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编号:10500053
颈动脉体化学感受性在pH降低时的传递机制
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2000年第10期
     作者:庄甲举 高贞 刘景东 居桂平 勾凌燕

    单位:解放军白求恩军医学院科研中心, 河北 石家庄 050081

    关键词:胆碱能受体;乙酰胆碱;颈动脉体化学感受器;单位放电;pH降低

    第四军医大学学报001016 摘 要: 目的 探讨胆碱能机制在pH降低时颈动脉体(CB)功能活动变化中的作用. 方法 在离体灌流条件下, 记录颈动脉窦神经(CSN)传入纤维的化学感受性单位放电. 结果 乙酰胆碱(ACh)抑制单位放电(n=16, P<0.05),阿托品阻断ACh的作用; 尼古丁呈剂量依赖性增加单位放电 (n=10,r=0.94, P<0.01); 箭毒可阻断尼古丁的作用, 对自发放电无显著影响;尼古丁并不增加化学感受性单位对pH降低的放电反应(n=19);pH降低时筒箭毒对化学感受性单位放电变化无显著影响(n=17);硝苯吡啶(5 mmol.L-1)对自发的基础单位放电(n=8)和刺激诱导的电活动(n=9)均无明显影响. 结论 胆碱能机制与pH降低时CB化学感受性功能活动的改变无直接关系.
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    中图号:R332.3 文献标识码:A

    文章编号:1000-2790(2000)10-121-04

    Mechanisms of rabbit carotid body chemosensory transduction during low pH

    ZHUANG Jia-Ju, GAO Zhen, LIU Jing-Dong, JU Gui-Ping,GOU Ling-Yan

    (Center of Scientific Research, Bethune Military Medical College of Chinese PLA, Shijiazhuang,050081, China)

    Abstract: AIM To elucidate the physiological significance of N-cholinergic receptor in CB chemosensory processes under low pH conditions. METHODS The unit discharges of carotid chemosensory afferent fibers were recorded in the in vitro carotid body (CB)-sinus nerve preparations from 41 rabbits (n=86 ). RESULTS Exogenous ACh (20 mg.L-1) inhibited unit discharges recorded on sinus nerve (n=16, P<0.05), while atropine only blocked the effect of ACh; Addition of nicotine in the different concentrations led to dose-dependent increases (r=0.94, P<0.01, n=10). Nicotinic stimulation was antagonized by D-tubocurarine but the basal discharge was not significantly affected. Superfusion of the CB with acid solution increased the discharge from (0.95±0.34) to (1.84±0.55) imp.s-1 (n=19). After the addition of 5 mg.L-1 nicotine to acidic perfusate, the unit discharge still showed an increase from (0.96±0.25) to (1.53±0.24) imp.s-1 (P<0.05), but nicotine did not augment the discharge response of the units to acidification; D-tubocurarine did not alter the action of acid solution on chemosensory discharge (n=17); Nifedipine (5 mmol.L-1) did not significantly affect both of the spontaneous basal discharge (n=8) and acid-evoked electric activity (n=9). CONCLUSION The present results suggest that ACh might act only as a physiological modulator on carotid chemosensory activity without direct involvement in cholinergic mechanisms as done by low pH perfusion of CB.
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    Keywords:cholinergic receptors; acetylecholine; carotid body chemoreceptor; unit discharge; low pH

    0 引言

    颈动脉体(CB)化学感受性功能活动的机制至今仍未完全阐明. 早期认为,乙酰胆碱(ACh)是一种兴奋性递质,经M-型胆碱能受体介导CB的化学感受性功能[1]. 但后继研究结果表明,ACh对不同种属动物,或处于不同功能状态下CB的机能活动可产生不同影响[1,2]. 据报道,pH和PO2降低以及PCO2增高,可能通过胆碱能机制使猫和家兔CB的儿茶酚胺(CA)合成和释放增加,同时伴有颈动脉窦神经(CSN)电活动增加[3-5]. Eyzaguirre等[6]也观察到, 阿托品抑制pH降低对猫CB的刺激作用. 而Ponte等[7]在猫和家兔的研究表明,ACh和DA拮抗剂并不能消除CB化学感受器对低氧的反应. 在大鼠颈动脉体球细胞的研究中,Dasso等[8]发现, 胆碱能受体介导感受器细胞内钙离子浓度升高, 从而调节其化学感受性功能[8]. 我们在离体灌流条件下, 以CSN传入纤维的化学感受性单位放电为指标,探讨在pH降低时胆碱能机制在CB功能活动方面的生理意义.
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    1 材料和方法

    1.1 材料 动物:大耳白家兔41只,雌雄不拘,体质量2~3 kg. 药品: ACh(军事医学科学院), 尼古丁(Sigma公司), 筒箭毒(England). 仪器:双线示波器(VC-10), 刺激器(SEN-3201), 血气分析仪(ABL-30).

