多药耐药基因转导对人造血祖细胞的化疗保护作用
多药耐药基因转导对人造血祖细胞的化疗保护作用
童英 潘凌亚 周生 吴英 毛宁 杨秀玉
关键词：多药耐药基因；转导；人；造血祖细胞；化疗
耐药患者的增加是目前临床治疗恶性肿瘤面临的主要问题。多药耐药基因(mdr1)编码的相对分子质量为170 000的跨膜糖蛋白(P170)，可将多种化疗药物如泰素(Taxol)、阿霉素(Doxorubicin)、长春新碱(VCR)、鬼臼乙叉甙(VP-16)等排出细胞外，从而避免药物对细胞的损害。正常骨髓造血干祖细胞mdr1基因表达水平极低，因而对化疗极其敏感。将mdr1基因导入骨髓造血细胞可避免或减轻肿瘤化疗对骨髓的毒性，从而提高肿瘤治疗效果。本研究旨在探讨将mdr1基因导入人CD34+细胞的转导效率及对造血祖细胞耐受化疗药物的保护作用。
, http://www.100md.com 一、材料与方法
1.包装细胞的建立及病毒上清的制备：用脂质体介导转染法，将含人全长mdr1cDNA的重组逆转录病毒载体SF-mdr1(德国Baum博士赠送),导入双嗜性包装细胞GP-envAM12，用秋水仙素筛选获得抗性克隆。同法转染及筛选获得单嗜性包装细胞GP-E86抗性克隆。在32℃，单、双嗜性包装细胞乒乓感染[1]，用NIH3T3细胞测病毒上清滴度。将包装细胞GP-envAM12培养到80%满瓶，更换培养液，置32℃培养24 h，收集病毒上清，用0.45 μm滤膜过滤后立即使用。
2.人CD34+细胞的分离纯化：取正常足月妊娠之脐血，用淋巴细胞分离液(比重1.077)梯度密度离心分出单个核细胞，再采用单克隆抗体-免疫磁性分离系统分离出CD34+细胞。流式细胞仪测CD34+细胞纯度为80%～87%，抗体为标记了藻红蛋白(PE)的抗CD34单抗。
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3.人CD34+细胞的体外转染：将CD34+细胞按5×104/ml接种于24孔板，每孔1 ml培养体系，为IMDM培养液，其含15%马血清、1×10-4 mol/L 2-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10%牛血清白蛋白及细胞因子rhSCF 50 ng/ml、rhFL 10 ng/ml、rhIL-3 50 ng/ml。 37℃培养48 h，吸去0.5 ml培养液，加入1 ml新鲜收集的病毒上清、上述剂量的3种细胞因子及8 μg/ml protamine，每24小时重复转染1次，连续3次后离心去除培养上清，重加入原培养体系，培养48 h，进行造血祖细胞培养及基因检测。
4.PCR检测mdr1基因在CD34+细胞的整合：首先提取细胞基因组DNA。mdr1PCR鉴定引物为5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG -3′，5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′，扩增产物长度为167 bp。以β-actin为对照，鉴定模板的完整性。PCR扩增反应条件：94℃变性3 min。循环参数：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环后72℃延伸10 min。3%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物。
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5.RT-PCR检测CD34+细胞mdr1 mRNA的表达：采用TRIzol RNA试剂盒提取细胞总RNA，再按RT-PCR试剂盒说明行逆转录及mdr1cDNA PCR扩增，3%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物。
6.CD34+细胞mdr1基因表达产物P170及其功能：用PE标记的抗P170单抗UIC-2标记细胞，然后用流式细胞术(FCM)测试P170阳性率。用罗丹明(Rh-123)排出试验[2]测定P170的功能。
7.造血祖细胞耐药性的检测：收集转基因及未转基因CD34+细胞，用甲基纤维素集落培养法培养集落形成细胞(CFC)。分别加入不同浓度的Taxol、VCR、Doxorubicin、VP-16，每组样品种植3个孔，37℃培养14 d后统计CFC数。
8.PCR检测造血祖细胞集落mdr1基因的整合：提取细胞基因组DNA后，采用[α-32P]dCTP掺入法行PCR扩增， PCR反应条件同前。12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影鉴定反应产物。
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二、结果
1.包装细胞的逆转录病毒滴度：含人全长mdr1 cDNA的产病毒双嗜性包装细胞Gp-envAM12的病毒滴度为1×104 cfu/ml。经与产病毒单嗜性包装细胞GP-E86病毒上清在32℃乒乓感染，GP-envAM12包装细胞病毒滴度上升为1.6×105 cfu/ml。
