吗啡依赖及戒断大鼠脊髓和脑干中一氧化氮合酶基因的表达
周文华 谢小虎 刘惠芬 杨国栋
摘 要 目的 观察吗啡依赖或吗啡戒断大鼠脊髓和脑干中一氧化氮合酶(NOS)基因表达的变化。方法 以β-actin为内参照，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定NOS mRNA的表达水平。结果 吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NOS表达水平较正常对照大鼠降低，纳洛酮(4 mg.kg-1,ip)激发大鼠吗啡戒断症状1 h后脊髓和脑干中NOS表达水平明显升高，戒断2 h和4 h后NOS基因表达较1 h 组减少。 NOS抑制剂L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME，10 mg.kg-1)处理后大鼠吗啡戒断症状减少，同时脊髓和脑干的NOS基因表达水平较戒断1h组明显降低。甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)处理组脊髓和脑干中NOS表达水平较戒断1 h组明显降低； 选择性毒蕈碱受体M1拮抗剂 pirenzepine(10 mg.kg-1)处理组动物脊髓中NOS表达水平较戒断1 h组降低,而脑干中NOS表达水平没有改变；NMDA 受体拮抗剂MK 801(0.125 mg.kg-1)处理后脊髓和脑干中NOS表达水平较戒断1 h组没有差异。结论 吗啡慢性处理后脊髓和脑干中NOS mRNA水平降低，抑制内源性NO生成和阻断毒蕈碱受体可以减少吗啡戒断所引起脊髓和脑干中NOS基因的表达。
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关键词：吗啡 阿片依赖 阿片戒断 一氧化氮合酶 毒蕈碱受体
一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种重要的细胞信使分子，广泛参与了神经系统的生理功能调节, 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO生成的关键步骤[1]。生理条件下，兴奋性神经递质如N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)和乙酰胆碱(Ach)作用于突触后膜，刺激钙内流，后者激活依赖于钙和钙调蛋白的NOS，产生NO，NO弥散于突触前膜，激活鸟苷酸环化酶，刺激突触前膜的NMDA和Ach的释放[2]；这种NO的正反馈作用可被胆碱能神经受体激动剂所抑制，而在吗啡依赖或戒断时这种抑制作用减弱[3]。近来，有报道鞘内注射NOS抑制剂可以减轻吗啡镇痛耐受，抑制吗啡戒断症状，这种作用方式与NMDA受体拮抗剂和胆碱能受体拮抗剂的作用方式是一致的[4]。近来研究表明吗啡躯体依赖主要与脊髓和脑干有关[5]，本室也发现吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NOS活力降低，NO生成减少，而吗啡戒断时NOS活力升高，NO生成明显增加，提示吗啡戒断反应时NO的生成增加可能介导了神经递质的释放[6]。但吗啡依赖或戒断时脊髓和脑干的NOS基因表达的变化尚未见报道。本文采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法观察吗啡依赖或戒断以及胆碱能受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂处理后脊髓和脑干中NOS基因表达的变化。
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1 材料和方法
1.1 试剂 吗啡系沈阳制药厂产品(批号970701)，甲基东莨菪碱(scopolamine methyl bromide),纳洛酮，L-N-nitro-arginine methylester(L-NAME) 和 pirenzepine系Sigma公司产品, MK 801系RB I产品。总RNA提取试剂盒，RNA逆转录试剂盒均为Promega公司产品。PCR试剂盒，琼脂糖，PCR Marker系华美公司产品。DEPC系Fluka公司产品。其它试剂均为分析纯。
1.2 动物 ♂，Sprague-Dawley大鼠由上海动物中心提供，体重(250±20) g。参照文献[4] 建立吗啡依赖模型，大鼠皮下注射，首日10 mg.kg-1(bid)，隔日每次增加10 mg.kg-1，至d 6末次注射50 mg.kg-1吗啡，此组动物为吗啡依赖组。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4 mg.kg-1可激发戒断症状，此组动物为吗啡戒断组。纳洛酮激发戒断症状1 h、2 h和4 h后处死的大鼠分别为戒断1 h组、戒断2 h组、戒断4 h组。在纳洛酮激发前30 min腹腔分别注射MK 801(0.125 mg.kg-1)、 pirenzepine(10 mg.kg-1)、甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)和NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)，观察戒断症状1 h后处死的大鼠为不同药物处理组。
