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编号:10502790
一氧化氮在海人酸所致神经毒性和记忆损害中的作用
http://www.100md.com 《中国医学科学院学报》 2000年第3期
     李从德 张世仪 陈纪君

    摘 要 目的 观察一氧化氮(NO)在海人酸(KA)对脑的兴奋毒性中的作用。方法 成年雌性Wistar大鼠双侧尾核内注射KA。术后3个时间点测定一氧化氮合酶(NOS)的活性(即测定脑匀浆加入酶反应体系中产生的NO2-浓度),另一批大鼠经KA注射后第2~6天每天腹腔注射10 mg/kg L-硝基精氨酸甲酯 (L-NAME)或25 mg/kg 7-硝基吲哚 (7-NI)。术后10 d起进行学习记忆行为试验。 结果 尾核NOS活性在术后6~8 h无明显变化,术后3 d显著升高,术后5 d仍轻度升高。L-NAME和7-NI都能减轻KA所致的被动回避反应记忆损害。只有L-NAME能改善KA所致的主动回避反应行为缺陷。结论 进一步表明NOS激活和过量NO可能介导KA的兴奋毒性。早期多次使用NOS抑制剂对KA兴奋毒性引起的记忆缺陷有一定的改善作用。
, 百拇医药
    关键词:海人酸 尾核 兴奋毒性 一氧化氮合酶 学习记忆

    一氧化氮(nitric oxide,NO)是脑内一种新发现的信使分子,参与广泛的生理和病理过程[1]。海人酸(kanic acid ,KA)是谷氨酸非 NMDA 受体的激动剂。常作为研究兴奋毒性脑损伤的工具药。大鼠尾核内注射 KA 引起神经元变性,其病理变化与 Huntingtons 病类似。研究表明,NO 可能介导神经系统兴奋毒性损害[2],但有关 KA 的兴奋毒性与 NO 关系的研究尚少。笔者曾建立了 KA 损伤大鼠尾核并导致记忆障碍的模型[3]。在此基础上,本研究进一步观察 KA 注入尾核后一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,NOS) 活性的变化,并研究两种 NOS 抑制剂对 KA 所致的记忆障碍是否有改善作用。

    材料和方法
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    动物及分组 成年雌性 Wistar 大鼠27只,体重(200±10)g。手术组(n=19)于三溴乙醇麻醉后依脑立体定位图谱向双侧尾核内注射 KA,每侧0.5 μl(0.3 μg)[3];假手术组 (n=8)只注射0.5 μl生理盐水。手术与假手术组大鼠在术后6~8 h,3和5 d快速断头,分离出尾核和小脑于液氮冻存后测NOS活性。另一批大鼠随机分为4组:假手术 (Sham) 组(n=10),KA+NS组(n=8),KA+L-NAME 组(n=10),KA+7-NI组 (n=9),术后第2天开始分别向腹腔注射生理盐水或 10 mg/kg L-硝基精氨酸甲酯 (nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME) 或25 mg/kg 7-硝基吲哚 (7-Nitroindazole,7-NI),连续5 d。

    NOS 活性测定 参照王成彬等[4]的方法进行。取冻存的尾核和小脑加入缓冲液匀浆,离心以后,上清液与 L-arginine,NADPH,Hepes,CaCl2,BH4,CaM构成酶反应体系,37℃温育,再加入磷酸,对氨基苯磺酸和N-乙萘基乙二胺后,用酶标仪测OD值计算NO2-量。用RNA/DNA calculator 测上清液蛋白浓度,以每毫克蛋白在反应体系中1 min所产生的NO2-表示NOS活性。
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    行为试验 在 KA 注射后10 d起,按本组已建立的方法[3],进行自发活动和学习记忆行为测定。后者包括:(1) 跳台被动回避反应:电击参数为0.25~0.30 mA,10 s×2,记录电击后5 min和24 h下台潜伏期,作为短时和长时记忆水平指标;(2) 跳台主动回避反应:以短声5 s为条件信号,再结合脚掌电击,训练动物在短声信号期内跳上平台回避电击。共训练3 d。以达标所需训练次数,共犯错误次数及达标动物占该组动物的百分比作为判断学习记忆能力的指标。

    病理学检查 行为实验结束后取脑组织尾核部位冰冻切片,Nissl染色。

    统计学处理 被动回避反应结果分析采用Mann-Whitney等级检验,其他结果分析采用t检验。

    结 果

    KA损伤尾核后NOS活性变化 尾核NOS活性在KA损伤后6~8 h无明显变化;第3天显著升高,为假手术组的147.8%;第5天仍轻度升高但与假手术组比较差异无显著性。KA损伤尾核对小脑NOS活性无明显影响(表1)。
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    表 1 KA损伤尾核后NOS活性的变化

    Table 1 Changes of NOS activity after kanic acid

    induced caudate lesion(X±s)

    Group

    n

    NOS activity

    (pmol*min-1*mg-1 protein)

    Caudate

    Cerebellum

, 百拇医药     Sham

    8

    29.51±2.75

    36.76±0.83

    6~8h

    6

    28.77±2.75

    30.77±3.48

    3d

    7

    43.60±4.91*

    33.70±1.33
, 百拇医药
    5d

    6

    32.30±5.93

    33.10±2.45

    *P<0.05 compared with Sham; NOS:nitric oxide synthase; Sham: sham-operated

    NOS抑制剂对尾核损伤大鼠行为的影响

    自发活动测定:在本实验条件下,KA注入尾核对大鼠自发活动无明显影响。NOS抑制剂亦不改变大鼠自发活动水平。

    被动回避反应:电击后5 min和24 h,KA+NS组下台潜伏期显著短于假手术组(P<0.01)。两种NOS抑制剂,即L-NAME和7-NI应用后都使该组下台潜伏期比KA+NS组明显延长。L-NAME作用强于7-NI(表2)。 表 2 NOS抑制剂对尾核损伤大鼠被动回避反应的影响
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    Table 2 Effect of inhibitor of nitric oxide synthase

    on passive avoidance response in

    caudate-lesioned rats

    Group

    n

    Step-down latencies(s)

