服用低剂量醋酸棉酚对正常男性精子碱性核蛋白的影响
曹坚 费仁仁 赵跃华 陈晖 金伟 陈松
摘 要 目的 研究正常男性服用低剂量醋酸棉酚后对精子碱性核蛋白的影响。方法 志愿者23例，其中对照组8例，服药组15例，服药组口服醋酸棉酚剂量为15 mg/d，服药12周达起效期后，改为10 mg/d维持至44周。于服药后1、4、8、12、16、24、36、44周及停药后10周采集精液，对照组于相同时相采取精液，分析精子碱性核蛋白的变化。 结果 对照组总组蛋白(TH)与总精核蛋白(TP)的比值为0.17±0.07，服药组为0.63±0.79；对照组P1型精核蛋白(HP1)与P2型精核蛋白(HP2+HP3)的比值为1.05±0.21，服药组为1.47±0.18；对照组与服药组两组参数相比较差异均有显著性(P<0.05，P<0.01)。停药10周后，服药组两组参数均恢复到正常状态。结论 服用低剂量醋酸棉酚能阻断组蛋白-精核蛋白取代反应(HPRR)及影响精核蛋白含量，这可能是醋酸棉酚导致不育的重要原因；低剂量醋酸棉酚导致的HPRR及精核蛋白的改变是可逆的。
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关键词：醋酸棉酚 精子核蛋白
在精子细胞分化(spermiogenesis)过程中，细胞核内体细胞类型组蛋白(H1，H2a，H2b，H3，H4)逐步地被精核蛋白(protamine)取代，这个过程称组蛋白-精核蛋白取代反应(histone-to-protamine replacement reaction，HPRR)[1，2]。通过HPRR，精子细胞核高度浓缩，而精核蛋白是成熟精子的主要核蛋白。哺乳动物精核蛋白分为两类，一类是P1型精核蛋白，存在于所有哺乳动物中，在人类为HP1(human protamine 1)；另一类P2型精核蛋白仅存在于人、小鼠等少数哺乳动物中，在人类为HP2，HP3。已有资料表明醋酸棉酚能干扰大鼠HPRR及精核蛋白含量，并被认为这是醋酸棉酚导致大鼠不育的重要原因[3，4]。在大部分不育患者中均存在HPRR及精核蛋白异常[5，6]。因而精核蛋白与生育力的关系越来越引起生殖生物学与生殖医学界的重视。本实验拟研究低剂量醋酸棉酚在抗生育过程中对精子细胞HPRR和精核蛋白变化的影响及其变化规律。
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材料和方法
研究对象 23名男性健康志愿者，年龄26～38岁，已有正常生育，常规体检正常，肝、肾功能、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)水平正常。
给药方法及精液标本采集 服药组15名，口服醋酸棉酚15 mg/d，服药12周达起效期(精子计数低于5×106/ml，活力在0%～5%)后，改为10 mg/d维持至44周。在服药1、4、8、12、16、24、36、44周及停药后10周采集精液。对照组8名，在上述相同时相采集精液。在采集精液前禁欲3～5 d，用手淫法收集，于37 ℃保温30 min，待液化后按WHO标准查精子计数及活力，然后提取精子碱性核蛋白进行分析。
精子总碱性核蛋白的提取及蛋白浓度测定 精子用生理盐水(含1 mmol/L苯*****phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)洗2次，然后依据文献[5]方法提取精子总碱性核蛋白(total nuclear basic proteins，TNBP)并测定蛋白浓度。
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TNBP的电泳分析 从每份标本中取40 μg TNBP，依据Panyim法[7，8]，用20%聚丙烯酰胺凝胶，在酸性-尿素系统中进行电泳分析。将电泳结果拍成黑白照片，用岛津CS-930型双波长扫描仪扫描，测定各蛋白条带的相对含量。用总组蛋白(total histones，TH)/总精核蛋白(total protamines，TP)值表示HPRR程度，用HP1/(HP2+HP3)表示P1及P2型精核蛋白的相对含量。
统计学处理 所有数据以均值±标准差(X±s)表示，组间差异的显著性采用t检验进行分析。
结 果
对照组精子细胞核内主要含精核蛋白(HP1，HP2，HP3)和少量组蛋白。服药组精子核蛋白可见如下几种异常情况：(1)HPRR受阻，表现为组蛋白含量增多；(2)P2型精核蛋白(HP2，HP3)含量减少；(3)HP2，HP3全部缺失(附图)。
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附图 精子总碱性核蛋白的电泳分析
Fig Gel electrophoretic separation of total nuclear basic proteins
a.control；b～d.gossypol treated
服药12周进入临床有效期后对照组TH/TP为0.17±0.07，服药组为0.63±0.79，两组比较差异有显著性(P<0.05)，表明服药后HPRR受阻，组蛋白含量增高。对照组HP1/(HP2+HP3)为1.05±0.21，范围在0.66～1.27；服药组为1.47±0.18，范围在1.31～4.94，两组比较差异有显著性(P<0.01)，表明服药后P2型精核蛋白含量下降。服药组各受试者服药前后TH/TP及HP1/(HP2+HP3)值的自身对照比较中，差异均有显著性(P<0.01)。在进入临床有效期后，服药组80%的精液标本表现为HP1/(HP2+HP3)值升高，有9例持续表现为比值升高或HP2、HP3消失，也有部分受试者HP2、HP3减少或缺失交替出现。