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1.3 引物合成 由上海生工生物工程公司合成，参照文献, NOS[7]两条引物序列为：上游引物N1：5′GGT GAA TCC ATA CCA GCC TGA TCC ATG GAA CAC 3′，下游引物N2：5′GGT AAG CTT CTT CTT CCT GTC CGC AAA GCT CAT 3′，扩增长661bp的片段。β-actin[8]的引物序列为：上游引物A：5′TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG 3′，下游引物B：5′CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG 3′，扩增长409 bp的片段。
1.4 总RNA提取 大鼠断头处死，迅速分离取出脊髓和脑干各约100 mg，按试剂盒说明操作，得到RNA沉淀，用20 μl无RNAase的水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0，并用甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量。提取总RNA置于-70℃保存。
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1.5 逆转录RNA 取适量总RNA稀释至240 mg.L-1，65℃变性3 min后，取3 μg(12.5 μl)RNA加入反应缓冲液，总体积为20 μl，包含Tris-HCl 10 mmol.L-1，pH 8.3，KCl 50 mmol.L-1，TritonX-100 0.1%，MgCl2 2.5 mmol.L-1，dNTPs 0.2 mmol.L-1，DTT 5 mmol.L-1，RNA酶抑制剂20U，AMV逆转录酶23U，oligo(dT) 0.5 μg。42℃反应60 min，95℃ 5 min终止反应，加水稀释至100 μl。
1.6 PCR反应 取逆转录反应液20 μl，分别进行NOS和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50 μl，包含Tris-HCl 10 mmol.L-1，pH 8.3，KCl 50 mmol.L-1，Triton X-100 0.1%，MgCl2 1.5 mmol.L-1，dNTPs 0.2 mmol.L-1，DTT 5 mmol.L-1，上、下游引物各50 pmol。94℃变性10 min，加Taq DNA聚合酶2.5 U，再覆盖石蜡油50 μl，94℃变性2 min后进行PCR循环(AMPLITRON公司PCR仪)。条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，完成30个循环后，72℃再延伸10 min，置冰浴中。取15 μl NOS的PCR产物和5 μl β-actin的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，5 V.cm-1，45 min，用自动成像仪(FOTODYNE公司)观察拍照。扩增产物的区带用凝胶扫描仪(STORM860)扫描，计算基因表达的相对含量，数据统计分析应用组间t检验。
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2 结果
2.1 吗啡戒断大鼠脊髓NOS mRNA的变化 提取的RNA甲醛变性凝胶电泳上可以清晰看到28 s和18 s两条带，其亮度之比为2∶1，表明RNA带完整，没有降解，可作为逆转录反应的模板。以N1,N2作引物扩增出的片段长约660 bp，与设计的NOS扩增片段长661 bp相一致。图1显示,与正常对照大鼠相比，吗啡依赖大鼠脊髓NOS mRNA扩增产物降低，而纳洛酮激发大鼠吗啡戒断症状1 h后脊髓NOS mRNA扩增产物明显升高，注射纳洛酮2 h和4 h后 NOS mRNA扩增产物下降，仍较依赖组的mRNA扩增产物多。在纳洛酮激发前30 min吗啡依赖大鼠腹腔注射NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)，pirenzepine(10 mg.kg-1)或者甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)处理，脊髓NOS mRNA扩增产物较吗啡戒断1 h组明显降低,而MK 801(0.125 mg.kg-1)处理后脊髓NOS mRNA扩增产物较吗啡戒断1 h组没有明显改变。图1中以A,B作引物扩增出的片段长约400 bp，与设计的β-actin扩增片段长 409 bp相一致，各组β-actin mRNA扩增产物之间基本相同，且远高于NOS的表达水平。经重复实验的电泳图谱扫描后计算NOS与β-actin的面积比值，结果见表1，东莨菪碱、L-NAME或者pirenzepine处理后NOS的相对表达量较戒断1 h组差异有显著性。
