高通量筛选系统
高通量筛选系统
李元
摘 要 本文简要介绍高通量筛选系统的基本概念及其在新药研究中的作用和发展现状，强调了基因组研究成果和发展新型筛选模型的密切关系，并对国内新药研究中的问题提出了个人见解。
关键词:高通量筛选 新药筛选 重组蛋白靶位 自动化分析
人类健康与药物治疗密不可分，其中新药的研究与开发占有极其重要的地位，受到国内外该领域研究者的高度重视。
近年来，由于自动化技术，特别是机器人的应用，在新药研究中出现了高通量筛选(high throughput screening, HTS)体系，该系统将组合化学、基因组研究、生物信息和自动化仪器、机器人等先进技术进行了有机组合，创造了一种发现新药的新程序[1]。
, 百拇医药
据报道，90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选75 000个样品；到了1997年HTS发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选1 000 000个样品；而到1999年，由于HTS的进一步完善，每天的筛选量就高达100 000种化合物[2]，因而，称之为超高通量筛选(ultrahigh-throughput screening)。这种新的飞跃，将大大加速新药发现的速度。
HTS系统应用和推广的关键在于必须具备相应的新药筛选模型。近年来以基因表达产物为模型建立的新药筛选模型为HTS的应用提供了有利条件。人类基因组及后基因组研究取得的巨大成就，必将对新药的研究产生重大的影响。如根据人类重要疾病的种类，以每种疾病可能涉及的基因及每种基因产物在致病过程中可能与之相关的蛋白的相互作用数目概算，予计基因组研究的结果可提供5 000～10 000种分子药靶，靶位数目将超过以往的20余倍。
与G-蛋白结合的受体是新药研究中的重要靶位之一，为了使筛选过程能够符合HTS的需要，Mark等[3]报道，将异源G-蛋白结合受体基因在酿酒酵母细胞中进行表达，在此基础上发展了一种对配基高度敏感的选择性检测方法。以该检测法对组合化学库及若干5-羟色胺衍生物进行了高通量筛选，结果获得了与G-蛋白结合的5-羟色胺受体的新型配基，其中某些配基具有体内活性，可能具有应用前景。正如Channa等[4]指出，作为适于进行高通量筛选的基因表达体系有多种，酵母细胞是主要表达体系之一，例如人M1型毒蕈碱受体、M5型毒蕈碱乙酰胆碱受体、一种改造过的小鼠5-羟色胺受体、人多巴胺D2S受体等可在酿酒酵母中进行表达；小鼠5-羟色胺受体、腺苷酶A2a基因能和G蛋白嵌合并在同种酵母中表达。此外，离子通道、酪氨酸激酶、哺乳类的肽激素及其胞外结合的配基蛋白等，也能在该体系中进行有效表达。
, 百拇医药
哺乳动物细胞也是重要的表达系统，目前已经获得了cAMP多重反应因子或TPA反应因子转录控制下的荧光素酶报告基因质粒的稳定细胞株。将人多巴胺D1和D5受体基因、神经激肽NK1、NK2和NK3基因在上述稳定细胞株中进行表达，结果显示配基与报告基因表达产物具有结合活性，表明该表达体系可用于HTS研究。将荧光素酶报告基因和用荧光染料测定胞内离子通量结合起来的FLIPRase的实验，可用于筛选在一种细胞系中能同多种G蛋白结合的受体激动剂或拮抗剂。昆虫细胞株也是重要的真核表达系统，细胞色素P450s在许多结构各异的药物及其他异生素(xenobiotics)的氧化代谢中起主要作用，研究表明许多药物间的相互作用是通过抑制细胞色素P450s的代谢的机制起作用的。Crespi等[5]使P450s基因在昆虫细胞中成功地表达，并以重组的P450s为靶位建立了简易自动检测方法；从而为筛选抑制细胞色素P450s酶的候选药物提供基础。本实验室在昆虫细胞sf9中成功地克隆和表达了白细胞介素-1受体(IL-1R)，并以重组IL-1R蛋白为靶位建立了新型的ELISA筛选模型，进一步的实验表明，该模型可用于高通量筛选。本组采用上述模型对数千株微生物产物进行了受体拮抗剂的筛选，结果获得了若干阳性菌株。其中链霉菌139所产生的拮抗剂139A，经化学纯化证明为多糖，其体内活性研究表明此多糖对类风湿性关节炎具有显著抑制作用，有可能发展成为具有临床应用前景的新药[6]。此外，原核表达体系如大肠杆菌、链霉菌及其他微生物所表达的重组蛋白也可作为药靶，可在此基础上建立起适用于HTS的实验方法。
, 百拇医药
当前基因组序列研究和延伸表达序列标记(ETS)资料显示，许多基因的功能尚不清楚，但其中很多基因表达产物可能是细胞膜受体，后者的天然配基可能成为激动剂和拮抗剂的重要新靶位。
