究雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用机制。方法 用雷公藤内酯酮200 μg/(kg.d)喂服Wistar大鼠，8周后取材。做大鼠睾丸精子计数、精子活动度、睾丸切片的形态学观察，精核蛋白提取以及基因cyclin D1和Cdk4 mRNA的原位杂交实验。 结果 实验组大鼠睾丸精子数量为(26.43±3.90)×106/g，比对照组大鼠的精子计数(41.15±5.51)×106/g明显降低(P<0.01)，精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P<0.001)；cyclin D1和Cdk4基因表达在精子细胞中显著上升。结论 雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用显著，作用机制可能主要是增加精子细胞cyclin D1和Cdk4基因的表达，抑制附睾精核蛋白的生物合成。
, 百拇医药
关键词：雷公藤内酯酮 雄性抗受精作用 cyclin D1 Cdk4 精核蛋白
近年来，药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii hook f，TW) 的男性抗生育作用受到国际社会的广泛关注，但其抗生育活性与抗炎、免疫抑制活性的不可分割却是一个重要缺陷[1，2]。雷公藤的化学成分复杂，目前已从其中筛选、分离出7种单体，其中免疫抑制活性最低的是雷公藤内酯酮(triptonide)[3]。本研究主要目的是对雷公藤内酯酮的抗生育作用机制进行探讨。
材料和方法
药品与试剂 雷公藤内酯酮由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠；含基因 cyclin D1 的载体质粒pGEM4，基因Cdk4的载体质粒SK，由美国冷泉港分子生物学实验室David Beach 博士惠赠；RNA 合成酶SP6、T3，内切酶 E.coRⅠ、SmaⅠ 购自 Promega 公司；地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim 公司。
, 百拇医药
动物 健康雄性 Wistar 大鼠共10只，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，体重为(190±10)g，分为两组，每组5只。Ⅰ组为雷公藤内酯酮实验组，雷公藤内酯酮用1%的二甲基亚砜(DMSO)配制，给药剂量为200 μg/(kg*d)。Ⅱ组为空白对照组，喂服1%的 DMSO，剂量为2 ml/(kg*d)。每周一称1次体重，根据体重调整喂药量，喂药8周后取材。雷公藤内酯酮组大鼠的合笼实验，已由江苏省计划生育研究所完成，结果见参考文献[1]。
大鼠体重及生殖器官的重量 记录大鼠每周体重增加量，取材时分别称取大鼠睾丸、附睾、精囊腺的重量。
雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响 (1)睾丸内精子计数：约取四分之一睾丸称重，加蒸馏水研磨成浆，总量为1 ml。超声处理，计数每克组织所含的精子头部数目；(2)附睾精子活动度：取大鼠的双侧附睾，于生理盐水中剪碎，静置5 min，涂片计数300个精子中活动精子所占比例；(3)附睾精子银染[4]：油镜下，随机计数200个精子，按形态分为4个等级：A.正常；B.精子头部异常；C.精子尾部轴丝分离或断裂；D.精子头颈分离；(4)睾丸组织切片：睾丸组织在Bouin氏固定液中固定，石蜡切片(片厚6 μm)，PAS染色。按照Russell等[5]方法识别睾丸曲细精管14期，计数睾丸切片曲细精管第Ⅶ-Ⅷ期中的150个不同生精细胞(精原细胞、前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞)与支持细胞的比例，支持细胞以看清核仁为准。
, http://www.100md.com
附睾精核蛋白的提取 Fei法提取总碱性核蛋白(TNBP)[6]，然后用Panyim法[7]，在酸性-尿素系统中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为20%，结果拍成黑白照片进行灰度扫描，测得各蛋白条带的相对数值。
细胞周期蛋白基因cyclin D1、Cdk4表达mRNA的原位杂交 (1)cRNA探针的制备：将含该基因的载体质粒pGEM4、SK cDNA用相应的限制性内切酶E.coRⅠ、SmaⅠ线性化，纯化；用RNA合成酶SP6、T3合成反义的RNA探针；按照地高辛标记和检测试剂盒提供的方法进行标记；(2)原位杂交：按文献[8]方法；(3)阴性组织对照：在实验条件完全相同的情况下，检测正常肌肉组织上述基因的表达；(4)阴性探针对照：在相同的实验条件下，以杂交液中不加cRNA探针和以正义cRNA探针代替反义cRNA探针，分别在曲细精管生精上皮和肌肉组织中检测上述基因的表达；结果拍照进行灰度扫描，测定管腔不同区域标记颜色的相对数值。
