大鼠皮肤及毛囊骨桥蛋白研究
大鼠皮肤及毛囊骨桥蛋白研究
杨恬 向明明
摘 要 目的 对出生前和出生后大鼠皮肤及毛囊的骨桥蛋白(osteopontin)的mRNA进行研究。方法 确定妊龄14～18 d和出生后1～61 d Wistar大鼠毛发周期，用放射性同位素标记的原位杂交法对大鼠皮肤和毛囊骨桥蛋白mRNA的分布和含量进行研究。结果 骨桥蛋白mRNA在大鼠出生后第18天首次在真皮乳头(dermal papilla,DP)细胞中出现。在各毛发周期中骨桥蛋白mRNA信号均出现于毛囊退化期DP细胞，在毛囊静止期和生长期中信号完全消失。在皮肤和毛囊的其它细胞中均未检出骨桥蛋白mRNA。结论 骨桥蛋白对毛发生长和毛发周期可能有重要的调节作用。
关键词：骨桥蛋白 毛发周期 真皮乳头
, 百拇医药
骨桥蛋白(osteopontin)是一种带负电荷的磷酸蛋白，广泛地存在于体内多种组织和细胞，包括骨、肾、肌肉、膀胱和自然杀伤细胞中[1,2]。本实验用放射性同位素标记的原位杂交技术，对胚胎期和出生后的大鼠皮肤和毛囊中骨桥蛋白的mRNA的细胞类型、含量变化及其与毛发周期的关系进行研究。
材料和方法
实验动物 妊龄14～18 d和生后1～61 d的Wistar大鼠102只，雌雄各半，按妊龄或年龄分为41组(妊14、16、18 d和生后1、2、3、4、6、7、9、10、11、13、15、16、17、19、20、21、23、25、27、29、30、31、33、35、36、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61 d)，每组2～3只。
菌株与主要试剂 菌株和质粒PCRⅡ中大鼠骨桥蛋白cDNA片段(315 bp)由美国NYU的Sun博士惠赠。标记药盒Roboprobe Combination System购自美国Promega公司，35S-UTP购自美国Dupont公司。
, http://www.100md.com
标本制备 处死鼠，取唇部和背部皮肤各2～3块，入4%多聚甲醛中固定，4 ℃过夜，70%～100%梯度酒精脱水，常规石蜡切片(片厚6 μm)。对照切片(小脑，阴性对照；肾，阳性对照)的制备同上。
毛发生长周期测定 应用Borum和Wilson标准方法测定毛发生长周期[3]。在计算机辅助图象分析系统(Southern Micro System,USA)下选取苏木精-伊红(HE)染色的石蜡切片上完整纵切的毛囊，测定其全长(从毛球基部至皮肤表面水平)。每组取12～15张切片，切片间隔50 μm。数据读入计算机，统计分析结果。
探针制备和原位杂交 按文献[4]方法，将质粒PCRⅡ中315 bp的大鼠骨桥蛋白的cDNA片段转化入细菌HB101中，经扩增、酚/氯仿抽提、电泳检测分子量后用酶切使其线性化。用Roboprobe Combination System标记药盒和35S-UTP(37kBq/mmol)分别合成大鼠骨桥蛋白的正义链和反义链RNA探针，柱层析纯化。每组皮肤和对照标本各取3张切片，经二甲苯脱蜡，50%酒精脱水，4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS,pH7.4)4℃固定10 min,0.5×SSC洗两次，在蛋白酶K(10 μg/ml,10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)中室温下孵育10 min,0.5×SSC洗两次。55 ℃下预杂交切片1 h(预杂交液含50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，10 mmol/L DTT及500 μg/ml tRNA)后，加入35S标记的探针(6×106CPM/ml)并杂交过夜(55 ℃)。次日将切片置于室温RNAse A(20 μg/ml)30 min，然后在68 ℃的0.1×SSC溶液(含1 mmol/L EDTA和10 mmol/L 2-巯基乙醇)中洗2 h。切片经脱水后在暗室中涂布K2乳胶(Polyscience公司)，置4 ℃暗室曝光9 d后将切片显影定影，HE复染。分别于亮视野显微镜和暗视野显微镜下对比观察皮肤和毛囊的结构和骨桥蛋白mRNA信号的银颗粒。
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结 果