以基因表达产物为靶位建立的药物筛选模型与传统模型相比，具有以下突出优点：(1) 靶位专一、特异性强，因此假阳性率低；(2) 通过基因克隆扩增可以获得足够量的某些因含量低而无法提取的靶位物质；(3) 与采用动物及其组织提取物的方法比较，费用明显降低；(4) 所建立的模型适用于 HTS 全自动快速大量筛选的新体系。
至于用于 HTS 中的检测方法，大多以 ELISA 方法为基础，其目的在于确定配基和受体的相互作用。目前多采用荧光或酶标比色方法代替同位素标记法。此外，所使用的酶标板也已从传统96孔发展至384、1 536甚至3 456孔，实验样品的体积也从 400 μl 减少至 5～10 μl。从而不但使价格降低了100倍，而且操作也更简便了。
, 百拇医药
采用 HTS 进行筛选的样品主要有组合化学库、天然化合物、化学合成化合物、反义核酸、肽核酸、可溶性蛋白等，目前已将生物芯片技术用于 HTS 药物筛选研究，如正在改进 Caliper′s 显微流态芯片以用于 HTS。
为了适应新药研究的需要，国外已建立了若干专门从事 HTS 药物筛选研究的公司，每个公司具有其独特的筛选模型和检测方法，并和相应的大型制药公司建立固定的合作和商业关系，例如美国 Aurora Biosciences 公司在高度敏感的荧光检测实验和以 3 456孔酶标板进行的超级高通量筛选(UHTS)方面具有优势，并和 Warmer-Lambert、 Bristaol-Myers Squibb、 Eli Lilly、 Hofman-LaRoche、 Pharmacia & Upjohn、 Becton-Dicinson 及 Cytovia 等公司都有密切合作的关系。为了适用于机器人进行自动 ELISA 实验，已推出各种型号工作站如 Tecan Genesis robotic workstation。由此可见，如何发现更多新的药靶，并在此基础上建立各种特异性强的新的筛选模型，是促进新药筛选研究的关键因素。随着人类和模式生物基因组及后基因组研究的飞速发展，其结果必将极大地推动新药的相关研究。
, 百拇医药
目前我国有关 HTS 在新药研究中的应用尚处于初期阶段，和国外相比差距较大，尽管少数研究单位已装备有机器人自动工作站；但是，研究适用于 HTS 的新型筛选模型的工作却严重滞后，因此无法充分发挥设备的应有作用，致使有的筛选中心实验室全年筛选量尚不及国外同类实验室一天的工作量。此外单位之间也缺乏有效地合作，不能使设备优势和模型研究优势互补。我国即将加入 WTO，对医药工业而言，面临着重大的挑战和空前的机遇，只有走创新的道路、研制具有我国自主知识产权的新型药物，才能振兴我国民族医药工业；而HTS系统的应用将会极大地促进新药的发展，并使我国医药工业在世界之林能占据应有的一席之地。
李元(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所生物工程室，北京 100050)
参考文献
1，John GH, Martyn B. The chemical-biological interface: developments in automated and miniaturised screening technology. Curr Opin Biotechnol, 1997, 8:734-740
, 百拇医药
2，Alan D. Drug screening-beyond the bottleneck. Nature Biotechnol, 1999, 17: 859-863
3，Mark HP. G-protein-coupled receptors in Saccharomyces cerevisial: high-throughput screening assays for drug discovery. TIBTECK, 1997, 15: 487-494
4，Channa. KJ, Thomas AK. Gene expression systems in the development of high-throughput screen. Curr Opin Biotechnol, 1997,8: 629-634
5，Crespi CL, Miller VP, Perman BW. Microtiter plate assays for inhibition of human drug-metabolizing cytochromes P450. Anal Biochem, 1997, 248: 188-190
6，吴 倩，吴剑波，李 元. 白细胞介素-1受体拮抗剂139的研究. 中国抗生素杂志， 1999， 24(6)： 401-408, 百拇医药
李元