, http://www.100md.com
心肝肾的形态学观察 (1)心肝肾组织琥珀酸脱氢酶组化反应，阳性反应为出现蓝紫色的颗粒沉淀；心肝肾组织ATP酶的组化反应，阳性反应为出现棕色颗粒沉淀；(2)取部分心肝肾组织Bouin固定，石蜡包埋切片，HE、PAS染色，光镜观察。
统计学处理 实验结果以平均值±标准差(X±s)表示，组间比较用t检验。
结 果
大鼠体重及生殖器官的重量变化 喂药8周后，对照组大鼠和实验组大鼠的睾丸、附睾和精囊腺重量无明显差别(P>0.05)。整个实验进程中，两组体重均无明显差别。
雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响 (1)精子计数：实验组大鼠的精子计数为(26.43±3.90)×106/g，比对照组大鼠(41.15±5.51)×106/g明显降低(P<0.01)；(2)附睾精子活力：实验组大鼠的精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P<0.001)；(3)精子银染：实验组精子头颈分离的比例为(49.4±9.6)%，较对照组(19.0±5.2)%显著增多(P<0.05)；(4)睾丸切片PAS反应：实验组和对照组都存在着正常的各阶段的不同组织和细胞，如血管、淋巴管、间质细胞和结缔组织细胞。实验组有第Ⅸ期精子的延迟释放现象，还可见空泡和细胞脱落，但数目不多。圆形精子细胞与支持细胞的比例实验组为(9.15±0.33)，比对照组(10.73±0.38)极显著下降(P<0.001)，其它生精细胞的比例正常。
, http://www.100md.com
附睾的精核蛋白电泳结果 对照组精核蛋白占总碱性蛋白的(40.6±7.2)%，而实验组为(4.6±2.2)%，较对照组极显著降低(P<0.001)。
原位杂交实验结果 光镜下可见在细胞核或细胞浆内有深蓝色cyclin D1或Cdk4 mRNA阳性杂交信号，且两者信号强弱基本一致。(1)正常组大鼠生精上皮中，cyclin D1在精原细胞和部分精母细胞中明显高表达，而圆形精子细胞则相对弱表达，在长形精子细胞和成熟精子中未见明显表达，cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞浆；Cdk4在正常大鼠生精细胞中的表达与cyclin D1相近；(2)cyclin D1在实验组大鼠生精上皮靠近管腔的精子细胞中出现异常的高表达，且cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞核；Cdk4在实验组大鼠生精上皮中的表达与cyclin D1相似(附图)； (3) 阴性组织对照示正常肌肉组织中上述基因基本无表达或微弱表达； 阴性探针对照示曲细精管生精上皮和肌肉组织中均未见阳性反应。
, 百拇医药
附图 cyclin D1和Cdk4基因表达原位杂交相片的灰度扫描结果
Fig Photographic gray level scanning of hybridization in situ of cyclin D1 and Cdk4 gene expression
(*P<0.001 compared with control)
大鼠心肝肾组织的变化 心肝肾组织的琥珀酸脱氢酶、ATP酶组化反应结果全部为阳性，实验组和对照组无明显区别；心肝肾组织的石蜡切片HE和PAS染色结果均未见明显异常。
讨 论
目前男性避孕药的研究重点以激素类药物为主，但非激素类药物，尤其是从雷公藤提取出的二萜类环氧化物(diterpene epoxide)系列也颇引人注目[9，10]。本实验结果表明，雷公藤内酯酮显著影响雄性Wistar大鼠睾丸产生精子的数量以及附睾精子的活力；但对大鼠体重及各生殖器官重量影响不大；通过对大鼠心肝肾组织的组化和切片的形态学观察显示，雷公藤内酯酮对心肝肾组织无毒性损伤。以上结果表明雷公藤内酯酮在不影响机体脏器和生殖器官的剂量下，有显著的雄性抗生育作用，具有作为男性避孕药物的潜质。
, 百拇医药
