人牙齿发育过程中增殖细胞核抗原的表达
人牙齿发育过程中增殖细胞核抗原的表达
王捍国 肖明振 刘军 张进
摘 要:目的 探讨人牙齿发育过程中的细胞增殖状况. 方法 制 备 人牙齿发育各阶段标本，采用SP法对增殖细胞核抗原进行免疫组化研究. 结果 增殖细胞核抗原在人牙齿发育各阶段具有不同的表达模式. 结论 牙胚内存在 广泛的细胞增殖，成釉细胞系和成牙本质细胞系的增殖状态呈现出连续发展过程.
关键词:增殖细胞核抗原；牙齿发育；免疫组织化学
0 引言
牙齿的发育包括起始、细胞分化和形态形成3个阶段，此过程主要受上皮细胞和外胚间充质细胞间有序的相互作用的调控. 我们以增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)为指标，确定人牙齿发育过程中的细胞增殖状况，为研究上皮细胞-间充质细胞间的相互作用与细胞增殖的关系奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 取西京医院妇产科8例合法引产正常胎儿，顶臀长(crown-rump length, CRL)为140～300 mm,相应胎龄为5～8 mo. 截取上下颌骨，40 g.L-1多聚甲醛固定24 h，EDTA 脱钙液脱钙4 wk，脱水透明. 以上过程皆在4℃下进行. 石蜡包埋，作4 μm连续切片. 同时收集外科因正畸或阻生而拔除的年轻恒牙(根尖孔敞开呈喇叭状)和成熟恒牙(根尖孔形成),按以上方法制作石蜡切片.
1.2 方法 使用美国Zymed公司SP试剂盒，按说明书进行免疫组化染色. 石蜡切片脱蜡至水，30 mL.L-1 H2O2室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，浸入柠檬酸盐 缓冲液内 进行微波抗原修复，100 mL.L-1正常山羊血清室温孵育10 min，倾去血清，滴加1∶ 50稀释的PCNA单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)，4℃过夜. 37℃复温1 h，滴加1∶100稀释的生物素化羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min，最后滴加1∶100稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30 min，以上每一步骤后0.01 mol.L-1 磷酸盐缓冲液(PBS,p H=7.4)振洗3次，各5 min. 滴加新鲜配制DAB-H2O2液显色，脱水透明封片. 以乳腺癌组织为 阳性对照，PBS代替一抗设为空白对照. PCNA阳性表达细胞胞核呈棕黄色，强阳性则胞核呈棕褐色 (Fig 1).
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2 结果
蕾状期：牙板、成釉器上皮PCNA呈阳性,邻近间充质细胞呈弱阳性.
帽状期：牙板、内釉上皮和部分外釉上皮PCNA呈阳性表达 (Fig 2).
钟状早期：内釉上皮、中间层细胞、牙乳头间充质细胞以及部分外釉上皮和星网层细胞PCNA呈阳性表达(Fig 3).
钟状晚期(硬组织形成期)：从牙颈部至前牙切嵴或后牙牙尖细胞中的PCNA阳性表达减弱. 当内釉上皮细胞分化为前成釉细胞时，仍可表达PCNA，分泌釉基质而成为成釉细胞时，则PCNA不表达；牙乳头间充质细胞分化为成牙本质细胞过程中，PCNA的表达情况与成釉细胞系相似 (Fig 4).
年轻恒牙：根尖部牙髓内可见中等量PCNA阳性细胞.
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成熟恒牙：牙髓内可见少量PCNA阳性细胞.