摘 要 本文简要介绍高通量筛选系统的基本概念及其在新药研究中的作用和发展现状，强调了基因组研究成果和发展新型筛选模型的密切关系，并对国内新药研究中的问题提出了个人见解。
关键词:高通量筛选 新药筛选 重组蛋白靶位 自动化分析
人类健康与药物治疗密不可分，其中新药的研究与开发占有极其重要的地位，受到国内外该领域研究者的高度重视。
近年来，由于自动化技术，特别是机器人的应用，在新药研究中出现了高通量筛选(high throughput screening, HTS)体系，该系统将组合化学、基因组研究、生物信息和自动化仪器、机器人等先进技术进行了有机组合，创造了一种发现新药的新程序[1]。
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据报道，90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选75 000个样品；到了1997年HTS发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选1 000 000个样品；而到1999年，由于HTS的进一步完善，每天的筛选量就高达100 000种化合物[2]，因而，称之为超高通量筛选(ultrahigh-throughput screening)。这种新的飞跃，将大大加速新药发现的速度。
HTS系统应用和推广的关键在于必须具备相应的新药筛选模型。近年来以基因表达产物为模型建立的新药筛选模型为HTS的应用提供了有利条件。人类基因组及后基因组研究取得的巨大成就，必将对新药的研究产生重大的影响。如根据人类重要疾病的种类，以每种疾病可能涉及的基因及每种基因产物在致病过程中可能与之相关的蛋白的相互作用数目概算，予计基因组研究的结果可提供5 000～10 000种分子药靶，靶位数目将超过以往的20余倍。
与G-蛋白结合的受体是新药研究中的重要靶位之一，为了使筛选过程能够符合HTS的需要，Mark等[3]报道，将异源G-蛋白结合受体基因在酿酒酵母细胞中进行表达，在此基础上发展了一种对配基高度敏感的选择性检测方法。以该检测法对组合化学库及若干5-羟色胺衍生物进行了高通量筛选，结果获得了与G-蛋白结合的5-羟色胺受体的新型配基，其中某些配基具有体内活性，可能具有应用前景。正如Channa等[4]指出，作为适于进行高通量筛选的基因表达体系有多种，酵母细胞是主要表达体系之一，例如人M1型毒蕈碱受体、M5型毒蕈碱乙酰胆碱受体、一种改造过的小鼠5-羟色胺受体、人多巴胺D2S受体等可在酿酒酵母中进行表达；小鼠5-羟色胺受体、腺苷酶A2a基因能和G蛋白嵌合并在同种酵母中表达。此外，离子通道、酪氨酸激酶、哺乳类的肽激素及其胞外结合的配基蛋白等，也能在该体系中进行有效表达。
, 百拇医药
哺乳动物细胞也是重要的表达系统，目前已经获得了cAMP多重反应因子或TPA反应因子转录控制下的荧光素酶报告基因质粒的稳定细胞株。将人多巴胺D1和D5受体基因、神经激肽NK1、NK2和NK3基因在上述稳定细胞株中进行表达，结果显示配基与报告基因表达产物具有结合活性，表明该表达体系可用于HTS研究。将荧光素酶报告基因和用荧光染料测定胞内离子通量结合起来的FLIPRase的实验，可用于筛选在一种细胞系中能同多种G蛋白结合的受体激动剂或拮抗剂。昆虫细胞株也是重要的真核表达系统，细胞色素P450s在许多结构各异的药物及其他异生素(xenobiotics)的氧化代谢中起主要作用，研究表明许多药物间的相互作用是通过抑制细胞色素P450s的代谢的机制起作用的。Crespi等[5]使P450s基因在昆虫细胞中成功地表达，并以重组的P450s为靶位建立了简易自动检测方法；从而为筛选抑制细胞色素P450s酶的候选药物提供基础。本实验室在昆虫细胞sf9中成功地克隆和表达了白细胞介素-1受体(IL-1R)，并以重组IL-1R蛋白为靶位建立了新型的ELISA筛选模型，进一步的实验表明，该模型可用于高通量筛选。本组采用上述模型对数千株微生物产物进行了受体拮抗剂的筛选，结果获得了若干阳性菌株。其中链霉菌139所产生的拮抗剂139A，经化学纯化证明为多糖，其体内活性研究表明此多糖对类风湿性关节炎具有显著抑制作用，有可能发展成为具有临床应用前景的新药[6]。此外，原核表达体系如大肠杆菌、链霉菌及其他微生物所表达的重组蛋白也可作为药靶，可在此基础上建立起适用于HTS的实验方法。
, 百拇医药
当前基因组序列研究和延伸表达序列标记(ETS)资料显示，许多基因的功能尚不清楚，但其中很多基因表达产物可能是细胞膜受体，后者的天然配基可能成为激动剂和拮抗剂的重要新靶位。