2.外源mdr1基因在CD34+细胞的整合与表达：以未转基因CD34+细胞为对照组，提取转基因CD34+细胞总DNA及RNA，经PCR、RT-PCR扩增，可检测到mdr1基因整合及表达的特异扩增带。
3.转基因CD34+细胞P170阳性率及其功能：以未转基因CD34+细胞为对照组，FCM测得转基因CD34+细胞P170阳性率为5.7%～19.3%，平均10.5%。Rh-123排出试验显示，转基因组有P170功能活性的细胞为13.5%～15.2%，平均为14.4%。
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4.转基因造血祖细胞对化疗药物的耐受性：在转基因造血祖细胞集落培养体系中，分别加入一定范围浓度的Taxol、VCR、Doxorubicin、VP-16，以未转基因细胞为对照，测试CFC数。未加药组生成的集落数定为100%，检测不同药物在一定范围浓度下形成CFC的相对百分数。结果显示，当Taxol浓度升至7.5 ng/ml、Doxorubicin 150 ng/ml、VCR 10 ng/ml、VP-16 150 ng/ml时，转基因组与未转基因组形成CFC的数目差异有显著性(P<0.01)，对Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16的抗性集落数分别增加了(3.6±2.1)倍、(2.9±0.3)倍、(1.9±0.4)倍和(3.5±0.5)倍。
5.转基因造血祖细胞集落外源mdr1基因整合的阳性率：PCR检测转基因造血祖细胞集落外源mdr1基因整合的阳性率为1/10，耐药转基因造血祖细胞集落的阳性率为3/4。
三、讨论
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近年来有研究表明，为减轻化疗引起的骨髓抑制，采用耐药基因导入造血干祖细胞移植的方案具如下优点：导入耐药基因的造血干祖细胞，可实现在各系造血细胞中的表达，并能耐受重复化疗给药。每次给药还会增强造血细胞的抗性，使实施大剂量化疗成为可能。
转基因治疗的关键是提高基因转导效率。本研究在基因转导中具有如下特点：①使用一种新型逆转录病毒载体SF，该载体以小鼠脾灶形成病毒为增强子，鼠胚胎干细胞病毒为前导，其转导效率高于由Moloney小鼠白血病病毒构建的常规载体[3]。②产病毒的双嗜性包装细胞GP-envAM12抗性克隆，与单嗜性包装细胞GP-E86抗性克隆病毒上清乒乓感染，使包装细胞中原病毒整合的拷贝数增加，GP-envAM12的病毒滴度由1×104 cfu/ml上升为1.6×105 cfu/ml，可基本满足转导人造血细胞的要求。③造血干祖细胞多处于静止期，只有通过增殖性刺激使其进入细胞周期，才有利于逆转录病毒的整合。我们采用细胞因子SCF+FL+IL-3预刺激，用病毒上清转染的方法，将mdr1基因导入人CD34+细胞。以PCR及RT-PCR方法在细胞DNA及RNA水平的检测结果表明，导入的mdr1基因在CD34+细胞基因组中得到整合并表达。mdr1基因转导效率为10%～14%。
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Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16是目前肿瘤化疗中应用较为广泛的药物，在造血祖细胞集落培养体系中分别加入这些化疗药物后，转基因组造血祖细胞对相应药物的抗性CFC集落数与未转基因组相比较明显增加。在一定的药物浓度范围内，对Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16的抗性集落数分别增加(3.6±2.1)倍、(2.9±0.3)倍、(1.9±0.4)倍和(3.5±0.5)倍。上述结果表明，mdr1基因导入人造血祖细胞中并成功表达，增强了细胞对多种相关化疗药物的抗性，为造血祖细胞耐受肿瘤化疗提供了一定程度的保护作用。
基金项目：卫生部科研基金资助项目(96-1-050)
作者单位：童英(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
潘凌亚(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
, http://www.100md.com
杨秀玉(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
周生(军事医学科学院基础医学研究所)
吴英(军事医学科学院基础医学研究所)
毛宁(军事医学科学院基础医学研究所)
参考文献
1.高翠华，徐炎，韦启泽，等.高滴度产病毒PA317细胞的制备及基因转移效率的研究. 基础医学与临床，1996,16:284-287.
2.Hegewisch-Becker S , Hanania EG , Fu S, et al. Transduction of mdr1 into human and mouse hematopoietic progenitor cell: use of rhodamine (Rh123) to determine transduction frequency and in vivo selection. Br J Haematol ,1995,90:876-883.