大鼠毛发生长周期 新生大鼠毛发生长的第1个周期为出生后1～27 d(D1～D27),其中生长期17 d(D1～D17)，退化期和静止期共10 d(D18～D27)。第2个周期从第28天开始，生长期持续17 d(D29～D45)，退化期自第46天起，至第61天仍处在静止期阶段中。
骨桥蛋白mRNA 大鼠背部皮肤和毛囊原位杂交结果显示，胚胎期大鼠及生后第1～2天的新生鼠的皮肤及毛囊等结构中均未见骨桥蛋白 mRNA信号。在第1个毛发周期的第3天，微弱的骨桥蛋白mRNA信号开始见于真皮的巨噬细胞中，而整个生长期(D1～D17)中均未见毛囊等结构内有任何骨桥蛋白mRNA信号。第18天起进入退化期，毛囊退化，DP被结缔组织鞘牵拉至隆突区附近，此时可见DP细胞中出现骨桥蛋白mRNA信号的微弱的散在的银颗粒，第20天骨桥蛋白信号明显增加，但银颗粒沉淀局限于DP细胞内，在背向毛母质细胞方向多密集，似表现出极性分布。相应其下方结缔组织鞘细胞内也发现阳性信号。在静止期，毛囊骨桥蛋白mRNA信号消失(附图a,a)。在第2个周期中，骨桥蛋白mRNA信号同样严格地仅见于退化期，但比第1周期中稍强。生长期(D29～D45)毛囊等结构中未有任何骨桥蛋白mRNA信号检出(附图b,b)。从第46天起，可见DP细胞中出现骨桥蛋白mRNA信号，在退化期中期信号达到峰值(附图c,c)，银颗粒覆盖DP区域，低倍镜下即可清楚见到。在退化末期，信号又开始减弱(附图d,d)，在静止期信号再度消失。在DP细胞下方的结缔组织鞘和真皮的巨噬细胞中也可见到较弱骨桥蛋白mRNA信号，但其它各种细胞，如真皮成纤维细胞(Fb)、内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞、皮肤表皮及毛囊其他各层的角质形成细胞中均未见骨桥蛋白mRNA信号。唇部触须毛囊中骨桥蛋白mRNA信号呈现与毛发中相似的变化。阳性对照的肾远曲小管和髓袢的细胞中可见骨桥蛋白mRNA信号。阴性对照中未见骨桥蛋白信号mRNA。
, 百拇医药
附图 大鼠背部皮肤及毛囊原位杂交结果
Fig In situ hybridization of osteopontin mRNA on the paraffin sections of skin and hair follicle of Wistar rats ×400
a～d.HE staining;a'～d'.the dark field pictures of the corresponding fields high-lighting the silver grains;a，a'.22-day showing a telegen follicle;b，b'.33-day showing an anagen hair follicle;c，c'.46-day showing a catagen follicle;d，d'.48-day showing a catagen;P.papillary cells;C.connective tissue sheath
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讨 论
毛囊的生长和维持有赖于上皮细胞和特定的间充质细胞(DP细胞)之间的相互诱导和相互作用。“隆突激活假说”提出，在毛发生长的静止期，当DP靠近毛囊隆突区时，“激活”了位于该区的干细胞，干细胞随即分裂增殖，并进一步分化形成毛囊鞘和毛发[5]。为了鉴定DP细胞特异作用的分子，笔者等用随机引物PCR(RT-PCR)技术比较了DP细胞和Fb的mRNA谱，发现了一组DP细胞特异性的分子，骨桥蛋白是其中之一[2]。应用Northern blot也确认了这种1100 bp的骨桥蛋白的mRNA仅存在于培养的大鼠DP细胞中，而在培养的大鼠Fb中不能检出[2]。
本研究结果显示，骨桥蛋白信号消长和毛发周期密切相关。骨桥蛋白mRNA在毛发周期的不同阶段呈现有意义的变化，即仅存在于退化期的毛囊DP细胞，而在生长期和静止期的毛囊的任何结构中均不能检出。同时，在和DP细胞有共同的间充质起源的相邻的Fb及其它绝大多数皮肤和毛囊细胞中也未见骨桥蛋白的mRNA信号出现。
, 百拇医药
骨桥蛋白与毛发周期和毛发生长的关系鲜见文献报告。Lichti等[6]成功地分离、体外培养并建立了6种不同小鼠DP细胞系，并证明这些细胞系均有不同的支持在无胸腺小鼠内毛囊上皮细胞重建毛囊的能力。最近的研究发现这些细胞系均含有相当量的骨桥蛋白mRNA，其水平与这些DP细胞系支持体内构筑毛囊的能力可能有很好的相关性[2]。据文献报道，DP在毛囊重建中具有特别重要的意义，这一过程需要巨噬细胞参与[5,6]，联系到骨桥蛋白在真皮的巨噬细胞中出现表明它可能在巨噬细胞参与的毛囊重建中有一定功能。
