应用共聚焦激光扫描技术研究阿片受体介导胞内Ca2+增高的调节机制
应用共聚焦激光扫描技术研究阿片受体介导胞内
Ca2+增高的调节机制
臧梦维 沈琦 孙越 汪青 刘景生
摘 要 目的 观察阿片激动剂急性和长时程作用于稳定表达iNOS基因的NG-LNCXiNOS细胞，对细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响及G-蛋白的调节作用。方法 应用共聚焦显微镜和荧光探针Fluo-3，监测单细胞[Ca2+]i含量变化。结果 δ-阿片激动剂 DPDPE 和吗啡急性刺激细胞诱发[Ca2+]i增加，纳洛酮对其起翻转作用；用百日咳毒素预处理细胞后，吗啡急性刺激不能引起[Ca2+]i增加；DPDPE 和吗啡长时程处理细胞，再用相应的阿片激动剂急性刺激也造成[Ca2+]i增加，但[Ca2+]i增加水平较低，用纳洛酮戒断造成[Ca2+]i明显增加。结论 阿片激动剂诱发[Ca2+]i增加是由阿片受体介导的，受对 PTX 敏感的 G-蛋白调节，当细胞发生阿片耐受和依赖时，表现为受体介导Ca2+系统的脱敏现象。
, 百拇医药
关键词：δ-阿片受体 阿片类药物依赖 细胞内游离钙 G-蛋白 共聚焦激光扫描
NG108-15细胞含有δ-阿片受体、NMDA受体等，是研究受体后信号传导机制的良好细胞模型，但其诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达很低，为研究NMDA-NO-cGMP信号系统在阿片耐受依赖形成中的作用，笔者以 NG108-15 细胞为靶细胞，获得稳定表达重组iNOS 基因的 NG-LNCXiNOS 细胞株[1，2]，用阿片激动剂长时程作用于该细胞株，对腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)-cAMP 系统抑制效应减弱，用纳洛酮急性戒断，cAMP反跳性增加，表现为阿片受体脱敏和下调，从而建立阿片耐受和依赖的细胞模型[3]。为进一步了解δ-阿片受体和细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的关系，本研究应用新型荧光探针 Fluo-3 负载细胞，用激光扫描共聚焦显微镜动态监测荧光值变化以反映单细胞[Ca2+]i含量，观察阿片激动剂急性和长时程作用于 NG-LNCXiNOS 细胞对[Ca2+]i的影响及G-蛋白的调节作用。
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材料和方法
药品和仪器 高选择性δ-阿片受体激动剂 DPDPE (D-Pen2，D-Pen5-enkephalin),吗啡，纳洛酮，百日咳毒素(pertussis toxin，PTX) 和荧光染料探针 Fluo-3/AM 为 Sigma公司产品；共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。
细胞株和细胞培养 神经母细胞瘤和神经胶质瘤的杂交 NG108-15 细胞常规培养方法参照文献[4]。参照文献[1，2] 的方法建立稳定表达 iNOS 基因的克隆 NG-LNCXiNOS 细胞株。
样本制备 采用 Fluo-3/AM 荧光法[5]。细胞密度1×103/ml，Fluo-3 终浓度 2 μg/ml， 共聚焦激光扫描显微镜测定，有稳定荧光值基础值后，观察加药前后细胞的荧光值变化。
, 百拇医药
共聚焦激光扫描显微镜观察 参照文献[6]的方法。采用 5 W 氩离子激光，激发波长为全波长。采集数据间隔时间为10～20 s,并绘制药物引起胞内Ca2+荧光值变化的时间曲线。
结 果
阿片激动剂急性刺激引起胞内[Ca2+]i增加及纳洛酮的翻转作用 在NG108-15 细胞培养皿中加入终浓度为 100 nmol/L 的 DPDPE，可见[Ca2+]i逐渐升高至2.7，再向培养基中加入 10 μmol/L纳洛酮，其荧光值逐渐下降(图1)。
图 1 δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发 NG108-15 细胞
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[Ca2+]i增加及纳洛酮的拮抗作用
Fig 1 Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on [Ca2+]i and antagonistic action of naloxone in neuroblastoma×glioma hybrid NG108-15 cell
A.DPDPE; B.naloxone;* measured value/basal value
图 2 δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发细胞[Ca2+]i增加及纳洛酮的拮抗作用
, 百拇医药