在雷公藤内酯酮雄性抗生育作用机制方面，本研究发现实验组大鼠圆形精子细胞的比例较对照组明显降低，而精原细胞、前细线期精母细胞和粗线期精母细胞的比例均正常；第Ⅸ期曲细精管有精子延迟释放现象，且长形精子细胞数量明显减少。说明雷公藤内酯酮主要作用于变形前的圆形精子细胞，阻碍其向长形精子细胞分化。细胞如果不在分化状态，就会进入细胞周期。cyclin蛋白系列是细胞周期进程的正向调节子，它们通过激活一系列蛋白激酶，如Cdks(cyclin-dependent kinases)，并与之结合形成复合物行使其功能。通过cyclin蛋白系列的降解与不同cyclin基因表达及其蛋白的积累，激活不同的Cdk基因表达，细胞周期才得以进行下去[11]。cyclin D1 结合并激活其主要的催化亚单位Cdk4和Cdk6，而它们通过使Retinoblastoma(Rb)肿瘤抑制蛋白和其它2个Rb相关蛋白p107、p130磷酸化，调节G1期进程和G1/S期的过渡[12]。在哺乳动物中，Cdk4(在一些类型的细胞中是Cdk6)及其酪氨酸的磷酸化是从G0期进入细胞周期所必需的[13]，而cyclin D1和Cdk4对调控G1期和DNA复制的开始是必需的。过量表达cyclin D1造成Cdk4基因也过量表达，可使细胞生长和增殖的速率异常[14]。雷公藤内酯酮使精子细胞中cyclin D1和Cdk4基因表达显著增加，造成精子细胞难以进入分化状态变形成长形精子，而滞留于G1期。支持细胞通过某种尚未阐明的机制减少这种停滞不前的圆形精子细胞的数量，而其它生精细胞数量保持正常。雷公藤内酯酮还抑制附睾精核蛋白(protamine)的合成。精核蛋白是精子细胞从圆形到长形分化过程中核内组蛋白的替代物，是成熟精子中的主要核蛋白[15]。雷公藤内酯酮阻碍了精子细胞核蛋白类型的转换，使精子不能成熟，是其雄性抗生育作用的重要位点。但雷公藤内酯酮促使精子细胞cyclin D1及Cdk4基因高表达和抑制附睾精核蛋白合成的机制及其相关性尚不明确，有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
总之，雷公藤内酯酮在发挥抗生育作用的有效剂量下对机体的毒副作用小，其主要作用的靶细胞是生精过程中下游精子细胞和成熟的精子，而对下丘脑-垂体-睾丸轴系影响不大[9]。雷公藤内酯酮是一极具潜质的非类固醇类男性避孕药剂。
(致谢：北京师范大学细胞生物室王永潮老师和乔丹同学在原位杂交实验中提供条件和帮助)■
国家自然科学基金(39670763)、卫生部科学研究基金(96-1-074)及计生委八五攻关项目(85-918)资助
王岚(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
叶惟三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
惠玲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
, http://www.100md.com
刘霄(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
郭燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
参考文献
[1]Zhen QS，Xu Y，Zhang JW. Recent progress in research on tripterygium：a male antifertility plant. Contraception，1995，51(2)：121-129
[2]郑家润，顾克显，高纪伟，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成分的筛选Ⅳ.7个环氧二萜内酯化合物体内雄性抗生育活性的比较.中国医学科学院学报，1991，13(6)：398-403
[3]郑家润，顾克显，徐兰芳，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成分的筛选Ⅲ.7个环氧二萜内酯化合物体内抗炎免疫活性的比较.中国医学科学院学报，1991，13(6)：391-397
, 百拇医药
[4]叶惟三，李 梅，王雪迎，等.应用精子头部银染观察棉酚的遗传效应.中国医学科学院学报，1988，10(2)：127-128
[5]Russell LD，Ettlin RA，Hikim A，et al.Histological and histopathological evaluation of the testis. 1st ed.Clearwater：Cache River Press，1990.62-119
[6]Fei RR，Teng CS.The effects of gossypol on nuclear protein in rats testes.I.Reproduction in the content of basic proteins in the spermatogenetic cells.Contraception，1988，37(3)：279-290