    1.2 方法 250 g*L-1氨基甲酸乙酯(1.0 g*kg-1) iv麻醉动物后,颈部切口进行气管插管,暴露双侧颈动脉窦区,辨认CSN. 在解剖显微镜下仔细分离神经, 游离颈动脉窦区和CSN. 在尽量靠近舌咽神经处剪断CSN. 然后将CB连同CSN一起摘出. 浸浴于1000 mL*L-1纯氧平衡的改良Locke氏溶液中,在0~4℃条件下存放30 min以上备用. 将CB-CSN标本放入灌流槽中,用充以950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2 的改良Locke氏溶液( NaCl 112 mmol*L-1, KCl 4.69 mmol*L-1, CaCl2 2.16 mmol*L-1, MgCl2 1.05 mmol*L-1, Na-glutamate 42 mmol*L-1, Glucose 5.5 mmol*L-1, HEPES 5 mmol*L-1 )作为对照灌流(1 mL*min-1). 将电子测温探头贴紧CB,监测灌流液温度. 液温维持在(36.5±0.1)℃, pH保持在7.35~7.45. 将CSN搭在浸于36℃~37℃温石蜡油内的双极铂电极上. 在解剖显微镜下仔细分离出神经细束, 记录CSN的传入单位放电. 电信号经生物电放大器输入双线示波器观察,并用连续照相机(PC-2A)摄影. 电信号同时由示波器输入刺激器,触发信号经Apple-Ⅱ处理, 打印放电频率变化的结果. 以灌流液pH降低时传入单位放电频率增加,作为化学感受性单位的判定标准. 每次实验前新配制药液:①在灌流槽“上游”的加药槽滴加药液(<25 μL*次-1), 或将药物加入灌流液配制所需的浓度灌流一定时间; ②用1 mol*L-1 HCl 将灌流液的pH 调至(6.70±0.21)灌流CB,摸拟在体内pH变化的“自然”刺激. 实验过程中给药或“自然”刺激的间隔大于15 min.
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    统计学处理: 实验结果以(±S)表示,并进行配对t检验.

    2 结果

    2.1 ACh和尼古丁对化学感受性单位自发放电的作用 在8只动物的CB-CSN标本记录16个自发放电频率为(1.26±0.31) imp*s-1的单位. 在灌流液内加入ACh(20 mg*L-1)后,除1个单位外,其余的放电频率均减少(P<0.05,Fig 1). ACh的作用在加药20 s后出现,约2 min达到高峰,持续约3 min. 即便加大ACh的剂量,也不能完全阻断CSN的自发放电. 阿托品(10 mg*L-1)拮抗ACh的效应,但对自发放电没有明显的影响. 尼古丁(5 mg*L-1)增加CSN的自发放电(Fig 1),D-筒箭毒(1 mg*L-1)可抑制尼古丁的作用,但对自发放电无明显的影响. 在7例动物的CB-CSN标本记录到10个化学感受性单位. 向灌流内分别加入不同剂量(1,3,6,10,和15 mg*L-1)的尼古丁后,放电频率由(0.60±0.21)分别增加到(0.96±0.21),(1.19±0.30),(1.24±0.29),(1.48±0.41)和(1.82±0.39) imp*s-1,呈明显的剂量依赖性(r=0.94,P<0.01).
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    图 1 胆碱能受体激动剂和拮抗剂对化学感受器自发放电的影响

    Fig 1 Effects of cholinergic agonist and antagonist on the spontaneous unit discharge of CSN

    aP<0.05 vs control. imp: impulse.

    2.2 尼古丁对灌流液pH降低时化学感受性单位放电的影响 灌流液pH降低时,所有单位(n=69)的放电频率由(0.86±0.21)增至(1.75±0.40) imp*s-1;但各化学感受性单位对pH变化的敏感性不一,有些单位在 pH降至7.3~7.2时放电即明显增加,另有一些单位则在pH低于6.5以下时放电才增加. 在9只动物的CB-CSN标本记录到19个自发放电为(0.95±0.34) imp*s-1的单位,用pH低的Locke氏液灌流CB时,放电频率增加(P<0.01);在灌流液内加入尼古丁(5 mg*L-1) 后,放电与对照比仍增加(P<0.05);但与单纯用酸性液灌流时相比,放电频率增加的幅度减小(P<0.05, 单侧t检验,Fig 2).
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    2.3 D-筒箭毒对灌流液pH降低时化学感受性单位放电的影响 在8只动物的CB-CSN标本记录到17个化学感受性单位,自发放电频率为(1.08±0.33) imp*s-1,以pH低的Locke氏液灌流后放电频率增加(P<0.05). 在酸性灌流液内加入D-筒箭毒后,放电频率与对照灌流比明显增加(P<0.05);与只用酸性液灌流时放电频率的变化相比,无显著性差异(Fig 2,3).