笔者等在同一系列研究中发现的另一个DP特异性的分子Nexin 1 也大量存在于培养的和原位组织的大鼠DP细胞中，而在培养的和原位Fb中不能检出，而且其mRNA含量与一些已建立的在体外有不同毛囊重建能力的小鼠DP细胞系也有很好的正相关性。特别有意义的是，Nexin 1 和骨桥蛋白相反，仅存在于毛囊的生长期[7～9]。本研究提示骨桥蛋白和Nexin 1 在毛发周期的DP重建中均具有重要的意义。■
, 百拇医药
国家自然科学基金(39740018.39870690)资助
杨恬(第三军医大学 细胞生物学教研室，重庆 400038)
向明明(第三军医大学 细胞生物学教研室，重庆 400038)
参考文献
[1]Denhardt DT,Guo XJ.Osteopontin:a protein with diverse functions.FASEB,1993,7(12):1475-1482
[2]Yang T,Yu DW,Sun TT, et al. Osteopontin gene is upregu- lated during the catagen phase of the hair cycle.J Cell Sci,2000 (in press)
, 百拇医药
[3]Wilson C,Cotsarelis G,Wei ZG, et al. Cells within the bulge region of mouse hair follicle transiently proli- ferate during early anagen:heterogeneity and functional differences of various hair cycles.Differentiation,1994,55(2):127-136
[4]Chen CS,lyons-Giordano B,Lazarus GS,et al.Differential expression of Plasminogeu activator and their inhibitors in an organotypic skin coculture system.J Cell Sci,1993,106(1):45-53
[5]Cotsarelis G,Sun TT,Lavker RM.Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit:implica- tion for follicular stem cells,hair cycle,and skin carcino- genesis.Cell,1990,61(8):1329-1337
, http://www.100md.com
[6]Lichti U,Weinberg WC,Goodman L,et al.In vivo regulation of murine hair growth:insights from grafting defined cell population onto nude mice.J Invest Dermatol,1993,101(Suppl 1):124s-129s
[7]向明明，杨 恬.大鼠生后发育期皮肤及毛囊Nexin 1的研究.中国医学科学院学报，1998，20(1)：127-132
[8]Yu DW,Yang T,Sonoda T,et al.Message of Nexin I,a serine protease inhibitor,is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle.J Cell Sci,1995,108(11):3867-3874
[9]Yu DW,Yang T,Sonoda T,et al.Nexin-1 is upregu-lated during anagen phase of hair cycle.J Invest Dermatol,1996,106(4):903, 百拇医药
杨恬 向明明