, http://www.100md.com [7]Panyim S，Chalkley R.High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones.Arch Biochem Biophys，1969，130：337-346
[8]苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.59-90
[9]Qian SZ，Xu Y，Zhang W.Recent progress in research on tripterygium：a male antifertility plant. Contraception，1995，51：121-129
[10]Lue Y，Hikim A，Wang C，et al.Triptolide： a potential male contraceptive.J Androl，1998，19(4)：479-485
, 百拇医药
[11]King RW，Jackson PK，Kirschner MW，et al.Mitosis in transition. Cell，1994，79：563-571
[12]Hartwell LH，Kastan NB.Cell cycle control and cancer.Science，1994，266：1821-1828
[13]Jinno S，Hung SC，Okayama H. Cell cycle start from quiescence controlled by tyrosine phosphorylation of Cdk4. Oncogene，1999，18：565-571
[14]Wang QS，Papanikolaou A，Sabourin CLK，et al.Altered expression of cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 4 in azoxymehane-induced mouse colon tumorigenesis.Carcinogenesis，1998，19(11)：2001-2006
[15]戴文平，刘 平，韩玉华，等.雷公藤单体T4、T7、T15及雷公藤酯醇对大鼠精子核蛋白组型的影响.中国医学科学院学报，1994，16(1)：20-24, 百拇医药
王岚 叶惟三 惠玲 刘霄 郭燕
摘 要 目的 研究雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用机制。方法 用雷公藤内酯酮200 μg/(kg.d)喂服Wistar大鼠，8周后取材。做大鼠睾丸精子计数、精子活动度、睾丸切片的形态学观察，精核蛋白提取以及基因cyclin D1和Cdk4 mRNA的原位杂交实验。 结果 实验组大鼠睾丸精子数量为(26.43±3.90)×106/g，比对照组大鼠的精子计数(41.15±5.51)×106/g明显降低(P<0.01)，精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P<0.001)；cyclin D1和Cdk4基因表达在精子细胞中显著上升。结论 雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用显著，作用机制可能主要是增加精子细胞cyclin D1和Cdk4基因的表达，抑制附睾精核蛋白的生物合成。
, 百拇医药
关键词：雷公藤内酯酮 雄性抗受精作用 cyclin D1 Cdk4 精核蛋白
近年来，药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii hook f，TW) 的男性抗生育作用受到国际社会的广泛关注，但其抗生育活性与抗炎、免疫抑制活性的不可分割却是一个重要缺陷[1，2]。雷公藤的化学成分复杂，目前已从其中筛选、分离出7种单体，其中免疫抑制活性最低的是雷公藤内酯酮(triptonide)[3]。本研究主要目的是对雷公藤内酯酮的抗生育作用机制进行探讨。
材料和方法
药品与试剂 雷公藤内酯酮由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠；含基因 cyclin D1 的载体质粒pGEM4，基因Cdk4的载体质粒SK，由美国冷泉港分子生物学实验室David Beach 博士惠赠；RNA 合成酶SP6、T3，内切酶 E.coRⅠ、SmaⅠ 购自 Promega 公司；地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim 公司。
, 百拇医药