Fig 2 Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on [Ca2+]i and antagonistic action of naloxone in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；B.naloxone;*measured value /basal value
在新建立稳定表达 iNOS 基因细胞，预先加入同样浓度 DPDPE，荧光值由基础水平升高至2.5，加入10 μmol/L纳洛酮后，荧光值逐渐下降，但仍高于基础水平(图2)。若预先加入10 μmol/L纳洛酮，本身不引起[Ca2+]i升高，然后再加入100 nmol/L DPDPE，[Ca2+]i荧光值仍处于基础水平，未出现[Ca2+]i增加的反应(图3)。本实验还观察到10 μmol/L 吗啡刺激[Ca2+]i增加，荧光值接近3.0，但10 μmol/L纳洛酮可完全拮抗吗啡使[Ca2+]i增加的作用(图4)。
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G蛋白对阿片激动剂诱导胞内Ca2+变化的调节作用 在未用 PTX 预处理的NG-LNCXiNOS细胞，吗啡诱导[Ca2+]i升高(图4)；而用 100 ng/ml PTX 预孵细胞24 h ,再加入10 μmol/L 吗啡，测定[Ca2+]i荧光值几乎没有变化，PTX完全阻断吗啡诱导[Ca2+]i升高的效应(图5)。
图 3 纳洛酮(10 μmol/L)阻断DPDPE诱发的细胞[Ca2+]i增加
Fig 3 DPDPE-induced[Ca2+]i elevation was blocked by naloxone(10 μmol/L) in NG-LNCXiNOS cell
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A.naloxone;B.DPDPE;*measured value /basal value
图 4 纳洛酮拮抗吗啡诱导的NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加
Fig 4 The morphine-induced [Ca2+]i increase was antagonized by naloxone in NG-LNCXiNOS cell
A.morphine;B.naloxone
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图 5 百日咳毒素(100 ng/ml)预处理 NG-LNCXiNOS 细胞对吗啡诱导[Ca2+]i增加的影响
Fig 5 Effect of pertussis toxin (100 ng/ml) pretreatment on morphine-induced increase in [Ca2+]i in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；* measured value/basal value
图 6 纳洛酮对 DPDPE 长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加的影响
, 百拇医药
Fig 6 The effect of naloxone on [Ca2+]i increase induced by long-term pretreatment with DPDPE in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；B.naloxone;* measured value /basal value
阿片激动剂长时程作用对胞内Ca2+的调节作用 用l μmol/L DPDPE 长时程处理细胞 48 h,再用100 nmol/L DPDPE 急性刺激细胞，[Ca2+]i荧光值上升至1.5左右，若加入10 μmol/L 纳洛酮荧光值持续上升达4.5，阿片类物质长时程作用可引起胞内Ca2+增加程度减弱，表现为 DPDPE 急性诱发[Ca2+]i增加作用发生脱敏(图6)。
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用10 μmol/L吗啡预孵细胞48 h，再加入l μmol/L吗啡急性刺激，使[Ca2+]i增加至1.5左右，加入10 μmol/L 纳洛酮急性戒断引起[Ca2+]i荧光值异常升高为4.0(图7)。
图 7 纳洛酮对吗啡长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加的影响
Fig 7 The effect of naloxone on [Ca2+]i increase induced by long-term pretreatment with morphine in NG-LNCXiNOS cell
, 百拇医药
A. morphine;B. naloxone;* measured value/basal value
讨 论
