清醒小鼠反复脑缺血再灌注法致学习记忆障碍模型的建立
岑德意 周兰兰 明亮 江勤 马传庚
摘 要 目的 建立一种清醒小鼠反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍模型的方法。方法 采用清醒小鼠反复脑缺血再灌注及单次脑缺血再灌注手术方法，应用跳台法，避暗法，脑海马CA1区神经细胞计数等方法研究脑缺血再灌注对小鼠行为学，脑病理形态学的影响，并预防应用尼莫地平等药物研究了反复脑缺血再灌注造模方法的稳定性及可靠性。结果 与假手术组比较，反复脑缺血再灌注使小鼠出现明显的学习记忆功能障碍且比相同缺血时间的单次脑缺血再灌注造成的损伤更为明显，并使脑海马CA1区神经细胞数明显减少；尼莫地平等药物可不同程度地改善反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍小鼠的学习记忆功能。结论 清醒小鼠反复脑缺血再灌注法是一种稳定可靠，简便易行的致学习记忆障碍的造模方法。
, 百拇医药
关键词：学习 记忆 反复脑缺血再灌注法 跳台法 避暗法 小鼠
血管性痴呆(Vascular dementia,VD)与老年性痴呆Alzheimer型(SDAT)一样，是与老年有关引起痴呆最常见的原因之一。VD是脑血管病后的主要并发症，严重影响老年人的生活质量。据美国NIH关于VD多中心的研究，发现美国年龄在60岁以上的缺血性脑血管疾病存活患者中26.3%合并痴呆；我国11城市和农村的普查显示，60岁以上老人中VD患病率为324/10万人口，SDAT为238/10万人口，VD略高于老年性痴呆[1]。因此积极开展VD的基础与临床研究意义重大。目前VD的动物模型多为单次脑缺血模型，但此类模型具有造模不可靠、造成的记忆缺损呈可逆性等缺点。我们在反复实验的基础上，建立了一种简便易行的清醒小鼠反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍模型的方法，并经病理学研究及尼莫地平等药物的防治作用证明其可靠性及稳定性。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 药品 尼莫地平(nimodipine),山东新华制药股份有限公司生产，批号：9608004；银杏叶提取物(extracts of ginkgobiloba leaves,EGB)，安徽省金寨县神栗食品有限公司赠送，批号：9805011，经高效液相法检测含总黄酮苷33.84%,总萜内脂11.18%。
1.2 动物 昆明种小鼠，体重(30.0±3.12)g,♀♂兼用。动物购自安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准01号)。小鼠随机分成6组：①生理盐水对照组；②假手术组；③单次脑缺血再灌注组(以下简称单组)；④反复脑缺血再灌注组(以下简称复组)；⑤尼莫地平治疗组；⑥EGB治疗组。
1.3 手术方法 清醒小鼠仰位固定，行颈部切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。假手术组只分离双侧颈总动脉，不阻断。单组用橡皮泥固定拉紧丝线阻断血流，30 min后松线使血液再灌注。复组固定拉紧丝线阻断血流，10 min后松线使血液再灌注20 min，如此反复3次。药物治疗组：尼莫地平100 mg*kg-1，EGB 50 mg*kg-1，ig，qd×21 d后均行反复脑缺血术。术后24 h、48 h进行行为学检测。
, 百拇医药
1.4 行为学检测方法
1.4.1 跳台法(Step down test) 参照文献[2]，小鼠置跳台仪中，适应环境3 min后，底部栅板通电，记录小鼠跳上平台的潜伏期(Escape latency,EL)和5 min内小鼠遭受的电击数(错误次数)作为学习成绩；24 h后将小鼠放于平台上，底部栅板通电，记录小鼠跳下平台的潜伏期(Step down latency,SDL)、EL及5 min内的错误次数，作为记忆成绩。电压40 V，潜伏期指标以秒(s)为单位。测验时若小鼠停留在台上超出5 min，将其取下放入箱内，尾对平台，给予电刺激，记录EL。
1.4.2 避暗法(Step through test) 避暗仪为浙江宁海白石药检仪器厂生产的声-光-电单向穿梭箱，分明暗两室。按文献[3]，将小鼠放入明室中，记录小鼠进入暗室遭受电击所需时间，为步入潜伏期(Step through latency,STL)，并记录小鼠首次遭受电击后从暗室逃入明室所需时间(逃避潜伏期，EL)、5 min内遭电击次数(错误次数)及5 min遭受电击的累计刺激时间(Cummulated stimulated time ，CST),作为学习成绩。24 h后重复测试，记录STL、EL、错误次数和CST, 作为记忆成绩。刺激条件同前电压为40 V，潜伏期指标以s为单位。
, 百拇医药