动物 健康雄性 Wistar 大鼠共10只，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，体重为(190±10)g，分为两组，每组5只。Ⅰ组为雷公藤内酯酮实验组，雷公藤内酯酮用1%的二甲基亚砜(DMSO)配制，给药剂量为200 μg/(kg*d)。Ⅱ组为空白对照组，喂服1%的 DMSO，剂量为2 ml/(kg*d)。每周一称1次体重，根据体重调整喂药量，喂药8周后取材。雷公藤内酯酮组大鼠的合笼实验，已由江苏省计划生育研究所完成，结果见参考文献[1]。
大鼠体重及生殖器官的重量 记录大鼠每周体重增加量，取材时分别称取大鼠睾丸、附睾、精囊腺的重量。
雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响 (1)睾丸内精子计数：约取四分之一睾丸称重，加蒸馏水研磨成浆，总量为1 ml。超声处理，计数每克组织所含的精子头部数目；(2)附睾精子活动度：取大鼠的双侧附睾，于生理盐水中剪碎，静置5 min，涂片计数300个精子中活动精子所占比例；(3)附睾精子银染[4]：油镜下，随机计数200个精子，按形态分为4个等级：A.正常；B.精子头部异常；C.精子尾部轴丝分离或断裂；D.精子头颈分离；(4)睾丸组织切片：睾丸组织在Bouin氏固定液中固定，石蜡切片(片厚6 μm)，PAS染色。按照Russell等[5]方法识别睾丸曲细精管14期，计数睾丸切片曲细精管第Ⅶ-Ⅷ期中的150个不同生精细胞(精原细胞、前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞)与支持细胞的比例，支持细胞以看清核仁为准。
, http://www.100md.com
附睾精核蛋白的提取 Fei法提取总碱性核蛋白(TNBP)[6]，然后用Panyim法[7]，在酸性-尿素系统中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为20%，结果拍成黑白照片进行灰度扫描，测得各蛋白条带的相对数值。
细胞周期蛋白基因cyclin D1、Cdk4表达mRNA的原位杂交 (1)cRNA探针的制备：将含该基因的载体质粒pGEM4、SK cDNA用相应的限制性内切酶E.coRⅠ、SmaⅠ线性化，纯化；用RNA合成酶SP6、T3合成反义的RNA探针；按照地高辛标记和检测试剂盒提供的方法进行标记；(2)原位杂交：按文献[8]方法；(3)阴性组织对照：在实验条件完全相同的情况下，检测正常肌肉组织上述基因的表达；(4)阴性探针对照：在相同的实验条件下，以杂交液中不加cRNA探针和以正义cRNA探针代替反义cRNA探针，分别在曲细精管生精上皮和肌肉组织中检测上述基因的表达；结果拍照进行灰度扫描，测定管腔不同区域标记颜色的相对数值。
, http://www.100md.com
心肝肾的形态学观察 (1)心肝肾组织琥珀酸脱氢酶组化反应，阳性反应为出现蓝紫色的颗粒沉淀；心肝肾组织ATP酶的组化反应，阳性反应为出现棕色颗粒沉淀；(2)取部分心肝肾组织Bouin固定，石蜡包埋切片，HE、PAS染色，光镜观察。
统计学处理 实验结果以平均值±标准差(X±s)表示，组间比较用t检验。
结 果
大鼠体重及生殖器官的重量变化 喂药8周后，对照组大鼠和实验组大鼠的睾丸、附睾和精囊腺重量无明显差别(P>0.05)。整个实验进程中，两组体重均无明显差别。
雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响 (1)精子计数：实验组大鼠的精子计数为(26.43±3.90)×106/g，比对照组大鼠(41.15±5.51)×106/g明显降低(P<0.01)；(2)附睾精子活力：实验组大鼠的精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P<0.001)；(3)精子银染：实验组精子头颈分离的比例为(49.4±9.6)%，较对照组(19.0±5.2)%显著增多(P<0.05)；(4)睾丸切片PAS反应：实验组和对照组都存在着正常的各阶段的不同组织和细胞，如血管、淋巴管、间质细胞和结缔组织细胞。实验组有第Ⅸ期精子的延迟释放现象，还可见空泡和细胞脱落，但数目不多。圆形精子细胞与支持细胞的比例实验组为(9.15±0.33)，比对照组(10.73±0.38)极显著下降(P<0.001)，其它生精细胞的比例正常。
, http://www.100md.com
附睾的精核蛋白电泳结果 对照组精核蛋白占总碱性蛋白的(40.6±7.2)%，而实验组为(4.6±2.2)%，较对照组极显著降低(P<0.001)。
