超声波对鼠胚胎生长发育及其分泌生长因子的影响
李真 顾美礼 王智彪 胡凯 艾玲 杜永洪
摘 要 目的：研究超声波对小鼠胚胎生长发育及其分泌表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)功能的影响。方法：将正常及经超声波照射组的小鼠二细胞胚胎体外培养至囊胚期,观测其生长发育状况, 同时用放免法/酶免法检测胚胎培养液中EGF、TGF-β1、IGF-Ⅱ的含量并进行比较,用原位杂交法检测两组胚胎TGF-β1mRNA的表达。 结果：1、两组胚胎的各项形态学指标比较,差异非常显著(P<0.01)。2、正常组胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ的含量显著高于超声波照射组(P<0.01),且EGF、IGF-Ⅱ含量与胚胎生长发育的形态学指标呈正相关。3、两组胚胎培养液中TGF-β1含量差异无显著性(P>0.05),但超声波照射组TGF-β1mRNA表达明显弱于正常组。结论：超声波能对早期胚胎造成损伤,合成、分泌生长因子功能下降,从而使其生长发育受阻。
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关键词：超声波 鼠胚胎 生长因子
在胚胎生长发育及着床过程中,除激素外还有许多生物活性物质参与调控,其中生长因子的作用倍受关注。研究显示,小鼠着床前及围着床期胚胎在生长发育过程中能产生某些生长因子,以自分泌及/或旁分泌的方式促进其自身生长发育及着床〔1～4〕。超声波能对胚胎造成损害,影响其生长发育及着床,但其作用机理尚不十分清楚。据此,本试验选择与胚胎生长发育有关的具有代表性的三种生长因子(表皮生长因子EGF、转化生长因子-β1、TGF-β1、胰岛素样生长因子-Ⅱ IGF-Ⅱ)作为研究对象,以小鼠胚胎体外培养系统为模型,研究超声波对胚胎生长发育及其合成、分泌上述生长因子的影响及相互关系。
资料与方法
动物:ICR系实验小白鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
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主要试剂:孕马血清(pregnant mare′s serum gonadotropin PMSG)购自天津实验动物中心;绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin hCG)购自宁波市激素制品厂;Ham′s F-12培养液购自美国Sigma公司; 125 I-EGF放射免疫分析试剂盒购自中国原子能科学研究院; 125 I-IGF-Ⅱ放射免疫分析试剂盒及TGF-β1EASIA试剂盒购自天津四方化工有限公司。TGF-β1mRNA原位杂交检测试剂盒: 购自武汉博士德生物工程有限公司,内含地高辛标记的cDNA探针,探针长度为1Kb。
方法:8周～10周雌鼠经PMSG+hCG促排卵后以雌:雄=2:1合笼,次晨查见阴栓为妊娠第一天。于注射hCG后48小时～50小时取二细胞胚,将其分为A、B两组:A组:正常胚胎;B组:超声波照射组,用JC-A型超声治疗仪,以0.8MHz,40W/cm2,连续波照射胚胎5秒钟〔5〕。两组胚胎均置于96孔细胞培养板中,30个胚/孔,每孔为一个样本,每组各50个样本。每孔加入400μ1胚胎培养液,在37℃,5%CO2条件下培养,每24小时换液1/2,收集胚胎培养液,-20℃保存待测量;培养72小时后在倒置显微镜下计数发育至桑椹胚的胚胎数,并进行形态学评分(标准见参考文献〔6〕),算出每孔累积胚胎评分(cumulative embryo score,CES=每孔胚胎的平均得分×发育至桑椹胚的胚胎数)。用放射免疫法测各样本胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ的含量,用酶联免疫法测 TGF-β1含量。TGF-β1mRNA原位杂交操作按试剂盒使用说明书进行,以博士德生物工程有限公司提供的小鼠肝脏石蜡切片为阳性对照,以PBS液代替探针作为阴性对照。
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结果以X±s表示,用t检验对两组胚胎的形态学指标及各生长因子含量进行比较;对各生长因子含量与胚胎的形态学指标进行直线回归的相关性检验。因目前尚无小鼠各生长因子的定量标准品,批间误差较难控制,故仅对同批的实验结果进行统计学分析。