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停药10周后，两组精液常规检查结果均正常，对照组TH/TP为0.15±0.08，服药组为0.23±0.21，两组比较差异无显著性(P>0.5)；对照组HP1/(HP2+HP3)为1.09±0.21，服药组为1.17±0.32，两组比较差异无显著性(P>0.5)，表明服药组以上两项参数均已恢复到正常范围内。
两组志愿者服药前后血钾均在正常范围内(3.5～5.7 mmol/L)，无低血钾出现。
讨 论
哺乳动物睾丸内精子发生要经过精原细胞、精母细胞和精子细胞三个阶段。在精子细胞阶段，核内染色质与DNA结合的组蛋白，通过HPRR，逐步被精核蛋白取代，同时细胞核高度浓缩，其形态由圆形变为长形，长形精子细胞进入附睾后，进一步分化而成为成熟的精子。精核蛋白在此过程中的主要作用是：浓缩精子细胞核，并使其形态由圆形变为长形；保护精子遗传信息，使基因处于稳定的、不表达状态。
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在人类，正常男性精子细胞核内主要为精核蛋白，同时还有少量组蛋白，TH/TP值可反映HPRR程度，也代表精子成熟程度。HP1/(HP2+HP3)值代表P1和P2两型精核蛋白相对含量。曹坚等[8]对8例正常男性连续观察1年，测得TH/TP平均值为0.17±0.07，HP1/(HP2+HP3)平均值为1.05±0.21；费仁仁等[5]报道正常男性TH/TP为0.11±0.06，HP1/(HP2+HP3)为1.01±0.11；Balhorn[9]报道正常精子约有15%组蛋白留在核内，测得的HP1/(HP2+HP3)为0.98±0.12，上述报道的结果基本一致。
服用醋酸棉酚在进入临床有效期后，TH/TP值明显高于对照组，差异有显著性，表明服药后HPRR受阻，致使精子核内组蛋白增多，精核蛋白含量相对减少，精子成熟度降低，临床表现为头部畸形精子增多；同时，HP1/(HP2+HP3)值也升高。HP2，HP3之间差异仅在于HP3N端比HP2多3个氨基酸残基，其它氨基酸顺序完全相同，因而称为P2家族。本实验中80%的服药组受试者服药12周后精液标本表现为HP2，HP3减少或缺失，而HP1无变化或变化不明显，表明P2型精核蛋白与生育力有着更密切的关系。Balhorn[9]，Yebra[6]和费仁仁[5]在对不育患者的研究中都有类似的报道。
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费仁仁[3]和Teng[4]曾报道大鼠口服醋酸棉酚后HPRR及精核蛋白含量均发生改变，与本研究结果相一致，表明醋酸棉酚能干扰人及大鼠的HPRR及精核蛋白的含量，这可能是醋酸棉酚导致不育的重要原因。
Schicker等[10]和Yebra等[6]曾对精核蛋白异常患者的P1和P2型精核蛋白基因进行分析，发现无基因突变，因而认为精核蛋白含量改变可能是某些因素影响基因表达的缘故。本研究发现服用醋酸棉酚后精核蛋白的含量发生改变，这可能是由于醋酸棉酚影响精核蛋白基因表达的结果。
停药后10周TH/TP和HP1/(HP2+HP3)值均恢复正常，表明服用低剂量醋酸棉酚导致的HPRR和精核蛋白的改变是可逆的。同时也提示HPRR和精核蛋白可作为评价精子生育力的有效指标，可应用于药物对生殖系统影响的研究，作为对不育患者的诊断及治疗过程中监测精子生育力状态的指标。
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曹坚(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
费仁仁(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
赵跃华(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
陈晖(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
金伟(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
陈松(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
参考文献
[1]Oliva R，Dixon GH.Vertebrate protamine genes and the histone-to-protamine replacement reaction.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1991，40：25-94
, 百拇医药
[2]费仁仁，邓锦松，纪 林，等.大鼠精子细胞变态期核蛋白转换的研究.解剖学报，1997，28：388-392