原位杂交实验结果 光镜下可见在细胞核或细胞浆内有深蓝色cyclin D1或Cdk4 mRNA阳性杂交信号，且两者信号强弱基本一致。(1)正常组大鼠生精上皮中，cyclin D1在精原细胞和部分精母细胞中明显高表达，而圆形精子细胞则相对弱表达，在长形精子细胞和成熟精子中未见明显表达，cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞浆；Cdk4在正常大鼠生精细胞中的表达与cyclin D1相近；(2)cyclin D1在实验组大鼠生精上皮靠近管腔的精子细胞中出现异常的高表达，且cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞核；Cdk4在实验组大鼠生精上皮中的表达与cyclin D1相似(附图)； (3) 阴性组织对照示正常肌肉组织中上述基因基本无表达或微弱表达； 阴性探针对照示曲细精管生精上皮和肌肉组织中均未见阳性反应。
, 百拇医药
附图 cyclin D1和Cdk4基因表达原位杂交相片的灰度扫描结果
Fig Photographic gray level scanning of hybridization in situ of cyclin D1 and Cdk4 gene expression
(*P<0.001 compared with control)
大鼠心肝肾组织的变化 心肝肾组织的琥珀酸脱氢酶、ATP酶组化反应结果全部为阳性，实验组和对照组无明显区别；心肝肾组织的石蜡切片HE和PAS染色结果均未见明显异常。
讨 论
目前男性避孕药的研究重点以激素类药物为主，但非激素类药物，尤其是从雷公藤提取出的二萜类环氧化物(diterpene epoxide)系列也颇引人注目[9，10]。本实验结果表明，雷公藤内酯酮显著影响雄性Wistar大鼠睾丸产生精子的数量以及附睾精子的活力；但对大鼠体重及各生殖器官重量影响不大；通过对大鼠心肝肾组织的组化和切片的形态学观察显示，雷公藤内酯酮对心肝肾组织无毒性损伤。以上结果表明雷公藤内酯酮在不影响机体脏器和生殖器官的剂量下，有显著的雄性抗生育作用，具有作为男性避孕药物的潜质。
, 百拇医药
在雷公藤内酯酮雄性抗生育作用机制方面，本研究发现实验组大鼠圆形精子细胞的比例较对照组明显降低，而精原细胞、前细线期精母细胞和粗线期精母细胞的比例均正常；第Ⅸ期曲细精管有精子延迟释放现象，且长形精子细胞数量明显减少。说明雷公藤内酯酮主要作用于变形前的圆形精子细胞，阻碍其向长形精子细胞分化。细胞如果不在分化状态，就会进入细胞周期。cyclin蛋白系列是细胞周期进程的正向调节子，它们通过激活一系列蛋白激酶，如Cdks(cyclin-dependent kinases)，并与之结合形成复合物行使其功能。通过cyclin蛋白系列的降解与不同cyclin基因表达及其蛋白的积累，激活不同的Cdk基因表达，细胞周期才得以进行下去[11]。cyclin D1 结合并激活其主要的催化亚单位Cdk4和Cdk6，而它们通过使Retinoblastoma(Rb)肿瘤抑制蛋白和其它2个Rb相关蛋白p107、p130磷酸化，调节G1期进程和G1/S期的过渡[12]。在哺乳动物中，Cdk4(在一些类型的细胞中是Cdk6)及其酪氨酸的磷酸化是从G0期进入细胞周期所必需的[13]，而cyclin D1和Cdk4对调控G1期和DNA复制的开始是必需的。过量表达cyclin D1造成Cdk4基因也过量表达，可使细胞生长和增殖的速率异常[14]。雷公藤内酯酮使精子细胞中cyclin D1和Cdk4基因表达显著增加，造成精子细胞难以进入分化状态变形成长形精子，而滞留于G1期。支持细胞通过某种尚未阐明的机制减少这种停滞不前的圆形精子细胞的数量，而其它生精细胞数量保持正常。雷公藤内酯酮还抑制附睾精核蛋白(protamine)的合成。精核蛋白是精子细胞从圆形到长形分化过程中核内组蛋白的替代物，是成熟精子中的主要核蛋白[15]。雷公藤内酯酮阻碍了精子细胞核蛋白类型的转换，使精子不能成熟，是其雄性抗生育作用的重要位点。但雷公藤内酯酮促使精子细胞cyclin D1及Cdk4基因高表达和抑制附睾精核蛋白合成的机制及其相关性尚不明确，有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
总之，雷公藤内酯酮在发挥抗生育作用的有效剂量下对机体的毒副作用小，其主要作用的靶细胞是生精过程中下游精子细胞和成熟的精子，而对下丘脑-垂体-睾丸轴系影响不大[9]。雷公藤内酯酮是一极具潜质的非类固醇类男性避孕药剂。
(致谢：北京师范大学细胞生物室王永潮老师和乔丹同学在原位杂交实验中提供条件和帮助)■
国家自然科学基金(39670763)、卫生部科学研究基金(96-1-074)及计生委八五攻关项目(85-918)资助
王岚(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
叶惟三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