图 1 钟状早期牙胚内釉上皮细胞呈PCNA 阳性(箭头)或强阳性(三角箭头)，示核抗原
Fig 1 Positive (arrow show) or strong positive (arrow head) staining of PCNA in IEE in early bell stage of dental germ，showing nuclear antigen SP method 1 00×3.3
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图 2 PCNA在帽状期牙胚的表达
Fig 2 Expression of PCNA in cap stage of dental germ SP method 40×3.3
图 3 PCNA在钟状早期牙胚的表达
Fig 3 Expression of PCNA in early bell stage of dental germ SP method 40× 3.3
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图 4 PCNA在钟状晚期(硬组织形成期)牙胚的表达
Fig 4 Expression of PCNA in late bell stage of dental germ SP method 40 ×3.3
Am: ameloblast; IEE: inner enamel epithelium; OEE: outer enamel epith elium; SI: stratum intermedium; SR: stellate reticulum; DL: dental la mina; DP: dental papilla; Od: odontoblast; EM: enamel matrix; DM: dentin matrix.
3 讨论
为确定细胞的增殖情况而检测的细胞周期相关抗原有溴代脱氧尿苷(bromo-deoxyuridine, BrdU)、Ki67和PCNA. PCNA是一种DNA合成必需的DNA聚合酶附属蛋白，在G1晚期和S期合成，免疫组化方法可在G1,S和G2-M期的细胞内均检测到PCNA的存在，故PCNA是一种增殖细胞的内源性标志物，且不被福尔马林固定和石蜡包埋破坏[1-3]. 因此，检测PCNA是一种简便、有效的方法，可用于确定人牙齿发 育过程中的细胞增殖状况.
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我们发现PCNA在人牙齿发育各阶段具有不同的表达模式，即蕾状期、帽状期和钟状期牙胚以及年轻和成熟恒牙的PCNA阳性表达细胞及其分布具有差异. 但可以发现人牙齿发育过程中细胞增殖有一定规律性. 首先，牙胚内存在广泛的细胞增殖. 从蕾状期到钟状期牙胚，牙板、内外釉上皮、牙乳头间充质细胞等皆呈PCNA阳性表达. 其次，牙胚内成釉细胞系和成牙本质细胞系的增殖状态呈现出连续发展过程. 从牙颈部至前牙切嵴或后牙牙尖细胞增殖活性降低. 在钟状晚期，当内釉上皮细胞和牙乳头间充质细胞分化为功能性成釉细胞和成牙本质细胞时，则失去PCNA表达，因为它们是分化终末细胞，不再发生有丝分裂. 而其余部位如牙尖间区、轴面区细胞因仍处于增殖状态，故PCNA表达呈阳性. 这样，牙齿在形成硬组织的同时，体积增大. 另外，年轻恒牙牙根尚未完全形成，根尖部牙髓仍为原始性胚胎组织，处于活跃的增殖分化状态，以利于根尖孔的形成. 而成熟恒牙牙髓中存在细胞增殖和细胞死亡、凋亡等生理过程，故有少量PCNA阳性表达细胞.
目前，有关牙齿发育调控的分子机制尚不十分明确，但可以肯定有许多生物分子(如生长因子、转录因子、细胞膜表面成分和细胞外基质等)参与具体调控过程[4] . 我们确定了人牙齿发育过程中的细胞增殖状况及其规律，为进一步研究这些生物分子 与细胞增殖的关系奠定了基础.
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作者简介：王捍国(1974-)，男(汉族)，重庆市南川县人. 博士生(导师肖明振)，已发表论文1篇. Tel. (029)3376079
王捍国(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
肖明振(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
刘军(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
张进(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Yu CC，Woods AL，Levision DA. The assessment of cellular pro liferation by immunohistochemistry:A review of currently available methods and their applications[J]. Histochem J, 1992; 24(3):121-131.
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[2] Waseem NH, Lane DP. Monoclonal antibody analysis of the proliferat ing cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nucleolar form[J]. J Cell Sci, 1990; 96(5，Pt1):121-129.
[3] Morris GF, Mathews MB. Regulation of proliferating cell nuclear an tigen during the cell cycle[J]. J Biol Chem, 1989; 264(23):13856-13864.