[3]Fei RR，Teng CS.The effect of gossypol on nuclear proteins in rat testes.Ⅰ.Reduction in the content of basic proteins in the spermiogenic cells.Contraception，1988，37：279-290
[4]Teng CS，Fei RR.The effect of gossypol on nuclear proteins in rat testes.Ⅱ.The synthesis of histones and testis specific proteins after gossypol treatment.Contraception，1988，37：291-300
, http://www.100md.com
[5]费仁仁，陈 晖，熊惠芳，等.人类精子核的研究—100例不育病人精子碱性核蛋白的分析.解剖学报，1996，27：256-258
[6]Yebra LI de，Ballesca JL，Vanrell JA，et al.Complete selective absence of protamine P2 in humans.J Biol Chem，1993，268：10553-10557
[7]Panyim S，Chalkley R.High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones.Arch Biochem Biophys，1969，130：337-346
[8]曹 坚，费仁仁，赵跃华，等.正常男性精子碱性核蛋白的研究. 中华泌尿外科杂志，待发表
, http://www.100md.com [9]Balhorn R，Reed S，Tanphaichitr N.Aberrant protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of intertile human males.Experientia，1988，44：52-54
[10]Schicker M，Schnulle V，Schneppel L，et al. Disturbances of nuclear condensation in human spermatozoa：search for mutations in the genes for protamine1，protamine 2 and transition protein1.Human Reprod，1994，9：2313-2317, 百拇医药
摘 要 目的 研究正常男性服用低剂量醋酸棉酚后对精子碱性核蛋白的影响。方法 志愿者23例，其中对照组8例，服药组15例，服药组口服醋酸棉酚剂量为15 mg/d，服药12周达起效期后，改为10 mg/d维持至44周。于服药后1、4、8、12、16、24、36、44周及停药后10周采集精液，对照组于相同时相采取精液，分析精子碱性核蛋白的变化。 结果 对照组总组蛋白(TH)与总精核蛋白(TP)的比值为0.17±0.07，服药组为0.63±0.79；对照组P1型精核蛋白(HP1)与P2型精核蛋白(HP2+HP3)的比值为1.05±0.21，服药组为1.47±0.18；对照组与服药组两组参数相比较差异均有显著性(P<0.05，P<0.01)。停药10周后，服药组两组参数均恢复到正常状态。结论 服用低剂量醋酸棉酚能阻断组蛋白-精核蛋白取代反应(HPRR)及影响精核蛋白含量，这可能是醋酸棉酚导致不育的重要原因；低剂量醋酸棉酚导致的HPRR及精核蛋白的改变是可逆的。
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关键词：醋酸棉酚 精子核蛋白
在精子细胞分化(spermiogenesis)过程中，细胞核内体细胞类型组蛋白(H1，H2a，H2b，H3，H4)逐步地被精核蛋白(protamine)取代，这个过程称组蛋白-精核蛋白取代反应(histone-to-protamine replacement reaction，HPRR)[1，2]。通过HPRR，精子细胞核高度浓缩，而精核蛋白是成熟精子的主要核蛋白。哺乳动物精核蛋白分为两类，一类是P1型精核蛋白，存在于所有哺乳动物中，在人类为HP1(human protamine 1)；另一类P2型精核蛋白仅存在于人、小鼠等少数哺乳动物中，在人类为HP2，HP3。已有资料表明醋酸棉酚能干扰大鼠HPRR及精核蛋白含量，并被认为这是醋酸棉酚导致大鼠不育的重要原因[3，4]。在大部分不育患者中均存在HPRR及精核蛋白异常[5，6]。因而精核蛋白与生育力的关系越来越引起生殖生物学与生殖医学界的重视。本实验拟研究低剂量醋酸棉酚在抗生育过程中对精子细胞HPRR和精核蛋白变化的影响及其变化规律。
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材料和方法
研究对象 23名男性健康志愿者，年龄26～38岁，已有正常生育，常规体检正常，肝、肾功能、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)水平正常。