Ca2+在中枢神经系统功能中起着重要作用，它直接做为第二信使，参与神经信号的传递和神经递质的释放。在对吗啡耐受和依赖的动物，脑组织细胞内Ca2+增多，介导Ca2+内流的Ca2+通道开放增加。Fluo-3 作为第三代荧光探针，适用于监测Ca2+空间分布和细胞内Ca2+浓度的连续变化[5]。高分辨率共聚焦激光扫描显微镜的发展促进了关于Ca2+在细胞信息传递作用中的研究[7]。本研究用共聚焦激光扫描技术观察阿片激动剂急性和长时程作用于 NG-LNCXiNOS 细胞对[Ca2+]i的影响及G-蛋白的调节作用。发现不同阿片激动剂急性刺激NG-LNCXiNOS细胞，引起[Ca2+]i升高，纳洛酮能翻转该作用，且在NG108-15细胞也获得类似结果。用PTX预处理细胞后，能完全阻断吗啡诱导[Ca2+]i升高的作用，表明阿片激动剂诱发[Ca2+]i升高是由阿片受体介导，通过PTX敏感的G-蛋白耦联到δ-阿片受体进行调节，这与Jin等[8]用indo-l作为荧光指示剂，证实δ-阿片激动剂DADLE引起[Ca2+]i升高的作用也可被纳洛酮所翻转的结果一致。本研究表明，纳洛酮仅部分拮抗δ-阿片受体选择性激动剂引起的[Ca2+]i增加，但完全拮抗吗啡诱导的[Ca2+]i增加，这可能是由于吗啡和纳洛酮系非选择性阿片受体激动剂和拮抗剂，主要作用于μ受体。进一步研究发现阿片激动剂长时程作用于细胞，与阿片激动剂急性刺激作用不同，[Ca2+]i升高的程度较小，加入纳洛酮后，不但不能阻断[Ca2+]i升高，反而引起[Ca2+]i异常升高，表现出受体脱敏，这与笔者以前发现阿片激动剂长时程作用于NG-LNCXiNOS细胞，使DPDPE对腺苷酸环化酶活性急性抑制作用减弱，且纳洛酮急性戒断造成AC活性反弹性增高，诱发受体脱敏和下调的结果相吻合[3]。据文献报道，δ-阿片受体激动剂作用于ND8-47神经细胞和心肌细胞上G-蛋白耦联阿片受体，诱导[Ca2+]i升高，阿片类药物长时程作用引起[Ca2+]i增加作用明显减弱，这是由于阿片受体脱敏所致[9，10]。
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G-蛋白耦联到阿片受体调节Ca2+通道的机制可能为：(1) G-蛋白与耦联的效应蛋白Ca2+通道之间存在直接作用；(2) G-蛋白耦联到阿片受体其他效应蛋白，如腺苷酸环化酶或三磷酸肌醇(IP3)[11，12]。IP3作用于内质网IP3敏感的钙库，打开Ca2+通道，促进内质网释放Ca2+，使Ca2+动员增多；(3) Na+通道开放或K+通道关闭引起膜去极化，Ca2+通道大量开放；(4) DPDPE 作用于SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株，引起Ca2+动员增多，导致胞内Ca2+浓度升高[13，14]。在分别稳定表达δ-，μ-和κ-受体的3种神经细胞株中，用相应受体的选择性激动剂DADLE、DAMGO和U50488H分别处理这3个细胞株，均引起Ca2+增加，而未转染的neuro2 a细胞对阿片激动剂无明显反应。去除胞外Ca2+不能阻断阿片激动剂诱导[Ca2+]i增加的反应，提示[Ca2+]i增加是胞内Ca2+库释放增多所致[15]。本实验由阿片激动剂引起胞内Ca2+增加是否为阿片受体产生的兴奋效应，[Ca2+]i升高的来源是胞外Ca2+内流增多，还是胞内Ca2+动员增多，值得深入研究。■
, 百拇医药
国家自然科学基金(39670827)资助
臧梦维(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
沈琦(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
孙越(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
汪青(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
刘景生(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
参考文献
[1]Zang MW,Peng XX,Hu P，et al.Construction of an inducible nitric oxide synthase gene transferring vector mediated by retrovirus. Acta Pharmacol Sin,1998,19:121-127
, 百拇医药
[2]臧梦维，沈 琦，汪 青，等.逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达.生物化学和生物物理学报，1999，31(3)：18-23
[3]臧梦维，沈 琦，汪 青，等.阿片类药物对诱导型NO合酶稳定表达神经细胞受体介导AC-cAMP 系统的影响.药学学报，1999，34(7)：484-490
[4]Breivogel CS,Selley DE,Childer SR.Acute and chronic effects of opioids on δ and μ receptor activation of G proteins in NG108-15 and SK-N-SH cell membranes.J Neurochem,1997,68:1462-1472