[4] 野地澄晴. 齿の发生の分子Xカニズム. 齿科基础医学会杂志，1997；39( 3)：189-201., http://www.100md.com
王捍国 肖明振 刘军 张进
摘 要:目的 探讨人牙齿发育过程中的细胞增殖状况. 方法 制 备 人牙齿发育各阶段标本，采用SP法对增殖细胞核抗原进行免疫组化研究. 结果 增殖细胞核抗原在人牙齿发育各阶段具有不同的表达模式. 结论 牙胚内存在 广泛的细胞增殖，成釉细胞系和成牙本质细胞系的增殖状态呈现出连续发展过程.
关键词:增殖细胞核抗原；牙齿发育；免疫组织化学
0 引言
牙齿的发育包括起始、细胞分化和形态形成3个阶段，此过程主要受上皮细胞和外胚间充质细胞间有序的相互作用的调控. 我们以增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)为指标，确定人牙齿发育过程中的细胞增殖状况，为研究上皮细胞-间充质细胞间的相互作用与细胞增殖的关系奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 取西京医院妇产科8例合法引产正常胎儿，顶臀长(crown-rump length, CRL)为140～300 mm,相应胎龄为5～8 mo. 截取上下颌骨，40 g.L-1多聚甲醛固定24 h，EDTA 脱钙液脱钙4 wk，脱水透明. 以上过程皆在4℃下进行. 石蜡包埋，作4 μm连续切片. 同时收集外科因正畸或阻生而拔除的年轻恒牙(根尖孔敞开呈喇叭状)和成熟恒牙(根尖孔形成),按以上方法制作石蜡切片.
1.2 方法 使用美国Zymed公司SP试剂盒，按说明书进行免疫组化染色. 石蜡切片脱蜡至水，30 mL.L-1 H2O2室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，浸入柠檬酸盐 缓冲液内 进行微波抗原修复，100 mL.L-1正常山羊血清室温孵育10 min，倾去血清，滴加1∶ 50稀释的PCNA单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)，4℃过夜. 37℃复温1 h，滴加1∶100稀释的生物素化羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min，最后滴加1∶100稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30 min，以上每一步骤后0.01 mol.L-1 磷酸盐缓冲液(PBS,p H=7.4)振洗3次，各5 min. 滴加新鲜配制DAB-H2O2液显色，脱水透明封片. 以乳腺癌组织为 阳性对照，PBS代替一抗设为空白对照. PCNA阳性表达细胞胞核呈棕黄色，强阳性则胞核呈棕褐色 (Fig 1).
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2 结果
蕾状期：牙板、成釉器上皮PCNA呈阳性,邻近间充质细胞呈弱阳性.
帽状期：牙板、内釉上皮和部分外釉上皮PCNA呈阳性表达 (Fig 2).
钟状早期：内釉上皮、中间层细胞、牙乳头间充质细胞以及部分外釉上皮和星网层细胞PCNA呈阳性表达(Fig 3).
钟状晚期(硬组织形成期)：从牙颈部至前牙切嵴或后牙牙尖细胞中的PCNA阳性表达减弱. 当内釉上皮细胞分化为前成釉细胞时，仍可表达PCNA，分泌釉基质而成为成釉细胞时，则PCNA不表达；牙乳头间充质细胞分化为成牙本质细胞过程中，PCNA的表达情况与成釉细胞系相似 (Fig 4).
年轻恒牙：根尖部牙髓内可见中等量PCNA阳性细胞.
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成熟恒牙：牙髓内可见少量PCNA阳性细胞.