1.5 病理学检查 术后72 h，各组小鼠断头处死，取全脑，常规10%甲醛固定，石蜡包埋，冠状切片，HE染色。在有测微尺显微镜下观察细胞形态变化并计数从CA1区始点起2 mm范围内神经细胞数(×10)。
1.6 统计学处理 所有数据均以X±s表示，采用组间t检验；行为学检测的跳台潜伏期指标经对数转换后行组间t检验。
2 结果
2.1 反复脑缺血再灌注对小鼠跳台试验的影响 如表1所示。与假手术组比较，学习训练中复组、单组小鼠EL明显延长、错误次数明显增多；记忆测试中，复组EL明显延长、错误次数明显增多，单组EL明显延长，错误次数无统计学差异。与复组比较，学习训练中单组错误次数较少，有显著统计学差异；尼莫地平100 mg*kg-1组EGB 50 mg*kg-1组小鼠错误次数明显减少；记忆测试中，EGB组错误次数明显减少，EL明显缩短。
, http://www.100md.com
2.2 反复脑缺血再灌注对小鼠避暗试验的影响 如表2所示。与假手术组比较，学习训练中复组错误次数明显增多，CST明显延长, 单组仅CST明显延长，其它指标无差异；记忆测试中，复组STL明显缩短、错误次数明显增多，CST明显延长，单组除STL明显延长外，其余各项指标均无差异。与复组比较，学习训练中，尼莫地平组错误次数明显减少，EGB组EL、CST明显缩短，错误次数明显减少；记忆测试中，尼莫地平组，EGB组STL明显延长，CST明显缩短，错误次数明显减少，EGB组EL亦明显缩短。
2.3 反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍小鼠脑病理学改变 反复脑缺血再灌注术后72 h鼠脑切片光镜检查，发现海马CA1区细胞萎缩、细胞数目减少、排列不规则，齿状回颗粒细胞可见空泡变性。各组CA1区细胞计数结果如表3所示，与假手术组比较，复组CA1区细胞数明显减少(P<0.01)，单组细胞数目也明显减少(P<0.05)，与复组比较，EGB组及尼莫地平组细胞明显增加(P<0.05)，两组细胞数目均接近假手术组。
, 百拇医药
3 讨论
本方法行为学检测结果显示，反复脑缺血再灌注组小鼠逃避潜伏期(EL)明显延长，步入潜伏期(STL)明显缩短，错误次数明显增多，累计刺激时间(CST)明显延长，表明反复脑缺血再灌注使动物出现了明显的学习记忆障碍，且比相同缺血时间的单次脑缺血再灌注造成的损伤更为明显。有文献报道单次脑缺血模型造成的损伤不确切，记忆损害呈可逆性[4，5] 。与单次脑缺血再灌注相比，本模型更类似人类脑血管病的发生，因为人类VD中以多次缺血性脑梗塞引起的痴呆即多梗塞痴呆(Multi-infarct dementia,MID)最为常见。另外，避暗实验的学习训练中，各组小鼠步入潜伏期无统计学差异，表明反复脑缺血再灌注对动物的自主行为活动可能影响不大。即本模型动物只表现出学习记忆障碍而无明显的运动障碍。
Tab 1 Influence of repeated cerebral ischemia-reperfusion on step down test test(X±s)
, 百拇医药
Group
Dose / mg*kg-1
Experiment
number
Live
number
Learning
Memory
EL/s
Number of errors
SDL/s
EL/s
, 百拇医药
Number of errors
Sham
-
8
8
0.25±0.16
1.88±0.33
132±0.89
0.07±0.14
1.25±1.16
Sci
-
, http://www.100md.com 11
8
1.23±0.44△△
4.50±2.00*△△
1.26±0.93
0.96±0.18△△
2.25±1.03
Rci
-
12
9
1.42±0.55△△
, http://www.100md.com
9.56±4.85△△
0.81±0.64
1.25±0.35△△
4.56±1.81△△
Nin
100
11
9
1.39±0.34△△
3.62±2.39*
1.38±0.82
, 百拇医药
1.21±0.18△△
3.50±1.77△
EGB
50
11
8
1.42±0.46△△
3.00±2.62
1.54±0.74
0.58±0.31**△△
1.87±1.81*
, 百拇医药
Sci:single cerebral ischemia;Rci:repeated cerebral ischemial;Nim:nimodipine；△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham；*P<0.05，**P<0.01 vs Rci Tab 2 Influence of repeated cerebral ischemia-reperfusion on step through test(X±s)
Group
Dose /mg*kg-1