3.Eckert HG, Stockschlder M, Just U, et al. High-dose multidrug resistance in primary human hematopietic progenitor cells transduced with optimized retroviral vectors. Blood,1996,88:3407-3415., 百拇医药
童英 潘凌亚 周生 吴英 毛宁 杨秀玉
关键词：多药耐药基因；转导；人；造血祖细胞；化疗
耐药患者的增加是目前临床治疗恶性肿瘤面临的主要问题。多药耐药基因(mdr1)编码的相对分子质量为170 000的跨膜糖蛋白(P170)，可将多种化疗药物如泰素(Taxol)、阿霉素(Doxorubicin)、长春新碱(VCR)、鬼臼乙叉甙(VP-16)等排出细胞外，从而避免药物对细胞的损害。正常骨髓造血干祖细胞mdr1基因表达水平极低，因而对化疗极其敏感。将mdr1基因导入骨髓造血细胞可避免或减轻肿瘤化疗对骨髓的毒性，从而提高肿瘤治疗效果。本研究旨在探讨将mdr1基因导入人CD34+细胞的转导效率及对造血祖细胞耐受化疗药物的保护作用。
, http://www.100md.com 一、材料与方法
1.包装细胞的建立及病毒上清的制备：用脂质体介导转染法，将含人全长mdr1cDNA的重组逆转录病毒载体SF-mdr1(德国Baum博士赠送),导入双嗜性包装细胞GP-envAM12，用秋水仙素筛选获得抗性克隆。同法转染及筛选获得单嗜性包装细胞GP-E86抗性克隆。在32℃，单、双嗜性包装细胞乒乓感染[1]，用NIH3T3细胞测病毒上清滴度。将包装细胞GP-envAM12培养到80%满瓶，更换培养液，置32℃培养24 h，收集病毒上清，用0.45 μm滤膜过滤后立即使用。
2.人CD34+细胞的分离纯化：取正常足月妊娠之脐血，用淋巴细胞分离液(比重1.077)梯度密度离心分出单个核细胞，再采用单克隆抗体-免疫磁性分离系统分离出CD34+细胞。流式细胞仪测CD34+细胞纯度为80%～87%，抗体为标记了藻红蛋白(PE)的抗CD34单抗。
, 百拇医药
3.人CD34+细胞的体外转染：将CD34+细胞按5×104/ml接种于24孔板，每孔1 ml培养体系，为IMDM培养液，其含15%马血清、1×10-4 mol/L 2-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10%牛血清白蛋白及细胞因子rhSCF 50 ng/ml、rhFL 10 ng/ml、rhIL-3 50 ng/ml。 37℃培养48 h，吸去0.5 ml培养液，加入1 ml新鲜收集的病毒上清、上述剂量的3种细胞因子及8 μg/ml protamine，每24小时重复转染1次，连续3次后离心去除培养上清，重加入原培养体系，培养48 h，进行造血祖细胞培养及基因检测。
4.PCR检测mdr1基因在CD34+细胞的整合：首先提取细胞基因组DNA。mdr1PCR鉴定引物为5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG -3′，5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′，扩增产物长度为167 bp。以β-actin为对照，鉴定模板的完整性。PCR扩增反应条件：94℃变性3 min。循环参数：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环后72℃延伸10 min。3%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物。
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5.RT-PCR检测CD34+细胞mdr1 mRNA的表达：采用TRIzol RNA试剂盒提取细胞总RNA，再按RT-PCR试剂盒说明行逆转录及mdr1cDNA PCR扩增，3%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物。
6.CD34+细胞mdr1基因表达产物P170及其功能：用PE标记的抗P170单抗UIC-2标记细胞，然后用流式细胞术(FCM)测试P170阳性率。用罗丹明(Rh-123)排出试验[2]测定P170的功能。
7.造血祖细胞耐药性的检测：收集转基因及未转基因CD34+细胞，用甲基纤维素集落培养法培养集落形成细胞(CFC)。分别加入不同浓度的Taxol、VCR、Doxorubicin、VP-16，每组样品种植3个孔，37℃培养14 d后统计CFC数。
8.PCR检测造血祖细胞集落mdr1基因的整合：提取细胞基因组DNA后，采用[α-32P]dCTP掺入法行PCR扩增， PCR反应条件同前。12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影鉴定反应产物。
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二、结果
1.包装细胞的逆转录病毒滴度：含人全长mdr1 cDNA的产病毒双嗜性包装细胞Gp-envAM12的病毒滴度为1×104 cfu/ml。经与产病毒单嗜性包装细胞GP-E86病毒上清在32℃乒乓感染，GP-envAM12包装细胞病毒滴度上升为1.6×105 cfu/ml。
2.外源mdr1基因在CD34+细胞的整合与表达：以未转基因CD34+细胞为对照组，提取转基因CD34+细胞总DNA及RNA，经PCR、RT-PCR扩增，可检测到mdr1基因整合及表达的特异扩增带。