结 果
1、两组胚胎的形态学指标比较
两组胚胎的平均形态学评分、平均每孔发育至桑椹胚的胚胎数、平均累积胚胎评分(CES)见表1。A、B两组间上述各项指标差异均非常显著,P<0.01。
表1 两组胚胎形态学指标比较
组别
平均形态学评分/孔
桑椹胚数/孔
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CES
A组
2.23±0.80
13.52±2.52
30.15±4.66
B组
1.17±0.43
5.17±1.61
6.05±2.21
2、胚胎培养液中生长因子含量测定结果
A、B两组胚胎培养液中各生长因子含量测定结果见表2。A组胚胎EGF、IGF-Ⅱ的分泌量显著高于B组(P<0.01),而A组TGF-β1的分泌量虽高于B组,但统计学处理差异无显著性(P>0.05)。表2 两组胚胎培养液中各生长因子含量
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组别
EGF(ng/ml)
TGF-β1(ng/ml)
IGF-Ⅱ(ng/ml)
A组
183.25±33.60
134.69±42.70
2.99±0.68
B组
95.84±23.30
112.07±38.90
1.52±0.23
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3、生长因子分泌量与胚胎质量形态学指标的相关性分析
为进一步了解胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ含量测定与胚胎生长发育状况的关系,分别以A组胚胎培养液中的EGF、IGF-Ⅱ含量为自变量X,每孔胚胎形态学评分、每孔累积胚胎评分(CES)为应变量Y进行直线回归相关性检验,结果EGF和IGF-Ⅱ含量与胚胎形态学评分及CES均呈正相关,表明胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ的多少能够反映其生长发育状况。
4、TGF-β1mRNA原位杂交结果
阳性对照片上可见黄褐色阳性颗粒,阴性对照片则无着色。A、B两组胚胎细胞胞浆区均有黄褐色着色,表明有TGF-β1mRNA表达,但B组胚胎细胞着色明显浅于A组,提示异常组胚胎TGF-β1mRNA表达弱于正常胚胎。讨 论
1、生长因子在胚胎生长发育过程中的作用
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哺乳动物着床前及围着床期胚胎的生长发育受诸多因素的调控,大量的研究显示多种生长因子在此过程中起重要作用。对小鼠的研究结果显示:(1)、小鼠合子或二细胞胚体外培养至囊胚期者,其生长发育状况与培养液中胚胎密度呈正相关,即在胚胎密度为1、0.1、0.01、0.001个/μ1四组中,胚胎密度越高,发育到囊胚期的胚胎越多,每一胚胎的细胞数越多,而死亡的胚胎数越少,提示胚胎能产生某种内源性的因子,促其自身生长发育; (2)、着床前胚胎能表达多种生长因子及其受体的mRNA及蛋白,说明胚胎能够合成、分泌生长因子,并通过其自身受体与之结合,产生生物学效应; (3)、胚胎培养液中能检测到某些生长因子, 如PAF、IGF-Ⅱ、TGF-α等,进一步证明胚胎能合成并分泌生长因子; (4)、在胚胎培养液中加入生长因子(如EGF、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、TGF-α、TGF-β1、PAF等), 能显著促进胚胎细胞的增生与分化,表明生长因子能与胚胎细胞上其受体结合,促进胚胎的生长发育; (5)、在胚胎培养液中加入抗生长因子抗体或受体抑制剂, 能阻断上述作用; (6)、用基因重组技术阻断生长因子引起细胞增殖、分化的信号传导通路,可消除生长因子对胚胎生长发育的促进作用,激活该通路,则恢复生长因子对胚胎生长发育的促进作用。上述试验结果表明着床前胚胎能产生、分泌多种生长因子, 以自分泌的方式促进其生长发育〔1～4〕。
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2、超声波对胚胎的影响