Experiment
number
Live
, 百拇医药
number
Learning
Memory
STL/s
EL/s
Number of
errors
CST/s
STL/s
EL/s
Number
of errors
, 百拇医药
CST/s
Sham
-
9
9
30.16±
11.26
4.05±
2.66
3.67±
1.50
9.09±
5.04
, http://www.100md.com
24.14±
11.73
3.04±
1.86
3.78±
1.30
10.90±
5.71
Sci
-
10
7
25.05±
, http://www.100md.com
9.09
4.37±
4.00
5.25±
2.82
24.04±
16.74△
44.29±
29.72*
2.01±
0.56*
4.25±
, 百拇医药
3.54
11.21±
9.85*
Rci
-
11
8
20.14±
9.56
5.87±
3.57
6.87±
2.95△
, 百拇医药
38.76±
47.96△
12.36±
5.70△
5.02±
3.51
6.62±
3.20△
27.19±
17.53△
Nim
100
, http://www.100md.com
10
7
32.86±
15.88
3.49±
2.23
3.43±
1.72*
8.74±
6.40
99.31±
58.17△△**
, 百拇医药
2.17±
1.51
2.96±
1.34*
5.00±
2.18△*
EGB
50
11
8
30.91±
17.30
, http://www.100md.com 1.66±
0.58△**
1.88±
1.13△△**
4.79±
1.69△
201.09±
102.07△△**
0.98±
0.39△△**
1.25±
, 百拇医药
0.71△△**
1.39±
0.85△△**
△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham; *P<0.05，**P<0.01 vs Rci Tab 3 Influence of repeated cerebral
ischemia-reperfusion on neurons of hippocampas CA1
in mouse(X±s)
Group
, 百拇医药 Dose/mg*kg-1
n
Number of neurons/2 mm-1
Sham-8
-
8
88.25±11.61
Sci
-
8
73.75±7.28△
Rci
, http://www.100md.com
-
9
72.22±5.24△△
Nim
100
8
79.50±6.91*
EGB
50
8
80.25±6.36*
△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham； *P<0.05 vs Rci 海马是与学习记忆活动密切相关的重要区域之一，本实验病理学检查表明，反复脑缺血再灌注造成了海马区域神经元不可逆的损伤，可能直接导致了脑缺血小鼠记忆能力的下降。
, 百拇医药
本实验结果显示尼莫地平、EGB等药物具脑缺血保护作用，两药均可不同程度地改善记忆障碍小鼠的学习记忆能力，这进一步验证了本方法的可靠性与稳定性。
我们在实验中还观察到死亡动物中约50%是由于手术操作不慎，误伤折断血管所致(因小鼠血管过细)。若排除血管损伤的原因，反复脑缺血再灌注组小鼠术后存活率可提高到85%左右。另外50%的动物多在缺血再灌注期死亡，可能是由缺血再灌注损伤所致，其机制有待进一步探讨。
缺血性脑血管病研究的最大障碍是缺乏可靠的动物模型。就目前应用较广、脑缺血实验结果较为可靠的血管闭塞法(4VO模型)及局限性大脑中动脉(MCA) 缺血等模型来说，仍具有一定的不足之处[6]：①动物需麻醉，这些实验大多需使用戊巴比妥钠、水合氯醛、乙醚等麻醉剂，有学者认为应避免使用戊巴比妥钠等类制剂，因其对脑缺血性损害有保护作用。②造模费时、复杂，此类实验一般1～2 d才能完成造模过程，均需较复杂的手术操作，有的尚需显微外科手术技巧，有一定难度，且对动物有损伤性，影响实验结果的分析。
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与上述造模方法相比，本方法简便、易行，采用价廉且缺血管解剖近似于人的小鼠作为实验对象，动物不需麻醉，结果稳定、可靠，为研究缺血性脑血管疾病的病理改变、预后及药物的治疗作用等提供了良好的动物模型。
安徽省自然科学基金资助课题，No 95-医-20
作者简介：岑德意，女，46岁，主管技师；
马传庚，男，65岁，教授，博士生导师
岑德意(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
周兰兰(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