[5]Yorek MA,Davidson EP,Dunlap JA,et al.Effects of bradykinin on cytosolic calcium in neuroblastoma cells using the fluorescent indicator fluo-3.Biochim Biophys Acta,1993,1177:215-220
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[6]Gundo HR,RaoG,Jamed GW.Monitoring signal transduction and cytoskeleton alteration by fluorescent imaging and confocal microscopy.Ann New York Acad Sci,1994,774:297-300
[7]Brakenhoff GJ,Visscher K.Imaging models for bilateral confocal scanning microscopy.J Microsc,1993,171:17-26
[8]Jin W,Lee NM,Loh HH,et al.Dual excitatory and inhibitory effects of opioids on intracellular calcium in neuroblastoma×glioma hybrid NG108-15 cells.Mol Pharmacol,1992,42:1083-1089
, 百拇医药
[9]Tang TL,Kiang JG.Opioid-induced increase in [Ca2+]i in ND8-47 neuroblastoma×dorsal root ganglion hybrid cells is mediated through G-protein coupled δ-opioid receptors and desensitized by chronic exposure to opioid.J Neurochemistry,1995,65:1612-1621
[10]Huang XD,Wong TM.Morphine and(D-ALA2,NME-Phe4,GLY-OL)-enkephalin increase the intracellular free calcium in isolated rat myocytes-effect of naloxone or pretreatment with morphine.Life Sci,1991,48:1101-1107
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[11]Wu G,Lu ZH,Alfinito P,et al.Opioid receptor and calcium channel regulation of adenylyl cyclase,modulated by GMl,in NG108-15 cells.Neurochem Res,1997,22:1281-1289
[12]Ventura C,Spurgeon H,Lakatta EG,et al.κ and δ opioid receptor stimulation affects cardiac myocyte function and Ca2+release from an intracellular pool in myocytes and neurons. Cir Res,1992,70:66-81
[13]Connor M,Henderson G.Delta-and mu-opioid receptor mobilization of intracellular calcium in SH-SY5Y human neuroblastoma cells.Br J Pharmacol,1996,117:333-340
, 百拇医药
[14]Connor M,Yeo A,Henderson G.Neuropeptide YY2 receptor and somatostatin sst2 receptor coupling to mobilization of intracellular calcium in SH-SY5Y human neuroblastoma cells.Br J Pharmacol,1997,120:455-463
[15]Spencer RJ,Jin W,Thayer SA,et al.Mobilization of Ca2+from intracellular stores in transfected neuro2a cells by activation of multiple opioid receptor subtypes.Biochem Pharmacol,1997,54:809-818, 百拇医药
Ca2+增高的调节机制
臧梦维 沈琦 孙越 汪青 刘景生