摘 要 目的 对出生前和出生后大鼠皮肤及毛囊的骨桥蛋白(osteopontin)的mRNA进行研究。方法 确定妊龄14～18 d和出生后1～61 d Wistar大鼠毛发周期，用放射性同位素标记的原位杂交法对大鼠皮肤和毛囊骨桥蛋白mRNA的分布和含量进行研究。结果 骨桥蛋白mRNA在大鼠出生后第18天首次在真皮乳头(dermal papilla,DP)细胞中出现。在各毛发周期中骨桥蛋白mRNA信号均出现于毛囊退化期DP细胞，在毛囊静止期和生长期中信号完全消失。在皮肤和毛囊的其它细胞中均未检出骨桥蛋白mRNA。结论 骨桥蛋白对毛发生长和毛发周期可能有重要的调节作用。
关键词：骨桥蛋白 毛发周期 真皮乳头
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骨桥蛋白(osteopontin)是一种带负电荷的磷酸蛋白，广泛地存在于体内多种组织和细胞，包括骨、肾、肌肉、膀胱和自然杀伤细胞中[1,2]。本实验用放射性同位素标记的原位杂交技术，对胚胎期和出生后的大鼠皮肤和毛囊中骨桥蛋白的mRNA的细胞类型、含量变化及其与毛发周期的关系进行研究。
材料和方法
实验动物 妊龄14～18 d和生后1～61 d的Wistar大鼠102只，雌雄各半，按妊龄或年龄分为41组(妊14、16、18 d和生后1、2、3、4、6、7、9、10、11、13、15、16、17、19、20、21、23、25、27、29、30、31、33、35、36、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61 d)，每组2～3只。
菌株与主要试剂 菌株和质粒PCRⅡ中大鼠骨桥蛋白cDNA片段(315 bp)由美国NYU的Sun博士惠赠。标记药盒Roboprobe Combination System购自美国Promega公司，35S-UTP购自美国Dupont公司。
, http://www.100md.com
标本制备 处死鼠，取唇部和背部皮肤各2～3块，入4%多聚甲醛中固定，4 ℃过夜，70%～100%梯度酒精脱水，常规石蜡切片(片厚6 μm)。对照切片(小脑，阴性对照；肾，阳性对照)的制备同上。
毛发生长周期测定 应用Borum和Wilson标准方法测定毛发生长周期[3]。在计算机辅助图象分析系统(Southern Micro System,USA)下选取苏木精-伊红(HE)染色的石蜡切片上完整纵切的毛囊，测定其全长(从毛球基部至皮肤表面水平)。每组取12～15张切片，切片间隔50 μm。数据读入计算机，统计分析结果。
探针制备和原位杂交 按文献[4]方法，将质粒PCRⅡ中315 bp的大鼠骨桥蛋白的cDNA片段转化入细菌HB101中，经扩增、酚/氯仿抽提、电泳检测分子量后用酶切使其线性化。用Roboprobe Combination System标记药盒和35S-UTP(37kBq/mmol)分别合成大鼠骨桥蛋白的正义链和反义链RNA探针，柱层析纯化。每组皮肤和对照标本各取3张切片，经二甲苯脱蜡，50%酒精脱水，4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS,pH7.4)4℃固定10 min,0.5×SSC洗两次，在蛋白酶K(10 μg/ml,10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)中室温下孵育10 min,0.5×SSC洗两次。55 ℃下预杂交切片1 h(预杂交液含50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，10 mmol/L DTT及500 μg/ml tRNA)后，加入35S标记的探针(6×106CPM/ml)并杂交过夜(55 ℃)。次日将切片置于室温RNAse A(20 μg/ml)30 min，然后在68 ℃的0.1×SSC溶液(含1 mmol/L EDTA和10 mmol/L 2-巯基乙醇)中洗2 h。切片经脱水后在暗室中涂布K2乳胶(Polyscience公司)，置4 ℃暗室曝光9 d后将切片显影定影，HE复染。分别于亮视野显微镜和暗视野显微镜下对比观察皮肤和毛囊的结构和骨桥蛋白mRNA信号的银颗粒。
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结 果
大鼠毛发生长周期 新生大鼠毛发生长的第1个周期为出生后1～27 d(D1～D27),其中生长期17 d(D1～D17)，退化期和静止期共10 d(D18～D27)。第2个周期从第28天开始，生长期持续17 d(D29～D45)，退化期自第46天起，至第61天仍处在静止期阶段中。