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Fig 1 Agrose gel electrophoresis of NOS and β-actin specific RT-PCR products in spinal cord
A: PCR marker; B: morphine dependence; C: control; D: morphine withdrawal 1 h; E: morphine withdrawal 2 h; F: morphine withdrawal 4 h; G: MK801 treatment; H: pirenzepine treatment; I: scopolamine treatment; J: L-NAME treatment.Upper: the specific product bands for NOS. Lower: the specific product bands for β-actin
2.2 吗啡戒断大鼠脑干NOS mRNA的变化 图2所示，与正常对照大鼠相比，吗啡依赖大鼠脑干NOS mRNA扩增产物轻度降低，纳洛酮激发大鼠吗啡戒断症状1 h组NOS mRNA扩增产物较吗啡依赖组明显升高，2 h和4 h后脑干NOS表达水平较吗啡戒断1 h组和吗啡依赖组NOS mRNA扩增产物减少。在纳洛酮激发前30 min腹腔注射NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)或甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)，脑干NOS mRNA扩增产物较戒断1 h组明显降低, L-NAME处理组脑干NOS mRNA扩增产物的降低更明显。MK 801(0.125 mg.kg-1)和pirenzepine(10 mg.kg-1)处理组动物脑干NOS mRNA扩增产物较戒断1 h组没有差异。图2 显示各处理组动物脑干中β-actin mRNA扩增产物基本相同。图谱扫描后计算NOS与β-actin面积比值，结果显示东莨菪碱和L-NAME处理组脑干中NOS的相对表达量较戒断1 h组差异有显著性(表1)。
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Fig 2 Agrose gel electrophoresis of NOS and β-actin specific RT-PCR products in brainstem
A: PCR marker; B: morphine dependence; C: control; D: morphine withdrawal 1 h; E: morphine withdrawal 2 h; F: morphine withdrawal 4 h; G: MK801 treatment; H: pirenzepine treatment; I: scopolamine treatment; J: L-NAME treatment.Upper: the specific product bands for NOS. Lower: the specific product bands for β-actin.
Tab 1 Relative NOS mRNA levels in spinal cord
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and brainstem(X±s,n=3)
Group
NOS/β-actin ratio
spinal cord
brainstem
Control
0.77±0.05
0.76±0.08
Morphine dependent
0.02±0.01
0.73±0.09
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Morphine withdrawal
0.78±0.07
0.77±0.06
MK-801 pretreated
0.95±0.18
0.84±0.16
Pirenzepine pretreated
0.64±0.05*
0.82±0.17
Scopolamine pretreated
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0.54±0.03**
0.63±0.04*
L-NAME pretreated
0.42±0.03**
0.02±0.01**
*P<0.05,**P<0.01, compared with the morphine withdrawal group
3 讨论