明亮(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
江勤(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
, http://www.100md.com
马传庚(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
参考文献
1.谭铭勋. 血管性痴呆.国外医学脑血管疾病分册，1994；2(2)，79～83
2.张 艳，张鹤云，李卫平 et al 安吉复的促智作用研究. 中国药理学通报，1995;11(3)：233～6
3.张均田. 学习、记忆实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社，1991：660～1
4.Shuaib A, Ijaz MS, Miyashita H et al.GABA and glutamate levels in the substantia nigra reticular following repetitive cerebral ischemia in gerbils. EXP Neurol,1997;147(2):311～6
5.Naritomi H. Experimental basis of multi-infarct dementia: memory impairment in rodent models of ischemia. Alzheimer Dis Assoc Disord,1991;5(2):103～6
6.李 泓. 缺血性脑血管病动物模型制作进展.中药新药与临床药理，1995；6(1)：59～62, http://www.100md.com
摘 要 目的 建立一种清醒小鼠反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍模型的方法。方法 采用清醒小鼠反复脑缺血再灌注及单次脑缺血再灌注手术方法，应用跳台法，避暗法，脑海马CA1区神经细胞计数等方法研究脑缺血再灌注对小鼠行为学，脑病理形态学的影响，并预防应用尼莫地平等药物研究了反复脑缺血再灌注造模方法的稳定性及可靠性。结果 与假手术组比较，反复脑缺血再灌注使小鼠出现明显的学习记忆功能障碍且比相同缺血时间的单次脑缺血再灌注造成的损伤更为明显，并使脑海马CA1区神经细胞数明显减少；尼莫地平等药物可不同程度地改善反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍小鼠的学习记忆功能。结论 清醒小鼠反复脑缺血再灌注法是一种稳定可靠，简便易行的致学习记忆障碍的造模方法。
, 百拇医药
关键词：学习 记忆 反复脑缺血再灌注法 跳台法 避暗法 小鼠
血管性痴呆(Vascular dementia,VD)与老年性痴呆Alzheimer型(SDAT)一样，是与老年有关引起痴呆最常见的原因之一。VD是脑血管病后的主要并发症，严重影响老年人的生活质量。据美国NIH关于VD多中心的研究，发现美国年龄在60岁以上的缺血性脑血管疾病存活患者中26.3%合并痴呆；我国11城市和农村的普查显示，60岁以上老人中VD患病率为324/10万人口，SDAT为238/10万人口，VD略高于老年性痴呆[1]。因此积极开展VD的基础与临床研究意义重大。目前VD的动物模型多为单次脑缺血模型，但此类模型具有造模不可靠、造成的记忆缺损呈可逆性等缺点。我们在反复实验的基础上，建立了一种简便易行的清醒小鼠反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍模型的方法，并经病理学研究及尼莫地平等药物的防治作用证明其可靠性及稳定性。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 药品 尼莫地平(nimodipine),山东新华制药股份有限公司生产，批号：9608004；银杏叶提取物(extracts of ginkgobiloba leaves,EGB)，安徽省金寨县神栗食品有限公司赠送，批号：9805011，经高效液相法检测含总黄酮苷33.84%,总萜内脂11.18%。
1.2 动物 昆明种小鼠，体重(30.0±3.12)g,♀♂兼用。动物购自安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准01号)。小鼠随机分成6组：①生理盐水对照组；②假手术组；③单次脑缺血再灌注组(以下简称单组)；④反复脑缺血再灌注组(以下简称复组)；⑤尼莫地平治疗组；⑥EGB治疗组。