图 1 钟状早期牙胚内釉上皮细胞呈PCNA 阳性(箭头)或强阳性(三角箭头)，示核抗原
Fig 1 Positive (arrow show) or strong positive (arrow head) staining of PCNA in IEE in early bell stage of dental germ，showing nuclear antigen SP method 1 00×3.3
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图 2 PCNA在帽状期牙胚的表达
Fig 2 Expression of PCNA in cap stage of dental germ SP method 40×3.3
图 3 PCNA在钟状早期牙胚的表达
Fig 3 Expression of PCNA in early bell stage of dental germ SP method 40× 3.3
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图 4 PCNA在钟状晚期(硬组织形成期)牙胚的表达
Fig 4 Expression of PCNA in late bell stage of dental germ SP method 40 ×3.3
Am: ameloblast; IEE: inner enamel epithelium; OEE: outer enamel epith elium; SI: stratum intermedium; SR: stellate reticulum; DL: dental la mina; DP: dental papilla; Od: odontoblast; EM: enamel matrix; DM: dentin matrix.
3 讨论
为确定细胞的增殖情况而检测的细胞周期相关抗原有溴代脱氧尿苷(bromo-deoxyuridine, BrdU)、Ki67和PCNA. PCNA是一种DNA合成必需的DNA聚合酶附属蛋白，在G1晚期和S期合成，免疫组化方法可在G1,S和G2-M期的细胞内均检测到PCNA的存在，故PCNA是一种增殖细胞的内源性标志物，且不被福尔马林固定和石蜡包埋破坏[1-3]. 因此，检测PCNA是一种简便、有效的方法，可用于确定人牙齿发 育过程中的细胞增殖状况.
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我们发现PCNA在人牙齿发育各阶段具有不同的表达模式，即蕾状期、帽状期和钟状期牙胚以及年轻和成熟恒牙的PCNA阳性表达细胞及其分布具有差异. 但可以发现人牙齿发育过程中细胞增殖有一定规律性. 首先，牙胚内存在广泛的细胞增殖. 从蕾状期到钟状期牙胚，牙板、内外釉上皮、牙乳头间充质细胞等皆呈PCNA阳性表达. 其次，牙胚内成釉细胞系和成牙本质细胞系的增殖状态呈现出连续发展过程. 从牙颈部至前牙切嵴或后牙牙尖细胞增殖活性降低. 在钟状晚期，当内釉上皮细胞和牙乳头间充质细胞分化为功能性成釉细胞和成牙本质细胞时，则失去PCNA表达，因为它们是分化终末细胞，不再发生有丝分裂. 而其余部位如牙尖间区、轴面区细胞因仍处于增殖状态，故PCNA表达呈阳性. 这样，牙齿在形成硬组织的同时，体积增大. 另外，年轻恒牙牙根尚未完全形成，根尖部牙髓仍为原始性胚胎组织，处于活跃的增殖分化状态，以利于根尖孔的形成. 而成熟恒牙牙髓中存在细胞增殖和细胞死亡、凋亡等生理过程，故有少量PCNA阳性表达细胞.
目前，有关牙齿发育调控的分子机制尚不十分明确，但可以肯定有许多生物分子(如生长因子、转录因子、细胞膜表面成分和细胞外基质等)参与具体调控过程[4] . 我们确定了人牙齿发育过程中的细胞增殖状况及其规律，为进一步研究这些生物分子 与细胞增殖的关系奠定了基础.
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作者简介：王捍国(1974-)，男(汉族)，重庆市南川县人. 博士生(导师肖明振)，已发表论文1篇. Tel. (029)3376079
王捍国(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
肖明振(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
刘军(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
张进(第四军医大学秦都口腔医学院牙体病科，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Yu CC，Woods AL，Levision DA. The assessment of cellular pro liferation by immunohistochemistry:A review of currently available methods and their applications[J]. Histochem J, 1992; 24(3):121-131.
, 百拇医药
[2] Waseem NH, Lane DP. Monoclonal antibody analysis of the proliferat ing cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nucleolar form[J]. J Cell Sci, 1990; 96(5，Pt1):121-129.
[3] Morris GF, Mathews MB. Regulation of proliferating cell nuclear an tigen during the cell cycle[J]. J Biol Chem, 1989; 264(23):13856-13864.
[4] 野地澄晴. 齿の发生の分子Xカニズム. 齿科基础医学会杂志，1997；39( 3)：189-201., http://www.100md.com