NO作为可弥散的神经递质，通过调节突触前神经元内鸟苷酸环化酶活力和cGMP含量即NO-cGMP途径来发挥作用[1]。近来研究表明吗啡躯体依赖产生的部位主要与脊髓和脑干有关。本文用细胞组成性表达基因β-actin作为逆转录PCR扩增的内参照，经逆转录PCR扩增的NOS mRNA含量可以相对反映NOS基因的转录和表达水平。结果显示吗啡依赖组大鼠脊髓和脑干的NOS mRNA表达均降低，当吗啡戒断反应时脊髓和脑干中NOS mRNA表达明显增加,而β-actin基因的表达在各组之间没有差异。由于纳洛酮是短效阿片受体拮抗剂，作用峰值时间约30 min，吗啡戒断反应1 h内达到高峰，此时脊髓中NOS的表达水平急剧上升达到高峰，脑干中NOS mRNA表达较吗啡依赖组也明显增加，因此，结果提示脊髓和脑干中的NOS基因的表达可能在吗啡依赖或戒断过程中发挥着重要作用。
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NOS活力取决于细胞内mRNA水平，NO量的变化主要取决于NOS的表达水平和活力。作者曾发现吗啡依赖大鼠脊髓和脑干中的NO含量较正常对照组明显降低，纳洛酮激发戒断反应后脊髓和脑干中NO含量增加[6]，这些改变与NOS mRNA的改变是一致的。有报道鞘内注射NOS抑制剂可以减轻吗啡镇痛耐受，抑制吗啡戒断反应，并且它的作用方式与NMDA受体拮抗剂和胆碱能受体拮抗剂的作用是一致的[4]。因此，推测NMDA受体和胆碱能受体与NO之间在吗啡的戒断反应中存在一种内在联系。在纳洛酮激发前30 min注射NOS抑制剂L-NAME或毒蕈碱受体拮抗剂甲基东莨菪碱不仅明显减少吗啡戒断症状，而且L-NAME或东莨菪碱处理组脊髓和脑干的NOS mRNA表达均较吗啡戒断对照组明显减少。以前作者提出吗啡依赖时脊髓和脑干NMDA和Ach的释放减少，NOS mRNA表达降低，NO含量就减少；而戒断反应时突触后产生的NO弥散于突触前膜，与鸟苷酸环化酶偶联可刺激突触前膜NMDA和Ach的大量释放。这种正反馈作用在生理条件可被Ach所抑制，而在吗啡依赖或戒断时这种正反馈作用不被Ach所抑制，可能导致NMDA和Ach的大量释放[9]。L-NAME抑制NOS催化活力和东莨菪碱抑制毒蕈碱受体对NOS酶的激活，均可减少脊髓和脑干的NO含量, 它们既减少了吗啡戒断症状，又抑制戒断引起的NOS基因的表达。因此, 抑制内源性NO的生成可以使NOS基因表达的水平减少，证实了吗啡戒断反应脑干和脊髓中存在NO生成可以使NOS基因表达增加的正反馈途径，吗啡戒断反应过程中存在神经元NOS mRNA表达和NO含量增加再刺激神经递质释放的恶性循环。
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选择性毒蕈碱受体M1拮抗剂pirenzepine 鞘内注射可以呈剂量依赖方式抑制吗啡戒断症状[4]，本实验发现pirenzepine对脊髓中吗啡戒断引起的NOS基因表达有抑制作用，而对脑干中NOS基因表达没有影响，这可能与毒蕈碱受体在中枢神经的不同分布有关。本文中所示剂量的非选择性NMDA受体拮抗剂MK801对吗啡戒断引起的脊髓和脑干中NOS表达不明显，这是否与作用剂量和受体的选择性有关仍需进一步探索。已知在NOS基因的5′调控区有多种能与转录因子结合的顺式作用元件如NF-κB蛋白结合位点等[10]，吗啡急性和慢性处理时转录因子c-fos，c-jun相关早期基因表达减少，而吗啡戒断反应时表达增加[11]；因此在吗啡戒断过程中Ach和去甲肾上腺素等神经递质的大量释放，NOS基因的表达可能受到与这些神经递质偶联的转录因子间接或直接的调控。
*浙江省青年医学人才基金资助课题，No 96013；宁波市青年科研基金资助课题，No 940138
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作者简介：周文华，男，33岁，副研究员，从事阿片依赖和复吸的神经生物学机制研究；
杨国栋，男，62岁，研究员，从事海洛因依赖的机制和防治研究
周文华(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
谢小虎(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
刘惠芬(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
杨国栋(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
参考文献
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1，Bredt DS, Snyder SH. Nitric oxide, a novel neuronal messeger. Neuron, 1992;8:113～6
2，Babey AM, Kolesnikov Y,Cheng J et al. Nitric oxide and opioid tolerance. Neuropharmacology, 1994;33:1463～70
3，周文华，朱 波，张富强 et al.吗啡依赖大鼠脊髓鸟苷酸环化酶对一氧化氮和M受体激动剂反应性研究.中国药物依赖通报,1997；6：22～5
4，杨国栋，周文华，张富强 et al.选择性毒蕈碱受体拮抗剂减轻吗啡耐受和依赖的实验研究.中华医学杂志,1997;77:130～3
5，Nestler EJ. Under siege: the brain on opiate. Neuron,1996;16：897～900