随着诊断超声在产科领域的广泛应用,其对胚胎生长发育的影响日益受到重视,近年来,又有人用治疗剂量超声照射胚胎, 达到终止妊娠的目的。研究发现,超声波对胚胎生长发育的影响呈剂量-效应性关系,即胚胎损伤程度随照射强度、时间的加强及/或延长而加重。诊断超声能使妊娠6周～11周的胚囊及其绒毛发生形态学改变,RNA合成可逆性下降,超氧化物歧化酶活性下降,β-葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-氨基已糖苷酶活性不同程度改变,胚胎生长发育受到抑制〔7〕。治疗超声的声强较诊断超声高105倍甚或更高,通过温热及空化效应使胚胎出现肿胀退化、变性坏死, 胎盘出血等一系列改变,最终导致胚胎死亡、流产, 从而达到终止妊娠的目的〔5〕。
3、超声波对胚胎合成、分泌生长因子的影响及其与胚胎生长发育的关系
超声波对着床前及围着床期胚胎生长发育的影响及其机理方面的研究尚较少,本试验选择使胚胎生长发育受损但又不致死的超声剂量,研究超声波对胚胎分泌生长因子的影响及其与胚胎生长发育的关系。结果显示:(1)超声波照射后胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ显著减少, 胚胎生长发育受到明显抑制,且EGF、IGF-Ⅱ分泌量与胚胎生长发育状况呈正相关,提示超声波照射损伤胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ功能,从而抑制其生长发育; (2)、超声波照射组TGF-β1分泌量与正常组比较无显著性差异;原位杂交显示超声波照射后胚胎细胞TGF-β1mRNA表达明显弱于正常组,表明超声波使胚胎表达TGF-β1mRNA受到抑制,但由于影响其最终分泌量的因素较多,致使两组胚胎培养液中TGF-β1含量差异无显著性。
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超声波对胚胎生长发育的影响及其机理的研究才刚刚起步,不少方面仍为空白。本文仅就超声波对胚胎合成、分泌三种具有代表性的生长因子(EGF、IGF-Ⅱ、TGF-β1)的影响及其与胚胎生长发育的关系作了初步的探讨,由于影响胚胎生长发育的因素有许多, 这方面的研究将进一步深入进行下去。
顾美礼(400010 重庆市, 重庆医科大学附属第二医院妇产科)
李真(现在:重庆第三军医大学附属新桥医院妇产科)
王智彪(重庆医科大学医学超声工程研究所)
胡凯(重庆医科大学医学超声工程研究所)
艾玲(重庆医科大学医学超声工程研究所)
杜永洪(重庆医科大学医学超声工程研究所)
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参考文献
1 O′Neill C.Evidence for the requirement of autocrine growth factors for development of mouse preimplantation embryos in vitro.Biol Reprod,1997,56:229～237.
2 Teruel M, Smith R.Effect of embryo density and growth factors on in vitro preimplantation development of mouse embryos.Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam,1997,47:87～96.
3 Liu HC,He ZY,Mele CA,et al.Human endometrial stromal cells improve embryo quality by enhancing the expression of insulin like growth factors and their receptors in cocultured human preimplantation embryos.Fertil Steril,1999,71:361～367.
, 百拇医药
4 Simom C,Moreno C,Romohi J,et al.Cytokines and embryo implantation.J Reprod Immuno，1998，39：117～131.
5 王智彪,顾美礼,凌罗达,等。超声波对妊娠第七天小鼠的抗孕研究。中国超声医学杂志,1995,11:201～206.
6 张丽珠,魏志新,刘 平,等。体外受精—胚胎移植中影响临床妊娠的因素。中华妇产科杂志,1998,33:727～730.