给药方法及精液标本采集 服药组15名，口服醋酸棉酚15 mg/d，服药12周达起效期(精子计数低于5×106/ml，活力在0%～5%)后，改为10 mg/d维持至44周。在服药1、4、8、12、16、24、36、44周及停药后10周采集精液。对照组8名，在上述相同时相采集精液。在采集精液前禁欲3～5 d，用手淫法收集，于37 ℃保温30 min，待液化后按WHO标准查精子计数及活力，然后提取精子碱性核蛋白进行分析。
精子总碱性核蛋白的提取及蛋白浓度测定 精子用生理盐水(含1 mmol/L苯*****phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)洗2次，然后依据文献[5]方法提取精子总碱性核蛋白(total nuclear basic proteins，TNBP)并测定蛋白浓度。
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TNBP的电泳分析 从每份标本中取40 μg TNBP，依据Panyim法[7，8]，用20%聚丙烯酰胺凝胶，在酸性-尿素系统中进行电泳分析。将电泳结果拍成黑白照片，用岛津CS-930型双波长扫描仪扫描，测定各蛋白条带的相对含量。用总组蛋白(total histones，TH)/总精核蛋白(total protamines，TP)值表示HPRR程度，用HP1/(HP2+HP3)表示P1及P2型精核蛋白的相对含量。
统计学处理 所有数据以均值±标准差(X±s)表示，组间差异的显著性采用t检验进行分析。
结 果
对照组精子细胞核内主要含精核蛋白(HP1，HP2，HP3)和少量组蛋白。服药组精子核蛋白可见如下几种异常情况：(1)HPRR受阻，表现为组蛋白含量增多；(2)P2型精核蛋白(HP2，HP3)含量减少；(3)HP2，HP3全部缺失(附图)。
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附图 精子总碱性核蛋白的电泳分析
Fig Gel electrophoretic separation of total nuclear basic proteins
a.control；b～d.gossypol treated
服药12周进入临床有效期后对照组TH/TP为0.17±0.07，服药组为0.63±0.79，两组比较差异有显著性(P<0.05)，表明服药后HPRR受阻，组蛋白含量增高。对照组HP1/(HP2+HP3)为1.05±0.21，范围在0.66～1.27；服药组为1.47±0.18，范围在1.31～4.94，两组比较差异有显著性(P<0.01)，表明服药后P2型精核蛋白含量下降。服药组各受试者服药前后TH/TP及HP1/(HP2+HP3)值的自身对照比较中，差异均有显著性(P<0.01)。在进入临床有效期后，服药组80%的精液标本表现为HP1/(HP2+HP3)值升高，有9例持续表现为比值升高或HP2、HP3消失，也有部分受试者HP2、HP3减少或缺失交替出现。
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停药10周后，两组精液常规检查结果均正常，对照组TH/TP为0.15±0.08，服药组为0.23±0.21，两组比较差异无显著性(P>0.5)；对照组HP1/(HP2+HP3)为1.09±0.21，服药组为1.17±0.32，两组比较差异无显著性(P>0.5)，表明服药组以上两项参数均已恢复到正常范围内。
两组志愿者服药前后血钾均在正常范围内(3.5～5.7 mmol/L)，无低血钾出现。
讨 论
哺乳动物睾丸内精子发生要经过精原细胞、精母细胞和精子细胞三个阶段。在精子细胞阶段，核内染色质与DNA结合的组蛋白，通过HPRR，逐步被精核蛋白取代，同时细胞核高度浓缩，其形态由圆形变为长形，长形精子细胞进入附睾后，进一步分化而成为成熟的精子。精核蛋白在此过程中的主要作用是：浓缩精子细胞核，并使其形态由圆形变为长形；保护精子遗传信息，使基因处于稳定的、不表达状态。
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在人类，正常男性精子细胞核内主要为精核蛋白，同时还有少量组蛋白，TH/TP值可反映HPRR程度，也代表精子成熟程度。HP1/(HP2+HP3)值代表P1和P2两型精核蛋白相对含量。曹坚等[8]对8例正常男性连续观察1年，测得TH/TP平均值为0.17±0.07，HP1/(HP2+HP3)平均值为1.05±0.21；费仁仁等[5]报道正常男性TH/TP为0.11±0.06，HP1/(HP2+HP3)为1.01±0.11；Balhorn[9]报道正常精子约有15%组蛋白留在核内，测得的HP1/(HP2+HP3)为0.98±0.12，上述报道的结果基本一致。
服用醋酸棉酚在进入临床有效期后，TH/TP值明显高于对照组，差异有显著性，表明服药后HPRR受阻，致使精子核内组蛋白增多，精核蛋白含量相对减少，精子成熟度降低，临床表现为头部畸形精子增多；同时，HP1/(HP2+HP3)值也升高。HP2，HP3之间差异仅在于HP3N端比HP2多3个氨基酸残基，其它氨基酸顺序完全相同，因而称为P2家族。本实验中80%的服药组受试者服药12周后精液标本表现为HP2，HP3减少或缺失，而HP1无变化或变化不明显，表明P2型精核蛋白与生育力有着更密切的关系。Balhorn[9]，Yebra[6]和费仁仁[5]在对不育患者的研究中都有类似的报道。