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6，周文华，朱 波，谢小虎 et al.吗啡依赖大鼠脊髓和脑干一氧化氮含量和合酶活力分析.中国药物依赖性杂志, 1998；8:95～7
7，Bredt DS, Hwang PM, Glatt CE et al. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P450 reductase. Nature, 1991;351:714～8
8，Tokunaga K, Taniguchi H, Yoda K et al. Nucleotide sequence of a full-length cDNA for mouse cytoskeletal beta-actin mRNA. Nucleic Acids Res,1986;14:2829～33
9，杨国栋，周文华. 非阿片类药物脱毒的实践. 生物学通报,1998；33:5～7
10，韩，梅, 温进坤.大鼠诱导性一氧化氮合酶基因转录调控区的克隆和鉴定.生物化学杂志，1997;13(5):525～30
11，杨国栋，周文华.阿片成瘾的机制及治疗.中华内科杂志,1997;36(3):209～11, http://www.100md.com
摘 要 目的 观察吗啡依赖或吗啡戒断大鼠脊髓和脑干中一氧化氮合酶(NOS)基因表达的变化。方法 以β-actin为内参照，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定NOS mRNA的表达水平。结果 吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NOS表达水平较正常对照大鼠降低，纳洛酮(4 mg.kg-1,ip)激发大鼠吗啡戒断症状1 h后脊髓和脑干中NOS表达水平明显升高，戒断2 h和4 h后NOS基因表达较1 h 组减少。 NOS抑制剂L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME，10 mg.kg-1)处理后大鼠吗啡戒断症状减少，同时脊髓和脑干的NOS基因表达水平较戒断1h组明显降低。甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)处理组脊髓和脑干中NOS表达水平较戒断1 h组明显降低； 选择性毒蕈碱受体M1拮抗剂 pirenzepine(10 mg.kg-1)处理组动物脊髓中NOS表达水平较戒断1 h组降低,而脑干中NOS表达水平没有改变；NMDA 受体拮抗剂MK 801(0.125 mg.kg-1)处理后脊髓和脑干中NOS表达水平较戒断1 h组没有差异。结论 吗啡慢性处理后脊髓和脑干中NOS mRNA水平降低，抑制内源性NO生成和阻断毒蕈碱受体可以减少吗啡戒断所引起脊髓和脑干中NOS基因的表达。
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关键词：吗啡 阿片依赖 阿片戒断 一氧化氮合酶 毒蕈碱受体
一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种重要的细胞信使分子，广泛参与了神经系统的生理功能调节, 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO生成的关键步骤[1]。生理条件下，兴奋性神经递质如N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)和乙酰胆碱(Ach)作用于突触后膜，刺激钙内流，后者激活依赖于钙和钙调蛋白的NOS，产生NO，NO弥散于突触前膜，激活鸟苷酸环化酶，刺激突触前膜的NMDA和Ach的释放[2]；这种NO的正反馈作用可被胆碱能神经受体激动剂所抑制，而在吗啡依赖或戒断时这种抑制作用减弱[3]。近来，有报道鞘内注射NOS抑制剂可以减轻吗啡镇痛耐受，抑制吗啡戒断症状，这种作用方式与NMDA受体拮抗剂和胆碱能受体拮抗剂的作用方式是一致的[4]。近来研究表明吗啡躯体依赖主要与脊髓和脑干有关[5]，本室也发现吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NOS活力降低，NO生成减少，而吗啡戒断时NOS活力升高，NO生成明显增加，提示吗啡戒断反应时NO的生成增加可能介导了神经递质的释放[6]。但吗啡依赖或戒断时脊髓和脑干的NOS基因表达的变化尚未见报道。本文采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法观察吗啡依赖或戒断以及胆碱能受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂处理后脊髓和脑干中NOS基因表达的变化。
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1 材料和方法
1.1 试剂 吗啡系沈阳制药厂产品(批号970701)，甲基东莨菪碱(scopolamine methyl bromide),纳洛酮，L-N-nitro-arginine methylester(L-NAME) 和 pirenzepine系Sigma公司产品, MK 801系RB I产品。总RNA提取试剂盒，RNA逆转录试剂盒均为Promega公司产品。PCR试剂盒，琼脂糖，PCR Marker系华美公司产品。DEPC系Fluka公司产品。其它试剂均为分析纯。