骨桥蛋白mRNA 大鼠背部皮肤和毛囊原位杂交结果显示，胚胎期大鼠及生后第1～2天的新生鼠的皮肤及毛囊等结构中均未见骨桥蛋白 mRNA信号。在第1个毛发周期的第3天，微弱的骨桥蛋白mRNA信号开始见于真皮的巨噬细胞中，而整个生长期(D1～D17)中均未见毛囊等结构内有任何骨桥蛋白mRNA信号。第18天起进入退化期，毛囊退化，DP被结缔组织鞘牵拉至隆突区附近，此时可见DP细胞中出现骨桥蛋白mRNA信号的微弱的散在的银颗粒，第20天骨桥蛋白信号明显增加，但银颗粒沉淀局限于DP细胞内，在背向毛母质细胞方向多密集，似表现出极性分布。相应其下方结缔组织鞘细胞内也发现阳性信号。在静止期，毛囊骨桥蛋白mRNA信号消失(附图a,a)。在第2个周期中，骨桥蛋白mRNA信号同样严格地仅见于退化期，但比第1周期中稍强。生长期(D29～D45)毛囊等结构中未有任何骨桥蛋白mRNA信号检出(附图b,b)。从第46天起，可见DP细胞中出现骨桥蛋白mRNA信号，在退化期中期信号达到峰值(附图c,c)，银颗粒覆盖DP区域，低倍镜下即可清楚见到。在退化末期，信号又开始减弱(附图d,d)，在静止期信号再度消失。在DP细胞下方的结缔组织鞘和真皮的巨噬细胞中也可见到较弱骨桥蛋白mRNA信号，但其它各种细胞，如真皮成纤维细胞(Fb)、内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞、皮肤表皮及毛囊其他各层的角质形成细胞中均未见骨桥蛋白mRNA信号。唇部触须毛囊中骨桥蛋白mRNA信号呈现与毛发中相似的变化。阳性对照的肾远曲小管和髓袢的细胞中可见骨桥蛋白mRNA信号。阴性对照中未见骨桥蛋白信号mRNA。
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附图 大鼠背部皮肤及毛囊原位杂交结果
Fig In situ hybridization of osteopontin mRNA on the paraffin sections of skin and hair follicle of Wistar rats ×400
a～d.HE staining;a'～d'.the dark field pictures of the corresponding fields high-lighting the silver grains;a，a'.22-day showing a telegen follicle;b，b'.33-day showing an anagen hair follicle;c，c'.46-day showing a catagen follicle;d，d'.48-day showing a catagen;P.papillary cells;C.connective tissue sheath
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毛囊的生长和维持有赖于上皮细胞和特定的间充质细胞(DP细胞)之间的相互诱导和相互作用。“隆突激活假说”提出，在毛发生长的静止期，当DP靠近毛囊隆突区时，“激活”了位于该区的干细胞，干细胞随即分裂增殖，并进一步分化形成毛囊鞘和毛发[5]。为了鉴定DP细胞特异作用的分子，笔者等用随机引物PCR(RT-PCR)技术比较了DP细胞和Fb的mRNA谱，发现了一组DP细胞特异性的分子，骨桥蛋白是其中之一[2]。应用Northern blot也确认了这种1100 bp的骨桥蛋白的mRNA仅存在于培养的大鼠DP细胞中，而在培养的大鼠Fb中不能检出[2]。
本研究结果显示，骨桥蛋白信号消长和毛发周期密切相关。骨桥蛋白mRNA在毛发周期的不同阶段呈现有意义的变化，即仅存在于退化期的毛囊DP细胞，而在生长期和静止期的毛囊的任何结构中均不能检出。同时，在和DP细胞有共同的间充质起源的相邻的Fb及其它绝大多数皮肤和毛囊细胞中也未见骨桥蛋白的mRNA信号出现。
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骨桥蛋白与毛发周期和毛发生长的关系鲜见文献报告。Lichti等[6]成功地分离、体外培养并建立了6种不同小鼠DP细胞系，并证明这些细胞系均有不同的支持在无胸腺小鼠内毛囊上皮细胞重建毛囊的能力。最近的研究发现这些细胞系均含有相当量的骨桥蛋白mRNA，其水平与这些DP细胞系支持体内构筑毛囊的能力可能有很好的相关性[2]。据文献报道，DP在毛囊重建中具有特别重要的意义，这一过程需要巨噬细胞参与[5,6]，联系到骨桥蛋白在真皮的巨噬细胞中出现表明它可能在巨噬细胞参与的毛囊重建中有一定功能。