7 于廷和,王智彪,蔡汉钟。超声波对胚胎组织的生物学效应。中国超声医学杂志,1997,13(1):58～60., 百拇医药
摘 要 目的：研究超声波对小鼠胚胎生长发育及其分泌表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)功能的影响。方法：将正常及经超声波照射组的小鼠二细胞胚胎体外培养至囊胚期,观测其生长发育状况, 同时用放免法/酶免法检测胚胎培养液中EGF、TGF-β1、IGF-Ⅱ的含量并进行比较,用原位杂交法检测两组胚胎TGF-β1mRNA的表达。 结果：1、两组胚胎的各项形态学指标比较,差异非常显著(P<0.01)。2、正常组胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ的含量显著高于超声波照射组(P<0.01),且EGF、IGF-Ⅱ含量与胚胎生长发育的形态学指标呈正相关。3、两组胚胎培养液中TGF-β1含量差异无显著性(P>0.05),但超声波照射组TGF-β1mRNA表达明显弱于正常组。结论：超声波能对早期胚胎造成损伤,合成、分泌生长因子功能下降,从而使其生长发育受阻。
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关键词：超声波 鼠胚胎 生长因子
在胚胎生长发育及着床过程中,除激素外还有许多生物活性物质参与调控,其中生长因子的作用倍受关注。研究显示,小鼠着床前及围着床期胚胎在生长发育过程中能产生某些生长因子,以自分泌及/或旁分泌的方式促进其自身生长发育及着床〔1～4〕。超声波能对胚胎造成损害,影响其生长发育及着床,但其作用机理尚不十分清楚。据此,本试验选择与胚胎生长发育有关的具有代表性的三种生长因子(表皮生长因子EGF、转化生长因子-β1、TGF-β1、胰岛素样生长因子-Ⅱ IGF-Ⅱ)作为研究对象,以小鼠胚胎体外培养系统为模型,研究超声波对胚胎生长发育及其合成、分泌上述生长因子的影响及相互关系。
资料与方法
动物:ICR系实验小白鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
, 百拇医药
主要试剂:孕马血清(pregnant mare′s serum gonadotropin PMSG)购自天津实验动物中心;绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin hCG)购自宁波市激素制品厂;Ham′s F-12培养液购自美国Sigma公司; 125 I-EGF放射免疫分析试剂盒购自中国原子能科学研究院; 125 I-IGF-Ⅱ放射免疫分析试剂盒及TGF-β1EASIA试剂盒购自天津四方化工有限公司。TGF-β1mRNA原位杂交检测试剂盒: 购自武汉博士德生物工程有限公司,内含地高辛标记的cDNA探针,探针长度为1Kb。
方法:8周～10周雌鼠经PMSG+hCG促排卵后以雌:雄=2:1合笼,次晨查见阴栓为妊娠第一天。于注射hCG后48小时～50小时取二细胞胚,将其分为A、B两组:A组:正常胚胎;B组:超声波照射组,用JC-A型超声治疗仪,以0.8MHz,40W/cm2,连续波照射胚胎5秒钟〔5〕。两组胚胎均置于96孔细胞培养板中,30个胚/孔,每孔为一个样本,每组各50个样本。每孔加入400μ1胚胎培养液,在37℃,5%CO2条件下培养,每24小时换液1/2,收集胚胎培养液,-20℃保存待测量;培养72小时后在倒置显微镜下计数发育至桑椹胚的胚胎数,并进行形态学评分(标准见参考文献〔6〕),算出每孔累积胚胎评分(cumulative embryo score,CES=每孔胚胎的平均得分×发育至桑椹胚的胚胎数)。用放射免疫法测各样本胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ的含量,用酶联免疫法测 TGF-β1含量。TGF-β1mRNA原位杂交操作按试剂盒使用说明书进行,以博士德生物工程有限公司提供的小鼠肝脏石蜡切片为阳性对照,以PBS液代替探针作为阴性对照。
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结果以X±s表示,用t检验对两组胚胎的形态学指标及各生长因子含量进行比较;对各生长因子含量与胚胎的形态学指标进行直线回归的相关性检验。因目前尚无小鼠各生长因子的定量标准品,批间误差较难控制,故仅对同批的实验结果进行统计学分析。