1.2 动物 ♂，Sprague-Dawley大鼠由上海动物中心提供，体重(250±20) g。参照文献[4] 建立吗啡依赖模型，大鼠皮下注射，首日10 mg.kg-1(bid)，隔日每次增加10 mg.kg-1，至d 6末次注射50 mg.kg-1吗啡，此组动物为吗啡依赖组。吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4 mg.kg-1可激发戒断症状，此组动物为吗啡戒断组。纳洛酮激发戒断症状1 h、2 h和4 h后处死的大鼠分别为戒断1 h组、戒断2 h组、戒断4 h组。在纳洛酮激发前30 min腹腔分别注射MK 801(0.125 mg.kg-1)、 pirenzepine(10 mg.kg-1)、甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)和NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)，观察戒断症状1 h后处死的大鼠为不同药物处理组。
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1.3 引物合成 由上海生工生物工程公司合成，参照文献, NOS[7]两条引物序列为：上游引物N1：5′GGT GAA TCC ATA CCA GCC TGA TCC ATG GAA CAC 3′，下游引物N2：5′GGT AAG CTT CTT CTT CCT GTC CGC AAA GCT CAT 3′，扩增长661bp的片段。β-actin[8]的引物序列为：上游引物A：5′TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG 3′，下游引物B：5′CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG 3′，扩增长409 bp的片段。
1.4 总RNA提取 大鼠断头处死，迅速分离取出脊髓和脑干各约100 mg，按试剂盒说明操作，得到RNA沉淀，用20 μl无RNAase的水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0，并用甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量。提取总RNA置于-70℃保存。
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1.5 逆转录RNA 取适量总RNA稀释至240 mg.L-1，65℃变性3 min后，取3 μg(12.5 μl)RNA加入反应缓冲液，总体积为20 μl，包含Tris-HCl 10 mmol.L-1，pH 8.3，KCl 50 mmol.L-1，TritonX-100 0.1%，MgCl2 2.5 mmol.L-1，dNTPs 0.2 mmol.L-1，DTT 5 mmol.L-1，RNA酶抑制剂20U，AMV逆转录酶23U，oligo(dT) 0.5 μg。42℃反应60 min，95℃ 5 min终止反应，加水稀释至100 μl。
1.6 PCR反应 取逆转录反应液20 μl，分别进行NOS和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50 μl，包含Tris-HCl 10 mmol.L-1，pH 8.3，KCl 50 mmol.L-1，Triton X-100 0.1%，MgCl2 1.5 mmol.L-1，dNTPs 0.2 mmol.L-1，DTT 5 mmol.L-1，上、下游引物各50 pmol。94℃变性10 min，加Taq DNA聚合酶2.5 U，再覆盖石蜡油50 μl，94℃变性2 min后进行PCR循环(AMPLITRON公司PCR仪)。条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，完成30个循环后，72℃再延伸10 min，置冰浴中。取15 μl NOS的PCR产物和5 μl β-actin的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，5 V.cm-1，45 min，用自动成像仪(FOTODYNE公司)观察拍照。扩增产物的区带用凝胶扫描仪(STORM860)扫描，计算基因表达的相对含量，数据统计分析应用组间t检验。
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2 结果