3.转基因CD34+细胞P170阳性率及其功能：以未转基因CD34+细胞为对照组，FCM测得转基因CD34+细胞P170阳性率为5.7%～19.3%，平均10.5%。Rh-123排出试验显示，转基因组有P170功能活性的细胞为13.5%～15.2%，平均为14.4%。
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4.转基因造血祖细胞对化疗药物的耐受性：在转基因造血祖细胞集落培养体系中，分别加入一定范围浓度的Taxol、VCR、Doxorubicin、VP-16，以未转基因细胞为对照，测试CFC数。未加药组生成的集落数定为100%，检测不同药物在一定范围浓度下形成CFC的相对百分数。结果显示，当Taxol浓度升至7.5 ng/ml、Doxorubicin 150 ng/ml、VCR 10 ng/ml、VP-16 150 ng/ml时，转基因组与未转基因组形成CFC的数目差异有显著性(P<0.01)，对Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16的抗性集落数分别增加了(3.6±2.1)倍、(2.9±0.3)倍、(1.9±0.4)倍和(3.5±0.5)倍。
5.转基因造血祖细胞集落外源mdr1基因整合的阳性率：PCR检测转基因造血祖细胞集落外源mdr1基因整合的阳性率为1/10，耐药转基因造血祖细胞集落的阳性率为3/4。
三、讨论
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近年来有研究表明，为减轻化疗引起的骨髓抑制，采用耐药基因导入造血干祖细胞移植的方案具如下优点：导入耐药基因的造血干祖细胞，可实现在各系造血细胞中的表达，并能耐受重复化疗给药。每次给药还会增强造血细胞的抗性，使实施大剂量化疗成为可能。
转基因治疗的关键是提高基因转导效率。本研究在基因转导中具有如下特点：①使用一种新型逆转录病毒载体SF，该载体以小鼠脾灶形成病毒为增强子，鼠胚胎干细胞病毒为前导，其转导效率高于由Moloney小鼠白血病病毒构建的常规载体[3]。②产病毒的双嗜性包装细胞GP-envAM12抗性克隆，与单嗜性包装细胞GP-E86抗性克隆病毒上清乒乓感染，使包装细胞中原病毒整合的拷贝数增加，GP-envAM12的病毒滴度由1×104 cfu/ml上升为1.6×105 cfu/ml，可基本满足转导人造血细胞的要求。③造血干祖细胞多处于静止期，只有通过增殖性刺激使其进入细胞周期，才有利于逆转录病毒的整合。我们采用细胞因子SCF+FL+IL-3预刺激，用病毒上清转染的方法，将mdr1基因导入人CD34+细胞。以PCR及RT-PCR方法在细胞DNA及RNA水平的检测结果表明，导入的mdr1基因在CD34+细胞基因组中得到整合并表达。mdr1基因转导效率为10%～14%。
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Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16是目前肿瘤化疗中应用较为广泛的药物，在造血祖细胞集落培养体系中分别加入这些化疗药物后，转基因组造血祖细胞对相应药物的抗性CFC集落数与未转基因组相比较明显增加。在一定的药物浓度范围内，对Taxol、Doxorubicin、VCR、VP-16的抗性集落数分别增加(3.6±2.1)倍、(2.9±0.3)倍、(1.9±0.4)倍和(3.5±0.5)倍。上述结果表明，mdr1基因导入人造血祖细胞中并成功表达，增强了细胞对多种相关化疗药物的抗性，为造血祖细胞耐受肿瘤化疗提供了一定程度的保护作用。
基金项目：卫生部科研基金资助项目(96-1-050)
作者单位：童英(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
潘凌亚(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
, http://www.100md.com
杨秀玉(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
周生(军事医学科学院基础医学研究所)
吴英(军事医学科学院基础医学研究所)
毛宁(军事医学科学院基础医学研究所)
参考文献
1.高翠华，徐炎，韦启泽，等.高滴度产病毒PA317细胞的制备及基因转移效率的研究. 基础医学与临床，1996,16:284-287.
2.Hegewisch-Becker S , Hanania EG , Fu S, et al. Transduction of mdr1 into human and mouse hematopoietic progenitor cell: use of rhodamine (Rh123) to determine transduction frequency and in vivo selection. Br J Haematol ,1995,90:876-883.
3.Eckert HG, Stockschlder M, Just U, et al. High-dose multidrug resistance in primary human hematopietic progenitor cells transduced with optimized retroviral vectors. Blood,1996,88:3407-3415., 百拇医药