结 果
1、两组胚胎的形态学指标比较
两组胚胎的平均形态学评分、平均每孔发育至桑椹胚的胚胎数、平均累积胚胎评分(CES)见表1。A、B两组间上述各项指标差异均非常显著,P<0.01。
表1 两组胚胎形态学指标比较
组别
平均形态学评分/孔
桑椹胚数/孔
, 百拇医药
CES
A组
2.23±0.80
13.52±2.52
30.15±4.66
B组
1.17±0.43
5.17±1.61
6.05±2.21
2、胚胎培养液中生长因子含量测定结果
A、B两组胚胎培养液中各生长因子含量测定结果见表2。A组胚胎EGF、IGF-Ⅱ的分泌量显著高于B组(P<0.01),而A组TGF-β1的分泌量虽高于B组,但统计学处理差异无显著性(P>0.05)。表2 两组胚胎培养液中各生长因子含量
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组别
EGF(ng/ml)
TGF-β1(ng/ml)
IGF-Ⅱ(ng/ml)
A组
183.25±33.60
134.69±42.70
2.99±0.68
B组
95.84±23.30
112.07±38.90
1.52±0.23
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3、生长因子分泌量与胚胎质量形态学指标的相关性分析
为进一步了解胚胎培养液中EGF、IGF-Ⅱ含量测定与胚胎生长发育状况的关系,分别以A组胚胎培养液中的EGF、IGF-Ⅱ含量为自变量X,每孔胚胎形态学评分、每孔累积胚胎评分(CES)为应变量Y进行直线回归相关性检验,结果EGF和IGF-Ⅱ含量与胚胎形态学评分及CES均呈正相关,表明胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ的多少能够反映其生长发育状况。
4、TGF-β1mRNA原位杂交结果
阳性对照片上可见黄褐色阳性颗粒,阴性对照片则无着色。A、B两组胚胎细胞胞浆区均有黄褐色着色,表明有TGF-β1mRNA表达,但B组胚胎细胞着色明显浅于A组,提示异常组胚胎TGF-β1mRNA表达弱于正常胚胎。讨 论
1、生长因子在胚胎生长发育过程中的作用
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哺乳动物着床前及围着床期胚胎的生长发育受诸多因素的调控,大量的研究显示多种生长因子在此过程中起重要作用。对小鼠的研究结果显示:(1)、小鼠合子或二细胞胚体外培养至囊胚期者,其生长发育状况与培养液中胚胎密度呈正相关,即在胚胎密度为1、0.1、0.01、0.001个/μ1四组中,胚胎密度越高,发育到囊胚期的胚胎越多,每一胚胎的细胞数越多,而死亡的胚胎数越少,提示胚胎能产生某种内源性的因子,促其自身生长发育; (2)、着床前胚胎能表达多种生长因子及其受体的mRNA及蛋白,说明胚胎能够合成、分泌生长因子,并通过其自身受体与之结合,产生生物学效应; (3)、胚胎培养液中能检测到某些生长因子, 如PAF、IGF-Ⅱ、TGF-α等,进一步证明胚胎能合成并分泌生长因子; (4)、在胚胎培养液中加入生长因子(如EGF、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、TGF-α、TGF-β1、PAF等), 能显著促进胚胎细胞的增生与分化,表明生长因子能与胚胎细胞上其受体结合,促进胚胎的生长发育; (5)、在胚胎培养液中加入抗生长因子抗体或受体抑制剂, 能阻断上述作用; (6)、用基因重组技术阻断生长因子引起细胞增殖、分化的信号传导通路,可消除生长因子对胚胎生长发育的促进作用,激活该通路,则恢复生长因子对胚胎生长发育的促进作用。上述试验结果表明着床前胚胎能产生、分泌多种生长因子, 以自分泌的方式促进其生长发育〔1～4〕。
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2、超声波对胚胎的影响