2.1 吗啡戒断大鼠脊髓NOS mRNA的变化 提取的RNA甲醛变性凝胶电泳上可以清晰看到28 s和18 s两条带，其亮度之比为2∶1，表明RNA带完整，没有降解，可作为逆转录反应的模板。以N1,N2作引物扩增出的片段长约660 bp，与设计的NOS扩增片段长661 bp相一致。图1显示,与正常对照大鼠相比，吗啡依赖大鼠脊髓NOS mRNA扩增产物降低，而纳洛酮激发大鼠吗啡戒断症状1 h后脊髓NOS mRNA扩增产物明显升高，注射纳洛酮2 h和4 h后 NOS mRNA扩增产物下降，仍较依赖组的mRNA扩增产物多。在纳洛酮激发前30 min吗啡依赖大鼠腹腔注射NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)，pirenzepine(10 mg.kg-1)或者甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)处理，脊髓NOS mRNA扩增产物较吗啡戒断1 h组明显降低,而MK 801(0.125 mg.kg-1)处理后脊髓NOS mRNA扩增产物较吗啡戒断1 h组没有明显改变。图1中以A,B作引物扩增出的片段长约400 bp，与设计的β-actin扩增片段长 409 bp相一致，各组β-actin mRNA扩增产物之间基本相同，且远高于NOS的表达水平。经重复实验的电泳图谱扫描后计算NOS与β-actin的面积比值，结果见表1，东莨菪碱、L-NAME或者pirenzepine处理后NOS的相对表达量较戒断1 h组差异有显著性。
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Fig 1 Agrose gel electrophoresis of NOS and β-actin specific RT-PCR products in spinal cord
A: PCR marker; B: morphine dependence; C: control; D: morphine withdrawal 1 h; E: morphine withdrawal 2 h; F: morphine withdrawal 4 h; G: MK801 treatment; H: pirenzepine treatment; I: scopolamine treatment; J: L-NAME treatment.Upper: the specific product bands for NOS. Lower: the specific product bands for β-actin
2.2 吗啡戒断大鼠脑干NOS mRNA的变化 图2所示，与正常对照大鼠相比，吗啡依赖大鼠脑干NOS mRNA扩增产物轻度降低，纳洛酮激发大鼠吗啡戒断症状1 h组NOS mRNA扩增产物较吗啡依赖组明显升高，2 h和4 h后脑干NOS表达水平较吗啡戒断1 h组和吗啡依赖组NOS mRNA扩增产物减少。在纳洛酮激发前30 min腹腔注射NOS抑制剂L-NAME(10 mg.kg-1)或甲基东莨菪碱(0.5 mg.kg-1)，脑干NOS mRNA扩增产物较戒断1 h组明显降低, L-NAME处理组脑干NOS mRNA扩增产物的降低更明显。MK 801(0.125 mg.kg-1)和pirenzepine(10 mg.kg-1)处理组动物脑干NOS mRNA扩增产物较戒断1 h组没有差异。图2 显示各处理组动物脑干中β-actin mRNA扩增产物基本相同。图谱扫描后计算NOS与β-actin面积比值，结果显示东莨菪碱和L-NAME处理组脑干中NOS的相对表达量较戒断1 h组差异有显著性(表1)。
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Fig 2 Agrose gel electrophoresis of NOS and β-actin specific RT-PCR products in brainstem
A: PCR marker; B: morphine dependence; C: control; D: morphine withdrawal 1 h; E: morphine withdrawal 2 h; F: morphine withdrawal 4 h; G: MK801 treatment; H: pirenzepine treatment; I: scopolamine treatment; J: L-NAME treatment.Upper: the specific product bands for NOS. Lower: the specific product bands for β-actin.
Tab 1 Relative NOS mRNA levels in spinal cord
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and brainstem(X±s,n=3)
Group
NOS/β-actin ratio
spinal cord
brainstem
Control
0.77±0.05
0.76±0.08
Morphine dependent
0.02±0.01
0.73±0.09
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Morphine withdrawal
0.78±0.07
0.77±0.06
MK-801 pretreated
0.95±0.18