摘 要 目的 观察阿片激动剂急性和长时程作用于稳定表达iNOS基因的NG-LNCXiNOS细胞，对细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响及G-蛋白的调节作用。方法 应用共聚焦显微镜和荧光探针Fluo-3，监测单细胞[Ca2+]i含量变化。结果 δ-阿片激动剂 DPDPE 和吗啡急性刺激细胞诱发[Ca2+]i增加，纳洛酮对其起翻转作用；用百日咳毒素预处理细胞后，吗啡急性刺激不能引起[Ca2+]i增加；DPDPE 和吗啡长时程处理细胞，再用相应的阿片激动剂急性刺激也造成[Ca2+]i增加，但[Ca2+]i增加水平较低，用纳洛酮戒断造成[Ca2+]i明显增加。结论 阿片激动剂诱发[Ca2+]i增加是由阿片受体介导的，受对 PTX 敏感的 G-蛋白调节，当细胞发生阿片耐受和依赖时，表现为受体介导Ca2+系统的脱敏现象。
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关键词：δ-阿片受体 阿片类药物依赖 细胞内游离钙 G-蛋白 共聚焦激光扫描
NG108-15细胞含有δ-阿片受体、NMDA受体等，是研究受体后信号传导机制的良好细胞模型，但其诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达很低，为研究NMDA-NO-cGMP信号系统在阿片耐受依赖形成中的作用，笔者以 NG108-15 细胞为靶细胞，获得稳定表达重组iNOS 基因的 NG-LNCXiNOS 细胞株[1，2]，用阿片激动剂长时程作用于该细胞株，对腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)-cAMP 系统抑制效应减弱，用纳洛酮急性戒断，cAMP反跳性增加，表现为阿片受体脱敏和下调，从而建立阿片耐受和依赖的细胞模型[3]。为进一步了解δ-阿片受体和细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的关系，本研究应用新型荧光探针 Fluo-3 负载细胞，用激光扫描共聚焦显微镜动态监测荧光值变化以反映单细胞[Ca2+]i含量，观察阿片激动剂急性和长时程作用于 NG-LNCXiNOS 细胞对[Ca2+]i的影响及G-蛋白的调节作用。
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材料和方法
药品和仪器 高选择性δ-阿片受体激动剂 DPDPE (D-Pen2，D-Pen5-enkephalin),吗啡，纳洛酮，百日咳毒素(pertussis toxin，PTX) 和荧光染料探针 Fluo-3/AM 为 Sigma公司产品；共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。
细胞株和细胞培养 神经母细胞瘤和神经胶质瘤的杂交 NG108-15 细胞常规培养方法参照文献[4]。参照文献[1，2] 的方法建立稳定表达 iNOS 基因的克隆 NG-LNCXiNOS 细胞株。
样本制备 采用 Fluo-3/AM 荧光法[5]。细胞密度1×103/ml，Fluo-3 终浓度 2 μg/ml， 共聚焦激光扫描显微镜测定，有稳定荧光值基础值后，观察加药前后细胞的荧光值变化。
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共聚焦激光扫描显微镜观察 参照文献[6]的方法。采用 5 W 氩离子激光，激发波长为全波长。采集数据间隔时间为10～20 s,并绘制药物引起胞内Ca2+荧光值变化的时间曲线。
结 果
阿片激动剂急性刺激引起胞内[Ca2+]i增加及纳洛酮的翻转作用 在NG108-15 细胞培养皿中加入终浓度为 100 nmol/L 的 DPDPE，可见[Ca2+]i逐渐升高至2.7，再向培养基中加入 10 μmol/L纳洛酮，其荧光值逐渐下降(图1)。
图 1 δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发 NG108-15 细胞
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[Ca2+]i增加及纳洛酮的拮抗作用
Fig 1 Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on [Ca2+]i and antagonistic action of naloxone in neuroblastoma×glioma hybrid NG108-15 cell
A.DPDPE; B.naloxone;* measured value/basal value
图 2 δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发细胞[Ca2+]i增加及纳洛酮的拮抗作用