    图 2 尼古丁和筒箭毒对pH降低时CSN单位放电的影响

    Fig 2 Effects of nicotine and D-tubocurarine on the unit discharge of CSN during low pH

    aP<0.05 vs control,bP<0.01 vs control,cP<0.05 vs low pH. imp: impulse.
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    图 3 筒箭毒对pH降低时CSN单位放电变化的影响

    Fig 3 Effects of D-tubocurarine on the unit discharge of CSN during low pH

    a, c: control; b: low pH; d: low pH+tubocurarine.

    2.4 硝苯吡啶对灌流液pH降低时化学感受性单位放电的影响 在9只动物的CB-CSN标本,向灌流液内加入硝苯吡啶(5 mmol*L-1)后, 8个自发放电频率为(0.87±0.29)imp*s-1化学感受性单位的放电无明显改变; 以pH低的溶液灌流后,9个单位放电由(0.79±0.20) imp*s-1增至(1.35±0.31) imp*s-1 (P<0.05);在酸性灌流液内加入硝苯吡啶后,放电由(0.91±0.30) imp*s-1增至(1.53±0.35) imp*s-1,与对照灌流组相比仍明显增加(P<0.05), 与仅用酸性液灌流时比较无显著性差异.
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    3 讨论

    根据我们的观察,灌流液pH降低虽导致CSN化学感受性单位放电增加,但各单位对pH降低的敏感性不同. 究其可能的原因:①与球细胞所处的部位有关,位于CB深部的球细胞可能受环境因素变化影响较小,只有pH降至一定程度时与其相对应的CSN传入单位才出现反应;②化学感受器细胞存在着不同功能类型,它们对刺激的敏感性不一致,一部分细胞对刺激易产生反应,而另一部分则不然. 尼古丁呈剂量依赖性地增加化学感受性单位的放电频率,筒箭毒则可拮抗尼古丁的作用,提示尼古丁的作用由N-受体所介导. 在灌流液pH降低的条件下加入尼古丁,并不增强化学感受性单位对酸刺激的反应;而且,在酸性灌流液中加入筒箭毒后,CSN的放电变化与单纯用酸性液灌流时无显著差异. Dinger等[9,10]报道,pH降低和尼古丁可分别刺激猫和家兔CB释放CA并增加CSN的放电频率. 而我们的结果则提示,在酸刺激时 N-型胆碱能受体与家兔CSN放电增加的变化没有直接关系. 研究证实在CSN的末梢几乎缺乏ACh受体,而CB的ACh结合位点主要位于球细胞膜上[9,10]. ACh抑制CB自发放电、阿托品对自发放电无显著影响的结果, 似也提示M-型胆碱能受体不可能直接介导CB的化学感受性功能. 何以尼古丁可增加CSN化学感受性单位的自发放电,而不协同其对酸刺激的反应? 胆碱能拮抗剂可对抗外源性ACh和尼古丁的作用,对CB自发的和刺激诱导的化学感受性放电则无影响?其原因可能有:①与受体的类型和CB的反应性有关. McQueen曾报道,N-受体拮抗剂增强CB对氰化钠的反应. 提出,N-型胆碱能受体可能有兴奋性和抑制性的之分,或者存在着非M-、非N-型的混合型胆碱能受体[1]. 在不同状态下可能以某一种受体亚型的作用为主. 前述Dinger等[10]报道的尼古丁的作用,是CB处于基础状态下的实验结果. 酸性环境可能影响了CB受体的反应性,致使尼古丁产生了与CB处于稳定状态时的不同作用. ②外源性物质与内源性物质相互作用. “ 自然”刺激时球细胞可能释放包括神经肽在内的数种物质,然后与外源性尼古丁对化学感受器复合体的影响相互作用,致使外源性物质表现不出相对基础状态下CB同样的作用. Dinger报道M-受体可调节N-受体的兴奋作用[9]. 刺激诱导释放的内源性ACh也可能通过自身受体削弱外源性激动剂的作用. ③pH降低时CSN放电的增加可能经非胆碱机制所介导. Docherty等[11]报道,阿托品和美加明不影响氰化物对家兔CB的作用. 本实验硝苯吡啶既不影响化学感受性单位的自发放电, 也不影响pH降低诱导的放电变化的结果似也提示,家兔CB球细胞内Ca2+可能不受胆碱能机制影响的可能性[8]. 本实验尚难确切地解释其机制.
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    本研究结果显示,pH降低时家兔CB化学感受性功能活动的改变与胆碱能受体可能没有直接关系. 结合以往的研究,提示pH降低可能通过与缺氧不同的机制产生作用[12,13].

    作者简介:庄甲举(1952-),男(汉族),江苏省邳州市人. 副教授. Tel.(0311)3035926 现在美国cleveland大学访问学者

    参考文献:

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    收稿日期:1999-12-05; 修回日期:2000-02-27, 百拇医药