随着诊断超声在产科领域的广泛应用,其对胚胎生长发育的影响日益受到重视,近年来,又有人用治疗剂量超声照射胚胎, 达到终止妊娠的目的。研究发现,超声波对胚胎生长发育的影响呈剂量-效应性关系,即胚胎损伤程度随照射强度、时间的加强及/或延长而加重。诊断超声能使妊娠6周～11周的胚囊及其绒毛发生形态学改变,RNA合成可逆性下降,超氧化物歧化酶活性下降,β-葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-氨基已糖苷酶活性不同程度改变,胚胎生长发育受到抑制〔7〕。治疗超声的声强较诊断超声高105倍甚或更高,通过温热及空化效应使胚胎出现肿胀退化、变性坏死, 胎盘出血等一系列改变,最终导致胚胎死亡、流产, 从而达到终止妊娠的目的〔5〕。
3、超声波对胚胎合成、分泌生长因子的影响及其与胚胎生长发育的关系
超声波对着床前及围着床期胚胎生长发育的影响及其机理方面的研究尚较少,本试验选择使胚胎生长发育受损但又不致死的超声剂量,研究超声波对胚胎分泌生长因子的影响及其与胚胎生长发育的关系。结果显示:(1)超声波照射后胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ显著减少, 胚胎生长发育受到明显抑制,且EGF、IGF-Ⅱ分泌量与胚胎生长发育状况呈正相关,提示超声波照射损伤胚胎分泌EGF、IGF-Ⅱ功能,从而抑制其生长发育; (2)、超声波照射组TGF-β1分泌量与正常组比较无显著性差异;原位杂交显示超声波照射后胚胎细胞TGF-β1mRNA表达明显弱于正常组,表明超声波使胚胎表达TGF-β1mRNA受到抑制,但由于影响其最终分泌量的因素较多,致使两组胚胎培养液中TGF-β1含量差异无显著性。
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超声波对胚胎生长发育的影响及其机理的研究才刚刚起步,不少方面仍为空白。本文仅就超声波对胚胎合成、分泌三种具有代表性的生长因子(EGF、IGF-Ⅱ、TGF-β1)的影响及其与胚胎生长发育的关系作了初步的探讨,由于影响胚胎生长发育的因素有许多, 这方面的研究将进一步深入进行下去。
顾美礼(400010 重庆市, 重庆医科大学附属第二医院妇产科)
李真(现在:重庆第三军医大学附属新桥医院妇产科)
王智彪(重庆医科大学医学超声工程研究所)
胡凯(重庆医科大学医学超声工程研究所)
艾玲(重庆医科大学医学超声工程研究所)
杜永洪(重庆医科大学医学超声工程研究所)
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参考文献
1 O′Neill C.Evidence for the requirement of autocrine growth factors for development of mouse preimplantation embryos in vitro.Biol Reprod,1997,56:229～237.
2 Teruel M, Smith R.Effect of embryo density and growth factors on in vitro preimplantation development of mouse embryos.Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam,1997,47:87～96.
3 Liu HC,He ZY,Mele CA,et al.Human endometrial stromal cells improve embryo quality by enhancing the expression of insulin like growth factors and their receptors in cocultured human preimplantation embryos.Fertil Steril,1999,71:361～367.
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4 Simom C,Moreno C,Romohi J,et al.Cytokines and embryo implantation.J Reprod Immuno，1998，39：117～131.
5 王智彪,顾美礼,凌罗达,等。超声波对妊娠第七天小鼠的抗孕研究。中国超声医学杂志,1995,11:201～206.
6 张丽珠,魏志新,刘 平,等。体外受精—胚胎移植中影响临床妊娠的因素。中华妇产科杂志,1998,33:727～730.
7 于廷和,王智彪,蔡汉钟。超声波对胚胎组织的生物学效应。中国超声医学杂志,1997,13(1):58～60., 百拇医药