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Fig 2 Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on [Ca2+]i and antagonistic action of naloxone in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；B.naloxone;*measured value /basal value
在新建立稳定表达 iNOS 基因细胞，预先加入同样浓度 DPDPE，荧光值由基础水平升高至2.5，加入10 μmol/L纳洛酮后，荧光值逐渐下降，但仍高于基础水平(图2)。若预先加入10 μmol/L纳洛酮，本身不引起[Ca2+]i升高，然后再加入100 nmol/L DPDPE，[Ca2+]i荧光值仍处于基础水平，未出现[Ca2+]i增加的反应(图3)。本实验还观察到10 μmol/L 吗啡刺激[Ca2+]i增加，荧光值接近3.0，但10 μmol/L纳洛酮可完全拮抗吗啡使[Ca2+]i增加的作用(图4)。
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G蛋白对阿片激动剂诱导胞内Ca2+变化的调节作用 在未用 PTX 预处理的NG-LNCXiNOS细胞，吗啡诱导[Ca2+]i升高(图4)；而用 100 ng/ml PTX 预孵细胞24 h ,再加入10 μmol/L 吗啡，测定[Ca2+]i荧光值几乎没有变化，PTX完全阻断吗啡诱导[Ca2+]i升高的效应(图5)。
图 3 纳洛酮(10 μmol/L)阻断DPDPE诱发的细胞[Ca2+]i增加
Fig 3 DPDPE-induced[Ca2+]i elevation was blocked by naloxone(10 μmol/L) in NG-LNCXiNOS cell
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A.naloxone;B.DPDPE;*measured value /basal value
图 4 纳洛酮拮抗吗啡诱导的NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加
Fig 4 The morphine-induced [Ca2+]i increase was antagonized by naloxone in NG-LNCXiNOS cell
A.morphine;B.naloxone
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图 5 百日咳毒素(100 ng/ml)预处理 NG-LNCXiNOS 细胞对吗啡诱导[Ca2+]i增加的影响
Fig 5 Effect of pertussis toxin (100 ng/ml) pretreatment on morphine-induced increase in [Ca2+]i in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；* measured value/basal value
图 6 纳洛酮对 DPDPE 长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加的影响
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Fig 6 The effect of naloxone on [Ca2+]i increase induced by long-term pretreatment with DPDPE in NG-LNCXiNOS cell
A.DPDPE；B.naloxone;* measured value /basal value
阿片激动剂长时程作用对胞内Ca2+的调节作用 用l μmol/L DPDPE 长时程处理细胞 48 h,再用100 nmol/L DPDPE 急性刺激细胞，[Ca2+]i荧光值上升至1.5左右，若加入10 μmol/L 纳洛酮荧光值持续上升达4.5，阿片类物质长时程作用可引起胞内Ca2+增加程度减弱，表现为 DPDPE 急性诱发[Ca2+]i增加作用发生脱敏(图6)。
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用10 μmol/L吗啡预孵细胞48 h，再加入l μmol/L吗啡急性刺激，使[Ca2+]i增加至1.5左右，加入10 μmol/L 纳洛酮急性戒断引起[Ca2+]i荧光值异常升高为4.0(图7)。
图 7 纳洛酮对吗啡长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞[Ca2+]i增加的影响
Fig 7 The effect of naloxone on [Ca2+]i increase induced by long-term pretreatment with morphine in NG-LNCXiNOS cell
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A. morphine;B. naloxone;* measured value/basal value