1.3 手术方法 清醒小鼠仰位固定，行颈部切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。假手术组只分离双侧颈总动脉，不阻断。单组用橡皮泥固定拉紧丝线阻断血流，30 min后松线使血液再灌注。复组固定拉紧丝线阻断血流，10 min后松线使血液再灌注20 min，如此反复3次。药物治疗组：尼莫地平100 mg*kg-1，EGB 50 mg*kg-1，ig，qd×21 d后均行反复脑缺血术。术后24 h、48 h进行行为学检测。
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1.4 行为学检测方法
1.4.1 跳台法(Step down test) 参照文献[2]，小鼠置跳台仪中，适应环境3 min后，底部栅板通电，记录小鼠跳上平台的潜伏期(Escape latency,EL)和5 min内小鼠遭受的电击数(错误次数)作为学习成绩；24 h后将小鼠放于平台上，底部栅板通电，记录小鼠跳下平台的潜伏期(Step down latency,SDL)、EL及5 min内的错误次数，作为记忆成绩。电压40 V，潜伏期指标以秒(s)为单位。测验时若小鼠停留在台上超出5 min，将其取下放入箱内，尾对平台，给予电刺激，记录EL。
1.4.2 避暗法(Step through test) 避暗仪为浙江宁海白石药检仪器厂生产的声-光-电单向穿梭箱，分明暗两室。按文献[3]，将小鼠放入明室中，记录小鼠进入暗室遭受电击所需时间，为步入潜伏期(Step through latency,STL)，并记录小鼠首次遭受电击后从暗室逃入明室所需时间(逃避潜伏期，EL)、5 min内遭电击次数(错误次数)及5 min遭受电击的累计刺激时间(Cummulated stimulated time ，CST),作为学习成绩。24 h后重复测试，记录STL、EL、错误次数和CST, 作为记忆成绩。刺激条件同前电压为40 V，潜伏期指标以s为单位。
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1.5 病理学检查 术后72 h，各组小鼠断头处死，取全脑，常规10%甲醛固定，石蜡包埋，冠状切片，HE染色。在有测微尺显微镜下观察细胞形态变化并计数从CA1区始点起2 mm范围内神经细胞数(×10)。
1.6 统计学处理 所有数据均以X±s表示，采用组间t检验；行为学检测的跳台潜伏期指标经对数转换后行组间t检验。
2 结果
2.1 反复脑缺血再灌注对小鼠跳台试验的影响 如表1所示。与假手术组比较，学习训练中复组、单组小鼠EL明显延长、错误次数明显增多；记忆测试中，复组EL明显延长、错误次数明显增多，单组EL明显延长，错误次数无统计学差异。与复组比较，学习训练中单组错误次数较少，有显著统计学差异；尼莫地平100 mg*kg-1组EGB 50 mg*kg-1组小鼠错误次数明显减少；记忆测试中，EGB组错误次数明显减少，EL明显缩短。
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2.2 反复脑缺血再灌注对小鼠避暗试验的影响 如表2所示。与假手术组比较，学习训练中复组错误次数明显增多，CST明显延长, 单组仅CST明显延长，其它指标无差异；记忆测试中，复组STL明显缩短、错误次数明显增多，CST明显延长，单组除STL明显延长外，其余各项指标均无差异。与复组比较，学习训练中，尼莫地平组错误次数明显减少，EGB组EL、CST明显缩短，错误次数明显减少；记忆测试中，尼莫地平组，EGB组STL明显延长，CST明显缩短，错误次数明显减少，EGB组EL亦明显缩短。
2.3 反复脑缺血再灌注致学习记忆障碍小鼠脑病理学改变 反复脑缺血再灌注术后72 h鼠脑切片光镜检查，发现海马CA1区细胞萎缩、细胞数目减少、排列不规则，齿状回颗粒细胞可见空泡变性。各组CA1区细胞计数结果如表3所示，与假手术组比较，复组CA1区细胞数明显减少(P<0.01)，单组细胞数目也明显减少(P<0.05)，与复组比较，EGB组及尼莫地平组细胞明显增加(P<0.05)，两组细胞数目均接近假手术组。
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3 讨论
本方法行为学检测结果显示，反复脑缺血再灌注组小鼠逃避潜伏期(EL)明显延长，步入潜伏期(STL)明显缩短，错误次数明显增多，累计刺激时间(CST)明显延长，表明反复脑缺血再灌注使动物出现了明显的学习记忆障碍，且比相同缺血时间的单次脑缺血再灌注造成的损伤更为明显。有文献报道单次脑缺血模型造成的损伤不确切，记忆损害呈可逆性[4，5] 。与单次脑缺血再灌注相比，本模型更类似人类脑血管病的发生，因为人类VD中以多次缺血性脑梗塞引起的痴呆即多梗塞痴呆(Multi-infarct dementia,MID)最为常见。另外，避暗实验的学习训练中，各组小鼠步入潜伏期无统计学差异，表明反复脑缺血再灌注对动物的自主行为活动可能影响不大。即本模型动物只表现出学习记忆障碍而无明显的运动障碍。