笔者等在同一系列研究中发现的另一个DP特异性的分子Nexin 1 也大量存在于培养的和原位组织的大鼠DP细胞中，而在培养的和原位Fb中不能检出，而且其mRNA含量与一些已建立的在体外有不同毛囊重建能力的小鼠DP细胞系也有很好的正相关性。特别有意义的是，Nexin 1 和骨桥蛋白相反，仅存在于毛囊的生长期[7～9]。本研究提示骨桥蛋白和Nexin 1 在毛发周期的DP重建中均具有重要的意义。■
, 百拇医药
国家自然科学基金(39740018.39870690)资助
杨恬(第三军医大学 细胞生物学教研室，重庆 400038)
向明明(第三军医大学 细胞生物学教研室，重庆 400038)
参考文献
[1]Denhardt DT,Guo XJ.Osteopontin:a protein with diverse functions.FASEB,1993,7(12):1475-1482
[2]Yang T,Yu DW,Sun TT, et al. Osteopontin gene is upregu- lated during the catagen phase of the hair cycle.J Cell Sci,2000 (in press)
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[3]Wilson C,Cotsarelis G,Wei ZG, et al. Cells within the bulge region of mouse hair follicle transiently proli- ferate during early anagen:heterogeneity and functional differences of various hair cycles.Differentiation,1994,55(2):127-136
[4]Chen CS,lyons-Giordano B,Lazarus GS,et al.Differential expression of Plasminogeu activator and their inhibitors in an organotypic skin coculture system.J Cell Sci,1993,106(1):45-53
[5]Cotsarelis G,Sun TT,Lavker RM.Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit:implica- tion for follicular stem cells,hair cycle,and skin carcino- genesis.Cell,1990,61(8):1329-1337
, http://www.100md.com
[6]Lichti U,Weinberg WC,Goodman L,et al.In vivo regulation of murine hair growth:insights from grafting defined cell population onto nude mice.J Invest Dermatol,1993,101(Suppl 1):124s-129s
[7]向明明，杨 恬.大鼠生后发育期皮肤及毛囊Nexin 1的研究.中国医学科学院学报，1998，20(1)：127-132
[8]Yu DW,Yang T,Sonoda T,et al.Message of Nexin I,a serine protease inhibitor,is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle.J Cell Sci,1995,108(11):3867-3874
[9]Yu DW,Yang T,Sonoda T,et al.Nexin-1 is upregu-lated during anagen phase of hair cycle.J Invest Dermatol,1996,106(4):903, 百拇医药