讨 论
Ca2+在中枢神经系统功能中起着重要作用，它直接做为第二信使，参与神经信号的传递和神经递质的释放。在对吗啡耐受和依赖的动物，脑组织细胞内Ca2+增多，介导Ca2+内流的Ca2+通道开放增加。Fluo-3 作为第三代荧光探针，适用于监测Ca2+空间分布和细胞内Ca2+浓度的连续变化[5]。高分辨率共聚焦激光扫描显微镜的发展促进了关于Ca2+在细胞信息传递作用中的研究[7]。本研究用共聚焦激光扫描技术观察阿片激动剂急性和长时程作用于 NG-LNCXiNOS 细胞对[Ca2+]i的影响及G-蛋白的调节作用。发现不同阿片激动剂急性刺激NG-LNCXiNOS细胞，引起[Ca2+]i升高，纳洛酮能翻转该作用，且在NG108-15细胞也获得类似结果。用PTX预处理细胞后，能完全阻断吗啡诱导[Ca2+]i升高的作用，表明阿片激动剂诱发[Ca2+]i升高是由阿片受体介导，通过PTX敏感的G-蛋白耦联到δ-阿片受体进行调节，这与Jin等[8]用indo-l作为荧光指示剂，证实δ-阿片激动剂DADLE引起[Ca2+]i升高的作用也可被纳洛酮所翻转的结果一致。本研究表明，纳洛酮仅部分拮抗δ-阿片受体选择性激动剂引起的[Ca2+]i增加，但完全拮抗吗啡诱导的[Ca2+]i增加，这可能是由于吗啡和纳洛酮系非选择性阿片受体激动剂和拮抗剂，主要作用于μ受体。进一步研究发现阿片激动剂长时程作用于细胞，与阿片激动剂急性刺激作用不同，[Ca2+]i升高的程度较小，加入纳洛酮后，不但不能阻断[Ca2+]i升高，反而引起[Ca2+]i异常升高，表现出受体脱敏，这与笔者以前发现阿片激动剂长时程作用于NG-LNCXiNOS细胞，使DPDPE对腺苷酸环化酶活性急性抑制作用减弱，且纳洛酮急性戒断造成AC活性反弹性增高，诱发受体脱敏和下调的结果相吻合[3]。据文献报道，δ-阿片受体激动剂作用于ND8-47神经细胞和心肌细胞上G-蛋白耦联阿片受体，诱导[Ca2+]i升高，阿片类药物长时程作用引起[Ca2+]i增加作用明显减弱，这是由于阿片受体脱敏所致[9，10]。
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G-蛋白耦联到阿片受体调节Ca2+通道的机制可能为：(1) G-蛋白与耦联的效应蛋白Ca2+通道之间存在直接作用；(2) G-蛋白耦联到阿片受体其他效应蛋白，如腺苷酸环化酶或三磷酸肌醇(IP3)[11，12]。IP3作用于内质网IP3敏感的钙库，打开Ca2+通道，促进内质网释放Ca2+，使Ca2+动员增多；(3) Na+通道开放或K+通道关闭引起膜去极化，Ca2+通道大量开放；(4) DPDPE 作用于SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株，引起Ca2+动员增多，导致胞内Ca2+浓度升高[13，14]。在分别稳定表达δ-，μ-和κ-受体的3种神经细胞株中，用相应受体的选择性激动剂DADLE、DAMGO和U50488H分别处理这3个细胞株，均引起Ca2+增加，而未转染的neuro2 a细胞对阿片激动剂无明显反应。去除胞外Ca2+不能阻断阿片激动剂诱导[Ca2+]i增加的反应，提示[Ca2+]i增加是胞内Ca2+库释放增多所致[15]。本实验由阿片激动剂引起胞内Ca2+增加是否为阿片受体产生的兴奋效应，[Ca2+]i升高的来源是胞外Ca2+内流增多，还是胞内Ca2+动员增多，值得深入研究。■
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国家自然科学基金(39670827)资助
臧梦维(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
沈琦(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
孙越(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
汪青(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
刘景生(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室, 北京 100005)
参考文献
[1]Zang MW,Peng XX,Hu P，et al.Construction of an inducible nitric oxide synthase gene transferring vector mediated by retrovirus. Acta Pharmacol Sin,1998,19:121-127
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[2]臧梦维，沈 琦，汪 青，等.逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达.生物化学和生物物理学报，1999，31(3)：18-23
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