以基因表达产物为靶位建立的药物筛选模型与传统模型相比，具有以下突出优点：(1) 靶位专一、特异性强，因此假阳性率低；(2) 通过基因克隆扩增可以获得足够量的某些因含量低而无法提取的靶位物质；(3) 与采用动物及其组织提取物的方法比较，费用明显降低；(4) 所建立的模型适用于 HTS 全自动快速大量筛选的新体系。
至于用于 HTS 中的检测方法，大多以 ELISA 方法为基础，其目的在于确定配基和受体的相互作用。目前多采用荧光或酶标比色方法代替同位素标记法。此外，所使用的酶标板也已从传统96孔发展至384、1 536甚至3 456孔，实验样品的体积也从 400 μl 减少至 5～10 μl。从而不但使价格降低了100倍，而且操作也更简便了。
, 百拇医药
采用 HTS 进行筛选的样品主要有组合化学库、天然化合物、化学合成化合物、反义核酸、肽核酸、可溶性蛋白等，目前已将生物芯片技术用于 HTS 药物筛选研究，如正在改进 Caliper′s 显微流态芯片以用于 HTS。
为了适应新药研究的需要，国外已建立了若干专门从事 HTS 药物筛选研究的公司，每个公司具有其独特的筛选模型和检测方法，并和相应的大型制药公司建立固定的合作和商业关系，例如美国 Aurora Biosciences 公司在高度敏感的荧光检测实验和以 3 456孔酶标板进行的超级高通量筛选(UHTS)方面具有优势，并和 Warmer-Lambert、 Bristaol-Myers Squibb、 Eli Lilly、 Hofman-LaRoche、 Pharmacia & Upjohn、 Becton-Dicinson 及 Cytovia 等公司都有密切合作的关系。为了适用于机器人进行自动 ELISA 实验，已推出各种型号工作站如 Tecan Genesis robotic workstation。由此可见，如何发现更多新的药靶，并在此基础上建立各种特异性强的新的筛选模型，是促进新药筛选研究的关键因素。随着人类和模式生物基因组及后基因组研究的飞速发展，其结果必将极大地推动新药的相关研究。
, 百拇医药
目前我国有关 HTS 在新药研究中的应用尚处于初期阶段，和国外相比差距较大，尽管少数研究单位已装备有机器人自动工作站；但是，研究适用于 HTS 的新型筛选模型的工作却严重滞后，因此无法充分发挥设备的应有作用，致使有的筛选中心实验室全年筛选量尚不及国外同类实验室一天的工作量。此外单位之间也缺乏有效地合作，不能使设备优势和模型研究优势互补。我国即将加入 WTO，对医药工业而言，面临着重大的挑战和空前的机遇，只有走创新的道路、研制具有我国自主知识产权的新型药物，才能振兴我国民族医药工业；而HTS系统的应用将会极大地促进新药的发展，并使我国医药工业在世界之林能占据应有的一席之地。
李元(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所生物工程室，北京 100050)
参考文献
1，John GH, Martyn B. The chemical-biological interface: developments in automated and miniaturised screening technology. Curr Opin Biotechnol, 1997, 8:734-740
, 百拇医药
2，Alan D. Drug screening-beyond the bottleneck. Nature Biotechnol, 1999, 17: 859-863
3，Mark HP. G-protein-coupled receptors in Saccharomyces cerevisial: high-throughput screening assays for drug discovery. TIBTECK, 1997, 15: 487-494
4，Channa. KJ, Thomas AK. Gene expression systems in the development of high-throughput screen. Curr Opin Biotechnol, 1997,8: 629-634
5，Crespi CL, Miller VP, Perman BW. Microtiter plate assays for inhibition of human drug-metabolizing cytochromes P450. Anal Biochem, 1997, 248: 188-190
6，吴 倩，吴剑波，李 元. 白细胞介素-1受体拮抗剂139的研究. 中国抗生素杂志， 1999， 24(6)： 401-408, 百拇医药