惠玲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
, http://www.100md.com
刘霄(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
郭燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)
参考文献
[1]Zhen QS，Xu Y，Zhang JW. Recent progress in research on tripterygium：a male antifertility plant. Contraception，1995，51(2)：121-129
[2]郑家润，顾克显，高纪伟，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成分的筛选Ⅳ.7个环氧二萜内酯化合物体内雄性抗生育活性的比较.中国医学科学院学报，1991，13(6)：398-403
[3]郑家润，顾克显，徐兰芳，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成分的筛选Ⅲ.7个环氧二萜内酯化合物体内抗炎免疫活性的比较.中国医学科学院学报，1991，13(6)：391-397
, 百拇医药
[4]叶惟三，李 梅，王雪迎，等.应用精子头部银染观察棉酚的遗传效应.中国医学科学院学报，1988，10(2)：127-128
[5]Russell LD，Ettlin RA，Hikim A，et al.Histological and histopathological evaluation of the testis. 1st ed.Clearwater：Cache River Press，1990.62-119
[6]Fei RR，Teng CS.The effects of gossypol on nuclear protein in rats testes.I.Reproduction in the content of basic proteins in the spermatogenetic cells.Contraception，1988，37(3)：279-290
, http://www.100md.com [7]Panyim S，Chalkley R.High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones.Arch Biochem Biophys，1969，130：337-346
[8]苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.59-90
[9]Qian SZ，Xu Y，Zhang W.Recent progress in research on tripterygium：a male antifertility plant. Contraception，1995，51：121-129
[10]Lue Y，Hikim A，Wang C，et al.Triptolide： a potential male contraceptive.J Androl，1998，19(4)：479-485
, 百拇医药
[11]King RW，Jackson PK，Kirschner MW，et al.Mitosis in transition. Cell，1994，79：563-571
[12]Hartwell LH，Kastan NB.Cell cycle control and cancer.Science，1994，266：1821-1828
[13]Jinno S，Hung SC，Okayama H. Cell cycle start from quiescence controlled by tyrosine phosphorylation of Cdk4. Oncogene，1999，18：565-571
[14]Wang QS，Papanikolaou A，Sabourin CLK，et al.Altered expression of cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 4 in azoxymehane-induced mouse colon tumorigenesis.Carcinogenesis，1998，19(11)：2001-2006
[15]戴文平，刘 平，韩玉华，等.雷公藤单体T4、T7、T15及雷公藤酯醇对大鼠精子核蛋白组型的影响.中国医学科学院学报，1994，16(1)：20-24, 百拇医药