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费仁仁[3]和Teng[4]曾报道大鼠口服醋酸棉酚后HPRR及精核蛋白含量均发生改变，与本研究结果相一致，表明醋酸棉酚能干扰人及大鼠的HPRR及精核蛋白的含量，这可能是醋酸棉酚导致不育的重要原因。
Schicker等[10]和Yebra等[6]曾对精核蛋白异常患者的P1和P2型精核蛋白基因进行分析，发现无基因突变，因而认为精核蛋白含量改变可能是某些因素影响基因表达的缘故。本研究发现服用醋酸棉酚后精核蛋白的含量发生改变，这可能是由于醋酸棉酚影响精核蛋白基因表达的结果。
停药后10周TH/TP和HP1/(HP2+HP3)值均恢复正常，表明服用低剂量醋酸棉酚导致的HPRR和精核蛋白的改变是可逆的。同时也提示HPRR和精核蛋白可作为评价精子生育力的有效指标，可应用于药物对生殖系统影响的研究，作为对不育患者的诊断及治疗过程中监测精子生育力状态的指标。
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曹坚(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
费仁仁(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
赵跃华(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
陈晖(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
金伟(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
陈松(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科，北京100730)
参考文献
[1]Oliva R，Dixon GH.Vertebrate protamine genes and the histone-to-protamine replacement reaction.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1991，40：25-94
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[2]费仁仁，邓锦松，纪 林，等.大鼠精子细胞变态期核蛋白转换的研究.解剖学报，1997，28：388-392
[3]Fei RR，Teng CS.The effect of gossypol on nuclear proteins in rat testes.Ⅰ.Reduction in the content of basic proteins in the spermiogenic cells.Contraception，1988，37：279-290
[4]Teng CS，Fei RR.The effect of gossypol on nuclear proteins in rat testes.Ⅱ.The synthesis of histones and testis specific proteins after gossypol treatment.Contraception，1988，37：291-300
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[5]费仁仁，陈 晖，熊惠芳，等.人类精子核的研究—100例不育病人精子碱性核蛋白的分析.解剖学报，1996，27：256-258
[6]Yebra LI de，Ballesca JL，Vanrell JA，et al.Complete selective absence of protamine P2 in humans.J Biol Chem，1993，268：10553-10557
[7]Panyim S，Chalkley R.High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones.Arch Biochem Biophys，1969，130：337-346
[8]曹 坚，费仁仁，赵跃华，等.正常男性精子碱性核蛋白的研究. 中华泌尿外科杂志，待发表
, http://www.100md.com [9]Balhorn R，Reed S，Tanphaichitr N.Aberrant protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of intertile human males.Experientia，1988，44：52-54
[10]Schicker M，Schnulle V，Schneppel L，et al. Disturbances of nuclear condensation in human spermatozoa：search for mutations in the genes for protamine1，protamine 2 and transition protein1.Human Reprod，1994，9：2313-2317, 百拇医药