0.84±0.16
Pirenzepine pretreated
0.64±0.05*
0.82±0.17
Scopolamine pretreated
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0.54±0.03**
0.63±0.04*
L-NAME pretreated
0.42±0.03**
0.02±0.01**
*P<0.05,**P<0.01, compared with the morphine withdrawal group
3 讨论
NO作为可弥散的神经递质，通过调节突触前神经元内鸟苷酸环化酶活力和cGMP含量即NO-cGMP途径来发挥作用[1]。近来研究表明吗啡躯体依赖产生的部位主要与脊髓和脑干有关。本文用细胞组成性表达基因β-actin作为逆转录PCR扩增的内参照，经逆转录PCR扩增的NOS mRNA含量可以相对反映NOS基因的转录和表达水平。结果显示吗啡依赖组大鼠脊髓和脑干的NOS mRNA表达均降低，当吗啡戒断反应时脊髓和脑干中NOS mRNA表达明显增加,而β-actin基因的表达在各组之间没有差异。由于纳洛酮是短效阿片受体拮抗剂，作用峰值时间约30 min，吗啡戒断反应1 h内达到高峰，此时脊髓中NOS的表达水平急剧上升达到高峰，脑干中NOS mRNA表达较吗啡依赖组也明显增加，因此，结果提示脊髓和脑干中的NOS基因的表达可能在吗啡依赖或戒断过程中发挥着重要作用。
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NOS活力取决于细胞内mRNA水平，NO量的变化主要取决于NOS的表达水平和活力。作者曾发现吗啡依赖大鼠脊髓和脑干中的NO含量较正常对照组明显降低，纳洛酮激发戒断反应后脊髓和脑干中NO含量增加[6]，这些改变与NOS mRNA的改变是一致的。有报道鞘内注射NOS抑制剂可以减轻吗啡镇痛耐受，抑制吗啡戒断反应，并且它的作用方式与NMDA受体拮抗剂和胆碱能受体拮抗剂的作用是一致的[4]。因此，推测NMDA受体和胆碱能受体与NO之间在吗啡的戒断反应中存在一种内在联系。在纳洛酮激发前30 min注射NOS抑制剂L-NAME或毒蕈碱受体拮抗剂甲基东莨菪碱不仅明显减少吗啡戒断症状，而且L-NAME或东莨菪碱处理组脊髓和脑干的NOS mRNA表达均较吗啡戒断对照组明显减少。以前作者提出吗啡依赖时脊髓和脑干NMDA和Ach的释放减少，NOS mRNA表达降低，NO含量就减少；而戒断反应时突触后产生的NO弥散于突触前膜，与鸟苷酸环化酶偶联可刺激突触前膜NMDA和Ach的大量释放。这种正反馈作用在生理条件可被Ach所抑制，而在吗啡依赖或戒断时这种正反馈作用不被Ach所抑制，可能导致NMDA和Ach的大量释放[9]。L-NAME抑制NOS催化活力和东莨菪碱抑制毒蕈碱受体对NOS酶的激活，均可减少脊髓和脑干的NO含量, 它们既减少了吗啡戒断症状，又抑制戒断引起的NOS基因的表达。因此, 抑制内源性NO的生成可以使NOS基因表达的水平减少，证实了吗啡戒断反应脑干和脊髓中存在NO生成可以使NOS基因表达增加的正反馈途径，吗啡戒断反应过程中存在神经元NOS mRNA表达和NO含量增加再刺激神经递质释放的恶性循环。
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选择性毒蕈碱受体M1拮抗剂pirenzepine 鞘内注射可以呈剂量依赖方式抑制吗啡戒断症状[4]，本实验发现pirenzepine对脊髓中吗啡戒断引起的NOS基因表达有抑制作用，而对脑干中NOS基因表达没有影响，这可能与毒蕈碱受体在中枢神经的不同分布有关。本文中所示剂量的非选择性NMDA受体拮抗剂MK801对吗啡戒断引起的脊髓和脑干中NOS表达不明显，这是否与作用剂量和受体的选择性有关仍需进一步探索。已知在NOS基因的5′调控区有多种能与转录因子结合的顺式作用元件如NF-κB蛋白结合位点等[10]，吗啡急性和慢性处理时转录因子c-fos，c-jun相关早期基因表达减少，而吗啡戒断反应时表达增加[11]；因此在吗啡戒断过程中Ach和去甲肾上腺素等神经递质的大量释放，NOS基因的表达可能受到与这些神经递质偶联的转录因子间接或直接的调控。
*浙江省青年医学人才基金资助课题，No 96013；宁波市青年科研基金资助课题，No 940138
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作者简介：周文华，男，33岁，副研究员，从事阿片依赖和复吸的神经生物学机制研究；
杨国栋，男，62岁，研究员，从事海洛因依赖的机制和防治研究
周文华(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
谢小虎(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
刘惠芬(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
杨国栋(浙江小宁波市微循环与莨菪类药研究所.宁波戒毒研究中心，宁波 315010)
参考文献
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