Tab 1 Influence of repeated cerebral ischemia-reperfusion on step down test test(X±s)
, 百拇医药
Group
Dose / mg*kg-1
Experiment
number
Live
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Learning
Memory
EL/s
Number of errors
SDL/s
EL/s
, 百拇医药
Number of errors
Sham
-
8
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1.88±0.33
132±0.89
0.07±0.14
1.25±1.16
Sci
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1.23±0.44△△
4.50±2.00*△△
1.26±0.93
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Rci
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0.81±0.64
1.25±0.35△△
4.56±1.81△△
Nin
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9
1.39±0.34△△
3.62±2.39*
1.38±0.82
, 百拇医药
1.21±0.18△△
3.50±1.77△
EGB
50
11
8
1.42±0.46△△
3.00±2.62
1.54±0.74
0.58±0.31**△△
1.87±1.81*
, 百拇医药
Sci:single cerebral ischemia;Rci:repeated cerebral ischemial;Nim:nimodipine；△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham；*P<0.05，**P<0.01 vs Rci Tab 2 Influence of repeated cerebral ischemia-reperfusion on step through test(X±s)
Group
Dose /mg*kg-1
Experiment
number
Live
, 百拇医药
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Memory
STL/s
EL/s
Number of
errors
CST/s
STL/s
EL/s
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, 百拇医药
CST/s
Sham
-
9
9
30.16±
11.26
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3.67±
1.50
9.09±
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24.14±
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Sci
-
10
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25.05±
, http://www.100md.com
9.09
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5.25±
2.82
24.04±
16.74△
44.29±
29.72*
2.01±
0.56*
4.25±
, 百拇医药
3.54
11.21±
9.85*
Rci
-
11
8
20.14±
9.56
5.87±
3.57
6.87±
2.95△
, 百拇医药
38.76±
47.96△
12.36±
5.70△
5.02±
3.51
6.62±
3.20△
27.19±
17.53△
Nim
100
, http://www.100md.com
10
7
32.86±
15.88
3.49±
2.23
3.43±
1.72*
8.74±
6.40
99.31±
58.17△△**
, 百拇医药
2.17±
1.51
2.96±
1.34*
5.00±
2.18△*
EGB
50
11
8
30.91±
17.30
, http://www.100md.com 1.66±
0.58△**
1.88±
1.13△△**
4.79±
1.69△
201.09±
102.07△△**
0.98±
0.39△△**
1.25±
, 百拇医药