    After shock

    Pre-

    shock

    5 min
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    M(interquatile

    range)

    24 h

    M(interquatile

    range)

    Sham

    10

    1

    56(38~77)

    57(38~130)

    KA+NS

    8
, 百拇医药
    1

    10(7~16)**

    2(1~2.5)**

    KA+L-NAME

    10

    1

    39(36~42)△△

    29(20~40)△△

    KA+7-NI

    9

    1

, 百拇医药     29(25~37)

    32(25~39)

    **P<0.01 compared with Sham;P<0.05,△△P<0.01 compared with KA+NS; Sham:sham-operated;KA+NS:kanic acid+normal saline;KA+L-NAME:kanic acid+nitro-L-arginine methyl ester;KA+7-NI:kanic acid+7-nitroindazole;M:median

    主动回避反应:KA+NS组与假手术组相比,犯错误次数显著增多(P<0.01),训练结束时该组动物都未达标。KA+L-NAME组各项指标都较KA+NS组显著改善(P<0.01),而KA+7-NI组与KA+NS组的学习成绩十分接近,但与假手术组比较差异有显著性(表3)。病理学检查 尾核内KA注射部位有明显的神经元缺失,并见胶质细胞增生。
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    表 3 NOS抑制剂对尾核损伤大鼠主动回避反应的影响

    Table 3 Effect of inhibitor of nitric oxide synthase on

    active avoidance response in caudate-lessioned rats (X±s)

    Group

    n

    No.of trials to

    criterion

    No.of

    errors

, 百拇医药     PCRA

    (%)

    Sham

    10

    21.52±1.25

    8.94±1.90

    100

    KA+NS

    8

    40.00±0* *

    27.52±3.90* *

    0
, 百拇医药
    KA+L-NAME

    10

    28.03±1.66△*

    14.73±4.17△*

    100

    KA+7-NI

    9

    40.00±0* *

    26.00±4.38* *

    0

    *P<0.05,**P<0.01,compared with Sham;P<0.01 compared with KA+NS;PCRA:percent of criterion-reached animal
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    讨 论

    虽然Garthwaite等[5]曾通过小脑细胞培养表明KA引起cGMP升高,有NOS激活和NO的产生,但在整体条件下KA神经毒性与NOS的关系仍不清楚。Lei等[6]报告,在KA注入大鼠大脑皮层2~3 d后,损伤中心周围大量的星型胶质细胞和血管内皮细胞内NOS活性上调。本实验于KA注入尾核后,测出该核团NOS活性在术后3 d时明显升高,与上述结果基本一致。小脑NOS活性无变化提示尾核NOS活性升高是由于尾核内注入KA引起的。故本实验结果进一步表明KA的兴奋毒性很可能包括NOS的激活。

    已有不少资料表明NOS抑制剂对脑缺血损伤模型或NMDA受体激活的神经毒性有保护作用,但亦有不一致的结果[7]。本研究以KA注入尾核所致学习记忆障碍作为KA神经毒性的指标,发现NOS抑制剂L-NAME(10 mg/kg)慢性多次给药后,在两种行为试验中都十分显著地改善KA引起的学习记忆能力损害。而另一种NOS抑制剂7-NI只对被动回避反应有效。根据文献报道,KA注入脑内主要是引起诱导型NOS(iNOS)的激活,而7-NI是相对特异的神经元型NOS(nNOS)的抑制剂,L-NAME是非特异的NOS抑制剂,因此7-NI对iNOS的抑制效应不如L-NAME。NO的神经毒性可能包括:NO作为自由基,特别是NO与O2.-结合生成过氧亚硝基化合物(.ONOO-)的细胞毒性,NO和.ONOO-对DNA的损害和抑制线粒体的功能,NO结合于内含铁硫环的酶使其失活等。本工作为研究NO可能参与KA所致神经毒性的机制以及NOS抑制剂的保护作用,提供了新的资料。
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    李从德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理室,北京 100005)

    张世仪(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理室,北京 100005)

    陈纪君(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理室,北京 100005)

    参考文献

    [1]Szabo C.Physiological and pathophysiological roles of nitric oxide in the central nervous system.Brain Res Bull,1996,41:131-141

    [2]Choi DW.Nitric oxide:foe or friend to the injured brain.Proc Natn Acad Sci USA,1993,90:9741-9743
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    [3]谯敏,张世仪.764-3对脑损伤所致认知障碍的改善作用及作用机理.中国医学科学院学报,1997,19(5):325-329

    [4]王成彬,田亚平.大鼠脑组织中一氧化氮合酶测定.生物化学与生物物理学进展,1996,23(6):548-551

    [5]Garthwaite J,Southam E,Anderton M.A kainate receptor linked to nitric oxide synthesis from arginine.J Neurochem,1989,53:1952-1954

    [6]Lei DL,Yang DL,Liu HM.Local injection of kainic acid causes wide spread degeneration of NADPH-d in neurons and induction of NADPH-d in neurons,endothelial cells and reactive astrocytes.Brain Res,1996,730:199-206

    [7]Jaffrey SR,Snyder SH.Nitric oxide:a neural messenger.Annu Rev Cell Biol,1995,11:417-440, 百拇医药