0.71△△**
1.39±
0.85△△**
△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham; *P<0.05，**P<0.01 vs Rci Tab 3 Influence of repeated cerebral
ischemia-reperfusion on neurons of hippocampas CA1
in mouse(X±s)
Group
, 百拇医药 Dose/mg*kg-1
n
Number of neurons/2 mm-1
Sham-8
-
8
88.25±11.61
Sci
-
8
73.75±7.28△
Rci
, http://www.100md.com
-
9
72.22±5.24△△
Nim
100
8
79.50±6.91*
EGB
50
8
80.25±6.36*
△P<0.05，△△P<0.01 vs Sham； *P<0.05 vs Rci 海马是与学习记忆活动密切相关的重要区域之一，本实验病理学检查表明，反复脑缺血再灌注造成了海马区域神经元不可逆的损伤，可能直接导致了脑缺血小鼠记忆能力的下降。
, 百拇医药
本实验结果显示尼莫地平、EGB等药物具脑缺血保护作用，两药均可不同程度地改善记忆障碍小鼠的学习记忆能力，这进一步验证了本方法的可靠性与稳定性。
我们在实验中还观察到死亡动物中约50%是由于手术操作不慎，误伤折断血管所致(因小鼠血管过细)。若排除血管损伤的原因，反复脑缺血再灌注组小鼠术后存活率可提高到85%左右。另外50%的动物多在缺血再灌注期死亡，可能是由缺血再灌注损伤所致，其机制有待进一步探讨。
缺血性脑血管病研究的最大障碍是缺乏可靠的动物模型。就目前应用较广、脑缺血实验结果较为可靠的血管闭塞法(4VO模型)及局限性大脑中动脉(MCA) 缺血等模型来说，仍具有一定的不足之处[6]：①动物需麻醉，这些实验大多需使用戊巴比妥钠、水合氯醛、乙醚等麻醉剂，有学者认为应避免使用戊巴比妥钠等类制剂，因其对脑缺血性损害有保护作用。②造模费时、复杂，此类实验一般1～2 d才能完成造模过程，均需较复杂的手术操作，有的尚需显微外科手术技巧，有一定难度，且对动物有损伤性，影响实验结果的分析。
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与上述造模方法相比，本方法简便、易行，采用价廉且缺血管解剖近似于人的小鼠作为实验对象，动物不需麻醉，结果稳定、可靠，为研究缺血性脑血管疾病的病理改变、预后及药物的治疗作用等提供了良好的动物模型。
安徽省自然科学基金资助课题，No 95-医-20
作者简介：岑德意，女，46岁，主管技师；
马传庚，男，65岁，教授，博士生导师
岑德意(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
周兰兰(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
明亮(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
江勤(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
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马传庚(安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032)
参考文献
1.谭铭勋. 血管性痴呆.国外医学脑血管疾病分册，1994；2(2)，79～83
2.张 艳，张鹤云，李卫平 et al 安吉复的促智作用研究. 中国药理学通报，1995;11(3)：233～6
3.张均田. 学习、记忆实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社，1991：660～1
4.Shuaib A, Ijaz MS, Miyashita H et al.GABA and glutamate levels in the substantia nigra reticular following repetitive cerebral ischemia in gerbils. EXP Neurol,1997;147(2):311～6
5.Naritomi H. Experimental basis of multi-infarct dementia: memory impairment in rodent models of ischemia. Alzheimer Dis Assoc Disord,1991;5(2):103～6
6.李 泓. 缺血性脑血管病动物模型制作进展.中药新药与临床药理，1995；6(1)：59～62, http://www.100md.com